楊 麗,張侃迪,張俊峰

心血管疾病是全球死亡的主要原因,2017年導(dǎo)致1 700多萬人死亡,其中冠心病是常見的死亡原因。在我國,冠心病是人類死亡的主要威脅,與西方國家冠心病發(fā)病率相比,我國的發(fā)病率較低[1]。然而,由于龐大的人口基數(shù),2016年我國報(bào)告的冠心病病例約為2 300萬例。糖尿病是一種以血糖、血脂顯著升高為特征的糖脂代謝紊亂,心血管疾病并糖尿病病人更容易受到心血管疾病的影響。此外,糖尿病病人的心血管病死亡率明顯高于非糖尿病病人,為2～3倍[2]。糖尿病病人心臟結(jié)構(gòu)和功能異常,易受心肌缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury,IRI)的影響[3]。在心肌缺血再灌注損傷中,盡管血流再灌注恢復(fù),但缺血心臟損傷不可逆,這種損傷往往引起心肌細(xì)胞的壞死和凋亡,線粒體功能障礙,從而導(dǎo)致長期預(yù)后不良,甚至死亡[4];有證據(jù)表明,糖尿病心臟表現(xiàn)出對心臟保護(hù)治療的抵抗[5],因此,與非糖尿病病人相比,糖尿病可使心肌IRI加重。然而,目前缺乏針對糖尿病病人心肌IRI的有效治療。柚皮苷(Naringin,Nar)主要是從柚子和橙子中提取的一種天然類黃酮苷[6]。研究發(fā)現(xiàn)其能夠通過抗氧化、抑制細(xì)胞凋亡等機(jī)制對心肌缺血再灌注有抑制作用[7]。柚皮苷對心肌IRI的作用可見報(bào)道[8-9],而關(guān)于柚皮苷對糖尿病心肌缺血再灌注的研究報(bào)道較少。本研究旨在研究柚皮苷對糖尿病大鼠心肌IRI氧化應(yīng)激和凋亡的影響,并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SD大鼠24只,體質(zhì)量200～250 g,購于上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,生產(chǎn)許可證號:SCXK(滬)2018-0004。飼養(yǎng)于上海市第九人民醫(yī)院動(dòng)物房,本研究經(jīng)本院動(dòng)物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.2 試劑與儀器

柚皮苷購自上海同田生物技術(shù)有限公司;超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)試劑盒購于上海碧云天生物科技有限公司;原位末端標(biāo)記測定法(TUNEL)試劑盒和蛋白酶K購自Servicebio公司;二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑購自DAKO。鼠抗B細(xì)胞淋巴瘤/白血病2(Bcl-2)、Bax單克隆抗體購自Santa公司;Bcl-2、Bax兔抗鼠二抗購自Santa公司;蛋白酶K購自Roche公司;脫水機(jī)(武漢俊杰電子有限公司);病理切片機(jī)(上海徠卡儀器有限公司);烤箱(上海?，攲?shí)驗(yàn)儀器有限公司);渦旋混合器(Servicebio);顯微鏡(CIC)。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病大鼠模型的構(gòu)建

糖尿病模型制備方法:SD大鼠禁食12 h,經(jīng)腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)60 mg/kg。每日上午抽取禁食12 h的SD大鼠尾靜脈血進(jìn)行血糖檢測,直到血糖持續(xù)7 d高于16.7 mmol/L,表明糖尿病大鼠模型成功建立。糖尿病鼠自由飲水,單籠普食飼養(yǎng),飼養(yǎng)2周后制備心肌IRI模型。

1.2.2 大鼠心肌IRI模型

參照文獻(xiàn)[7]建立大鼠心肌IRI模型。大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉。隨后在左側(cè)第3肋與第4肋間隙行開胸和心包切開術(shù)。在左心耳下方1～2 mm處,用5-0絲線在左冠狀動(dòng)脈前降支下穿線,將縫線兩端穿過硅膠管,左前降支(LAD)阻斷30 min,再灌注3 h。模型成功的標(biāo)準(zhǔn):結(jié)扎線以下心肌組織發(fā)紺,再灌注后心肌局部反應(yīng)性充血。

1.2.3 動(dòng)物分組

將24只大鼠隨機(jī)分為對照組(control組)、糖尿病缺血再灌注損傷組(D-IRI組)、柚皮苷低劑量+糖尿病缺血再灌注損傷組(L-Nar+D-IRI組)、柚皮苷高劑量+糖尿病缺血再灌注損傷組(H-Nar+D-IRI組),每組6只。除control組,其余各組按上述方法制備大鼠糖尿病心肌IRI模型。參照文獻(xiàn)[7]方法制備,L-Nar+D-IRI組再灌注結(jié)束后應(yīng)用柚皮苷10 mg/(kg·d)灌胃干預(yù)1周;H-Nar+D-IRI組再灌注結(jié)束后應(yīng)用柚皮苷100 mg/(kg·d)灌胃干預(yù)1周,control組和D-IRI組使用等量生理鹽水。

1.2.4 樣本采集

1周后,處死大鼠,取左心室。將大鼠左心室分為5部分,一部分心肌組織用于SOD和MDA的檢測;一部分行HE染色;一部分心肌行氯化三苯基四氮唑(TTC)染色,剩余的兩部分心肌組織迅速放于液氮中,之后放于-80 ℃冰箱中保存,行心肌TUNEL檢測及蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western Blot)檢測。

1.2.5 氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測

取一部分左心室心肌組織,應(yīng)用預(yù)冷的生理鹽水制成10%的勻漿液,4 ℃離心,取上清液,參照SOD和MDA試劑盒的說明書,對大鼠左心室心肌組織進(jìn)行檢測。

1.2.6 心肌梗死面積計(jì)算

將左心室組織,一次切薄片2片,每片厚度是3～4 mm,放入1%TTC中。隨后37 ℃恒溫箱20 min,使用純化水充分沖洗。左心室梗死區(qū)的顏色呈現(xiàn)灰白色。Image J測量并統(tǒng)計(jì)梗死心肌的面積與全部左心室面積的百分比,取平均值。

1.2.7 HE染色觀察大鼠心肌組織病理變化

心肌組織經(jīng)過梯度乙醇脫水,之后應(yīng)用石蠟包埋,切片(5 μm),最后應(yīng)用HE染色。

1.2.8 Western Blot檢測Bcl-2、Bax

將左心室組織行勻漿、高速離心,測定并且調(diào)整蛋白的濃度,103 ℃金屬浴5 min,每孔上樣20 μL,電泳,轉(zhuǎn)膜,本實(shí)驗(yàn)為半干式轉(zhuǎn)膜,25 V轉(zhuǎn)膜30 min。5%牛血清白蛋白(BSA)室溫環(huán)境下進(jìn)行封閉1 h。稀釋的相應(yīng)一抗4 ℃孵育過夜。應(yīng)用TBST洗膜3次,每次5 min。隨后稀釋過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗,比例為1∶5 000。37 ℃溫度下,與膜孵育1 h。加增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光(ECL)發(fā)光液,避光5 min。最后在暗室環(huán)境下使用X膠片進(jìn)行感光、顯影、定影。

1.2.9 TUNEL法檢測大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡

取出保存在-80 ℃冰箱中的大鼠心肌組織行TUNEL檢測,方法按照TUNEL試劑盒說明書進(jìn)行。每個(gè)標(biāo)本取8個(gè)高倍鏡(×400)視野內(nèi),計(jì)算凋亡細(xì)胞數(shù)與所有細(xì)胞的百分比。設(shè)2名觀察者,分別進(jìn)行讀片,計(jì)算平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組心肌組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)比較

control組心肌組織SOD值最高,為(142.60±9.29)U/mg;D-IRI組心肌組織SOD最低,為(80.44±4.55)U/mg,低于control組(P<0.05);L-Nar+D-IRI組心肌組織SOD為(92.18±2.65)U/mg,高于D-IRI組(P<0.05);H-Nar+D-IRI心肌組織SOD為(119.80±6.98)U/mg,高于L-Nar+D-IRI組(P<0.05)。control組心肌組織MDA最低,為(3.43±0.57)nmol/mg,D-IRI組心肌組織MDA最高,為(7.88±0.69)nmol/mg,高于control組(P<0.05);L-Nar+D-IRI組心肌組織MDA為(6.72±0.65)nmol/mg,低于D-IRI組(P<0.05);H-Nar+D-IRI組心肌組織MDA為(5.41±0.64)nmol/mg,低于L-Nar+D-IRI組(P<0.05)。詳見表1及圖1、圖2。

圖1 各組大鼠心肌組織SOD水平柱狀圖

圖2 各組大鼠心肌組織MDA水平柱狀圖

表1 各組大鼠心肌組織SOD、MDA及心肌梗死變化

2.2 各組大鼠心肌梗死面積比較

D-IRI組、L-Nar+D-IRI組及H-Nar+D-IRI組均可見心肌梗死組織,其中D-IRI組梗死面積最大,H-Nar+D-IRI組梗死面積最小,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1及圖3、圖4。

圖3 TTC染色觀察各組大鼠心肌組織梗死變化

圖4 各組大鼠心肌梗死面積柱狀圖

2.3 各組大鼠心肌組織的病理變化

control組心肌細(xì)胞排列規(guī)則,肌絲完整,細(xì)胞間隙緊密、均勻。D-IRI組心肌組織水腫明顯,排列不規(guī)則,肌絲不完整,細(xì)胞間隙增大,不均勻。L-Nar+D-IRI組心肌組織水腫,排列尚規(guī)則,肌絲尚完整,細(xì)胞間隙增大,不均勻,較D-IRI組輕。H-Nar+D-IRI組心肌組織稍水腫,排列規(guī)則,肌絲尚完整,細(xì)胞間隙增大,尚均勻,較L-Nar+D-IRI組輕。詳見圖5。

圖5 各組大鼠心肌組織損傷情況(HE染色,×200)

2.4 各組大鼠心肌組織Bax、Bcl-2的變化比較

各組大鼠心肌組織均可見Bcl-2和Bax蛋白表達(dá),D-IRI組Bax蛋白表達(dá)最高,L-Nar+D-IRI其次,高于H-Nar+D-IRI組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。D-IRI組Bcl-2表達(dá)最低,L-Nar+D-IRI其次,H-Nar+D-IRI組Bcl-2表達(dá)高于L-Nar+ D-IRI組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表2、圖6。

圖6 各組大鼠心肌Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的變化

表2 各組大鼠心肌組織Bax、Bcl-2的變化比較

2.5 各組大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡變化

TUNEL染色陽性細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞核被染成棕黃色。control組心肌細(xì)胞凋亡率為(7.54±1.43)%,D-IRI組心肌細(xì)胞凋亡率為(34.88±4.89)%,高于control組(P<0.05)。L-Nar+D-IRI組心肌細(xì)胞凋亡率為(28.55±3.06)%,低于D-IRI組(P<0.05)。H-Nar+D-IRI組心肌細(xì)胞凋亡率為(19.34±3.12)%,低于L-Nar+D-IRI組(P<0.05)。詳見圖7、圖8。

圖7 TUNEL檢測各組大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡的變化(箭頭所指為凋亡細(xì)胞,×400)

圖8 各組大鼠心肌組織凋亡率比較

3 討 論

持續(xù)高血糖不僅能誘發(fā)心血管缺血損傷,而且會加重該損傷。因此,尋找新的干預(yù)措施,減少糖尿病狀態(tài)下心臟IRI具有重要的臨床和現(xiàn)實(shí)意義。本研究建立糖尿病大鼠心肌IRI手術(shù)模型,應(yīng)用柚皮苷可通過降低氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡改善糖尿病大鼠心肌IRI。

心肌IRI是多因素共同作用的結(jié)果,其中氧化應(yīng)激是細(xì)胞損傷的主導(dǎo)和直接驅(qū)動(dòng)因素之一[10]。在氧化應(yīng)激過程中,可以觀察到自由基和活性氧(ROS)之間的失衡,并對機(jī)體造成不利影響。柚皮苷具有抗氧化的作用[11]。應(yīng)用柚皮苷治療后降低了糖尿病大鼠心肌IRI氧化應(yīng)激因子MDA的表達(dá),在心肌IRI中,氧自由基的產(chǎn)生是直接原因。這是因?yàn)檠踝杂苫善茐男募〖?xì)胞膜,使心肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞,從而產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物。MDA可作為反映氧自由基含量和脂質(zhì)過氧化的主要指標(biāo),SOD是機(jī)體抵抗脂質(zhì)過氧化能力的重要指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示,柚皮苷治療可降低糖尿病大鼠IRI心肌組織的MDA水平,提高SOD水平,從而改善心肌損傷。Rajadurai等[12]證明柚皮苷通過增加心肌的抗氧化能力抑制心肌梗死。Li等[13]也報(bào)道了類似的結(jié)果,發(fā)現(xiàn)柚皮苷可以通過磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)通路抑制腫瘤壞死因子-α(TNF-α)誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。Sun等[14]發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT信號通路可激活內(nèi)皮型一氧化氮合酶通路,增強(qiáng)心肌細(xì)胞抗IRI的抗氧化能力。以上結(jié)果與本研究結(jié)果一致。

凋亡,也被稱為程序性細(xì)胞死亡,是一種活性基因調(diào)控的細(xì)胞死亡形式。細(xì)胞凋亡是引起心肌損傷的重要因素,決定心肌梗死面積,促進(jìn)心肌重構(gòu)[15],細(xì)胞凋亡可引起心肌收縮功能的降低,從而導(dǎo)致心泵功能下降[16],凋亡是心肌IRI的一個(gè)重要因素[17]。心肌恢復(fù)血液灌注后可使心肌細(xì)胞凋亡加重,因此,降低細(xì)胞凋亡可減輕IRI引起的心肌損傷,減少心肌梗死,抑制心肌梗死的發(fā)生。研究表明,心肌細(xì)胞凋亡是IRI病理生理過程中的關(guān)鍵部分[18]。糖尿病心肌IRI常發(fā)生細(xì)胞凋亡。Rani等[19]研究表明,柚皮苷通過上調(diào)Bcl-2的表達(dá),下調(diào)Bax的表達(dá),降低了TUNEL的陽性表達(dá),減輕心肌IRI。本研究結(jié)果表明,表明柚皮苷治療可降低缺血再灌注后糖尿病大鼠心肌組織中Bax的表達(dá),增加Bcl-2的表達(dá),表明柚皮苷治療對缺血再灌注下糖尿病心肌細(xì)胞凋亡有抑制作用,從而對心肌組織發(fā)揮保護(hù)作用,與上述研究結(jié)果一致。

本研究應(yīng)用糖尿病大鼠心肌IRI模型,柚皮苷通過抗氧化應(yīng)激和抗凋亡改善糖尿病大鼠心肌梗死面積,從而發(fā)揮心肌保護(hù)作用,有望為臨床應(yīng)用柚皮苷治療心肌IRI提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。