杜漢廷，林松毅，李冬梅，葛 麒，陳冬

（大連工業(yè)大學食品學院 國家海洋食品工程技術研究中心 遼寧大連 116034）

松茸（Tricholoma matsutake Singer）是一種純天然珍貴稀有的藥食兩用真菌，享有“菌中之王”的美譽[1]，在我國主要分布于吉林、云南以及川藏地區(qū)等。松茸營養(yǎng)豐富，化學成分組成復雜，含有多糖、蛋白質、氨基酸、多肽、甾類、萜類、油脂以及多酚和維生素等物質，其多種營養(yǎng)成分被廣泛應用于藥品、保健品及化妝品領域[2]。已有研究證實，松茸中的生物活性組分具有抗癌、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化，降低膽固醇的能力[3]。

免疫穩(wěn)態(tài)平衡對維持機體健康狀況具有至關重要的作用。當機體受到外來污染物和內部壞死、突變細胞的感染、侵害時，機體將通過免疫系統(tǒng)中的細胞與器官的協(xié)同作用以及免疫反應來維持身體健康的體內穩(wěn)態(tài)平衡[4-5]。然而，情緒、工作壓力和化療等諸多因素會破壞這種平衡，進而導致免疫紊亂，引發(fā)免疫相關疾病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風濕關節(jié)炎、糖尿病、癌癥以及肥胖等[6]。目前臨床上，常使用放線菌素、長春新堿、地塞米松等常規(guī)化學藥物作為免疫調節(jié)劑來調節(jié)免疫反應，然而，這些化學藥物成本較高，具有不可避免的副作用，并不適合長期使用[7]。開發(fā)一個新的、更安全的免疫調節(jié)策略，如開發(fā)天然來源的免疫調節(jié)劑是預防和治療免疫抑制疾病的有效方法之一。

目前，國內外學者對食用菌源免疫調節(jié)劑的體內免疫調節(jié)活性研究已取得一些進展。Meng等[8]研究發(fā)現(xiàn)，翹鱗肉齒菌提取物通過增加血清免疫球蛋白和免疫因子，中和氧化應激，顯著改善CTX 誘導的免疫抑制小鼠的免疫功能。張瑞[9]研究發(fā)現(xiàn)樺褐孔菌水提物具有良好的免疫調節(jié)作用，能明顯增強環(huán)磷酰胺致免疫低下小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬能力和脾臟淋巴細胞的增殖能力，顯著提高NK 細胞的殺傷活性，提高小鼠肝臟和血清中的GSH-PX、SOD、CAT、AKP 等酶的活性。Ditamo等[10]研究雙孢菇中凝集素具有減少先天性和適應性反應的體內免疫調節(jié)作用。Jedrzejewski等[11]發(fā)現(xiàn)云芝提取物具有顯著的免疫調節(jié)活性，能夠促進大鼠細胞因子IFN-γ、IL-1β、IL-2 的產生，增強免疫調節(jié)能力[11]。同時，研究發(fā)現(xiàn)，猴頭菇[12]、香菇[13]和裂蓋馬鞍菌[14]中獲得的提取物對環(huán)磷酰胺誘導的小鼠免疫抑制也有保護作用。然而，目前關于松茸源免疫調節(jié)劑的體內免疫調節(jié)研究較為缺乏。

本文采用環(huán)磷酰胺（Cyclophosphamide，CTX）誘導建立免疫抑制小鼠模型，評價松茸低溫水提物（Tricholoma matsutake water extract，TMWE）及其粗蛋白組分（Tricholoma matsutake water extract-crude protein，TMWE-CP）對BALB/c 免疫抑制小鼠免疫調節(jié)活性的調節(jié)作用，包括非特異性免疫（小鼠體質量與免疫器官指數(shù)、脾臟組織病理學和單核-巨噬細胞清除能力）、體液免疫（血清半溶血值和血清免疫球蛋白G、M 水平）和細胞免疫（遲發(fā)型變態(tài)反應和脾臟淋巴細胞增殖能力）3個方面的影響，研究結果可為松茸生物活性成分的免疫調節(jié)機制，松茸源免疫調節(jié)劑及其功能性產品的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、材料及試劑

1.1.1 實驗動物 實驗動物為清潔級（Specific pathogen free，SPF）雄性BALB/c 小鼠（6～8 周齡，20 g±2 g），購自遼寧長生生物技術有限公司（大連，中國）。所有實驗動物和實驗研究均經大連工業(yè)大學倫理委員會（IDSYXK2017-0005）批準，并符合其標準，小鼠飼養(yǎng)于無菌動物房中（溫度：23℃±2 ℃，濕度：50%±5%，12 小時照明光暗循環(huán)）。所有動物可以自由攝取SPF 級飲用水和飼料。

1.1.2 受試物（樣品）的制備 松茸：長白山野生松茸凍干片，吉林省延吉市順鑫松茸貿易有限公司。

松茸粉：取適量凍干松茸片，用高速粉碎機打碎成粉，過60 目篩，密封置于干燥處備用。

TMWE：根據(jù)實驗室先前研究，將松茸粉（200 g）與蒸餾水（6 L）混合，20 ℃提取2 h，取上清液凍干，并在-80 ℃下保存，備用。

TMWE-CP：從TMAE 中經硫酸銨鹽析[15]、離心、透析、凍干等操作分離得到粗蛋白組分，并在-80 ℃下保存，備用。

采用雙縮脲法測定蛋白含量[16]，苯酚硫酸法測定總糖含量[17]，TMWE 中蛋白含量18.72%±3.19%，總糖含量34.64%±4.09%；TMWE-CP 蛋白含量58.79%±0.07%，總糖含量9.62%±0.08%。

1.1.3 試劑 鹽酸左旋咪唑（Levamisole，LMS），山東仁和堂藥業(yè)有限公司；環(huán)磷酰胺，上海麥克林生化科技有限公司；紅細胞裂解液，北京索萊寶科技有限公司；刀豆球蛋白A（Concanavalin A，Con A）、印度墨水，上海源葉生物科技有限公司；綿羊紅細胞（Sheep red blood cell，SRBC）、豚鼠血清，廣州鴻泉生物科技有限公司；SA 緩沖液、都氏試劑、多聚甲醛固定液（4%），北京雷根生物技術有限公司；Cell Counting Kit-8（CCK-8）檢測試劑盒，上海碧云天生物技術有限公司；免疫球蛋白G（Immunoglobulin G，IgG）和免疫球蛋白A（Immunoglobulin M，IgM）ELSIA 試劑盒，上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

Leica DM2500 熒光顯微鏡，徠卡顯微系統(tǒng)（上海）貿易有限公司；日本Infinite M 200 多功能酶標，瑞士Tecan 公司；NU-437-400S 垂直流生物安全柜、NU-5810E CO2培養(yǎng)箱，美國Nuaire 公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗動物分組設計 如圖1 所示，所有小鼠適應7 d 后，將50 只雄性BALB/c 小鼠隨機分為5 組（n=10）：正常對照組（Normal control group，NC），模型對照組（Model control group，MC），陽性對照組（Positive control group，PC），松茸低溫水提物組（Tricholoma matsutake water extract group，TMWE）和松茸水提粗蛋白組（Tricholoma matsutake water extract -crude protein group，TMWE-CP）。如圖1 所示，NC 和MC 組小鼠分別灌胃0.2 mL 生理鹽水（0.1 mL/10 g BW，Body weight），PC 組灌胃25 mg/（kg·d）LMS[18]，TMWE 組灌胃200 mg/（kg·d）TMWE[19]，TMWECP 組給予200 mg/（kg·d）TMWE 中蛋白含量相當?shù)腡MWE-CP（64 mg/（kg·d））灌胃處理，試驗總共5 周，每3 d 記錄1 次小鼠體質量，直至試驗結束。在灌胃處理的第29 天、30 天，除NC 組，其它各組所有小鼠腹腔注射50 mg/（kg·d）CTX[20]以建立小鼠免疫抑制模型。第35 天完成最后一次給藥后，所有小鼠禁食不禁水12 h，摘眼球取血并離心血液以收集血清，頸椎脫位法處死小鼠，收集胸腺、脾臟、肝臟于無菌離心管中，并在-80 ℃下保存，備用。

1.3.2 小鼠體質量及免疫器官指數(shù)的測定 在受試物灌胃處理期間，每周測量并記錄各組小鼠的體重。在注射過程中每天測量1 次小鼠的體重。灌胃結束后，頸椎脫位法處死小鼠，取出小鼠的胸腺、脾臟，稱重。免疫器官指數(shù)的計算公式如下[20]：

1.3.3 組織病理學 小鼠處死后，取出脾組織，用4%多聚甲醛固定24 h，進行石蠟包埋，切片（厚度4 μm），H&E 染色，然后在光學顯微鏡下觀察染色并拍照[21]。

1.3.4 碳顆粒清除能力的測定[22]小鼠末次給藥24 h 后，稱重，小鼠尾靜脈注射0.1 mL/10 g 印度墨汁（1∶4），尾靜脈注射后立即計時，分別于2 min（T1）和10 min（T2）時眼靜脈叢各取血20 μL，然后與2 mL 0.1%碳酸鈉溶液混合。在600 nm 波長下測定混合液在T1和T2時的OD 值，記為A1、A2，取2 mL 0.1% Na2CO3作空白。采血后頸椎脫位法處死小鼠，解剖取出小鼠的肝臟、脾臟并稱重。碳顆粒清除能力（α）計算公式如下：

式中：α——碳顆粒清除能力；T1——采血時間2 min；T2——采血時間10 min；A1——T1時混合液的OD600nm值；A2——T2時混合液的OD600nm值。

1.3.5 Con A 誘導的小鼠脾細胞增殖試驗[23]灌胃后處死小鼠，無菌取出小鼠脾臟，置于5 mL 無菌PBS 中。用一次性注射器內芯，輕微用力將脾臟磨碎，通過200 目網(wǎng)狀篩生成單細胞懸液，Hank's液清洗3 次。用紅細胞裂解緩沖液處理細胞，離心（1 000 r/min，5 min）去除紅細胞。將細胞用RPMI-1640（含10%胎牛血清）完全培養(yǎng)基清洗和重懸?？刂破⒓毎麧舛戎?×106個/mL。然后，將180 μL脾細胞懸液和20 μL Con A 接種到96 孔細胞培養(yǎng)版中，使Con A 的最終濃度為5 μg/mL，另取200 μL RPMI-1640 完全培養(yǎng)基作空白對照。96孔細胞培養(yǎng)板在37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育48 h。在培養(yǎng)結束前4 h，向每個孔中加入WST（水溶性四唑鹽）溶液，并繼續(xù)培養(yǎng)4 h。最后，使用酶標儀測量450 nm 處的吸光度。

1.3.6 遲發(fā)型超敏反應（Delayed type hypersensitivity，DTH）的測定 參考魏艷等[24]的研究方法，采用足跖增厚法測定DTH。每只小鼠腹腔注射0.2 mL 2%（體積分數(shù)）SRBC（約1×108個細胞）進行DTH 試驗。腹腔免疫4 d 后，使用游標卡尺（0.01 mm）測量左后爪的厚度，然后向小鼠左后爪測量部位皮下注射含有約1×108個細胞的20 μL的20% SRBC（體積分數(shù)）。24 h 后，測量左后爪的厚度（測量3 次，取平均值），并計算跖骨腫脹厚度差異，以反映DTH 的程度。

1.3.7 血清半溶血值（Serum half-hemolysis value，HC50）[23]的測定 在灌胃處理結束前4 d，每只小鼠腹腔注射0.2 mL 的2%（體積分數(shù)）SRBC 懸液。4 d 后，小鼠眼眶采血，測定半溶血值（HC50）。首先，用1 mL SA 緩沖液稀釋20 μL 血清，取1 mL 稀釋血清樣品，0.5 mL 10%（體積分數(shù)）SRBC懸液和1 mL 豚鼠補體（1 ∶10），在37 ℃水浴中孵育30 min。冰浴以終止反應，離心（2 000 r/min，10 min），取1 mL 上清，加入3 mL 都氏試劑。陽性對照組分別加入0.25 mL 的10%（體積分數(shù)）SRBC懸液、3.75 mL 都氏試劑，徹底混合并孵育10 min。測量490 nm 下的OD 值。HC50的計算公式如下：

1.3.8 血清免疫球蛋白（IgG、IgM）的測定 血清IgG、IgM 分析采用酶聯(lián)免疫吸附分析檢測試劑盒測定。按照制造商的說明，使用酶標儀在450 nm處測量溶液的OD 值，血清IgM、IgG 濃度根據(jù)標準曲線計算。

1.4 統(tǒng)計學分析

試驗數(shù)據(jù)采用Origin 2019b、SPSS 25.0 軟件進行處理和分析。每個試驗至少平行重復3 次，數(shù)據(jù)以均值±標準差表示。采用單因素方差分析，然后采用Tukey HSD 檢驗，比較組間差異，顯著性水平設為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 TMWE 和TMWE-CP 對免疫抑制小鼠體質量和免疫器官指數(shù)的影響

胸腺和脾臟是免疫細胞生長、分化、成熟和產生免疫反應的重要免疫器官，其免疫調節(jié)作用與器官指數(shù)的增加密切相關，各器官指標在一定程度上反映了免疫器官的功能狀況[25]。如圖2 所示，MC 組的免疫器官指數(shù)明顯低于NC 組（P<0.05），表明成功建立免疫抑制模型。在建立CTX 誘導的免疫抑制小鼠模型時，常使用LMS 作陽性模型藥物，經LMS 處理的小鼠的免疫器官指數(shù)也高于MC 組（P<0.05）。此外，與MC 組相比，經TMWE和TMWE-CP 處理的小鼠的免疫器官指數(shù)均顯著增加（P<0.05），表明TMWE 和TMWE-CP 組分可減輕CTX 引起的免疫器官萎縮，能夠拮抗CTX 所致的免疫器官指數(shù)下降。此外，TMWE 組胸腺指數(shù)顯著（P<0.01）高于TMWE-CP 組。以上結果表明，TMWE 和TMWE-CP 均可有效的改善CTX 誘導的免疫抑制，具有預防和治療效果，并且TMWE對免疫器官損傷的改善效果更為顯著。

圖2 TMWE 和TMWE-CP 對小鼠免疫器官指數(shù)的影響Fig.2 The effects on immune organ index of TMWE and TMWE-CP

不同組分處理的小鼠體質量變化如圖3 所示。第1 天至第22 天，所有處理組的小鼠的體質量，均呈上升趨勢。第23 天后，NC 組小鼠的體質量持續(xù)增加，而其它組小鼠體質量顯著下降（P<0.05），表明造模成功。造模期后，TWME-CP組小鼠的體質量下降程度最小，MC 組小鼠體質量下降程度最大，其它組小鼠體質量趨勢相近，說明TWME-CP 組分可顯著抑制CTX 導致的小鼠體質量減輕。小鼠體質量的變化表明TMWE 和TMWE-CP 均具有一定的免疫調節(jié)能力。

圖3 TMWE 和TMWE-CP 對小鼠體質量的影響Fig.3 The effects on body weight of TMWE and TMWE-CP

2.2 TMWE 和TMWE-CP 對免疫抑制小鼠脾臟組織形態(tài)學影響

通過對脾臟形態(tài)學觀察，評價TMWE 和TMWE-CP 組分處理對免疫器官的影響。如圖4所示，HE 染色顯示，NC 對照組脾囊（100×A）未被破壞，生發(fā)中心融合（100×B、200×），脾紅、白髓結構正常，淋巴細胞排列緊密（400×）。相比之下，MC組的脾囊（100×A）被破壞，生發(fā)中心（100×B）離散，紅白髓間邊界不清楚且淋巴細胞數(shù)量減少、稀疏。而通過TMWE 和TMWE-CP 的持續(xù)干預，其受損程度相比MC 組較輕，脾囊（100×A）趨于完整，生發(fā)中心趨于融合（100×B），淋巴細胞數(shù)量恢復，排列趨于緊密（400×），組織表現(xiàn)幾乎接近NC組。此外，與TMWE 組相比，TMWE-CP 組淋巴細胞排列更緊密，數(shù)量顯著恢復（400×），但生發(fā)中心（100×B）融合度稍低，表明TMWE 對脾臟損傷的恢復效果更好。綜上，TMWE 和TMWE-CP 的干預處理均可改善CTX 誘導的脾臟組織損傷，二者對脾臟均具有預防和保護作用，TMWE 組分改善效果更好。

圖4 TMWE 和TMWE-CP 對小鼠脾臟組織病理變化的影響Fig.4 Effects of TMWE and TMWE-CP on pathological changes of spleen in mice

2.3 TMWE 和TMWE-CP 對免疫抑制小鼠碳顆粒清除能力的影響

巨噬細胞在免疫應答和宿主防御中起關鍵作用，它不僅是一種重要的免疫細胞，而且也是單核巨噬細胞系統(tǒng)的主要組成部分，可通過吞噬作用直接清除腫瘤、外部病毒、細菌甚至癌細胞，從而介導非特異性免疫反應[26]。碳粒廓清試驗是檢測單核-巨噬細胞吞噬能力的經典試驗方法。結果如圖5 所示，MC 組小鼠吞噬細胞吞噬指數(shù)與NC 組相比顯著下降（P<0.01），這表明注射CTX 可降低小鼠的碳顆粒清除能力。與MC 組相比，TMWE 和TMWE-CP 處理能夠顯著提高免疫抑制小鼠的碳顆粒清除能力，其結果具有統(tǒng)計學差異（P<0.05），由此表明，TMWE 和TMWE-CP 處理均能夠預防并逆轉CTX 的免疫抑制作用，以此增強機體非特異性免疫。另外，與NC 組小鼠相比，口服TMWE可顯著增強小鼠巨噬細胞的吞噬作用，其作用效果顯著優(yōu)于TMWE-CP 給藥處理（P<0.01）。結果表明TMWE 在機體非特異性免疫方面具有良好免疫增強效果，且優(yōu)于TMWE-CP。

圖5 TMWE 和TMWE-CP 對免疫抑制小鼠碳顆粒清除能力的影響Fig.5 Effects of TMWE and TMWE-CP on carbon particle clearance ability in immunosuppressed mice

2.4 TMWE 和TMWE-CP 對免疫抑制小鼠脾淋巴細胞轉化增殖率的影響

如圖6 所示，經Con A 誘導后，MC 組小鼠脾淋巴細胞增殖率顯著降低（P<0.05），表明CTX 能夠嚴重損害脾淋巴細胞的增殖。經給藥干預后，TMWE 和TMWE-CP 組脾淋巴細胞增殖率顯著高于MC 組，由此表明TTMWE 和TMWE-CP 均可以顯著改善由CTX 處理引起的小鼠脾淋巴細胞增殖率降低作用。與TMWE 組相比，TMWE-CP 組小鼠脾淋巴細胞增殖率顯著提高。以上結果表明，TMWE 和TMWE-CP 組分對免疫抑制小鼠脾淋巴細胞增殖具有顯著改善作用，TMWE-CP 組分在脾淋巴細胞增殖的細胞免疫水平上更加顯著。

圖6 TMWE 和TMWE-CP 對免疫抑制小鼠脾淋巴細胞增殖活性的影響Fig.6 Effect of TMWE and TMWE-CP on splenic lymphocyte proliferation activity in immunosuppressed mice

2.5 TMWE 和TMWE-CP 對免疫抑制小鼠遲發(fā)型超敏反應（DTH）的影響

免疫抑制小鼠遲發(fā)型超敏反應結果如圖7 所示，經SRBC 致敏后，MC 組與NC 組小鼠的DTH水平差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），表明模型建立良好。PC 組及各受試組與MC 組小鼠的DTH水平差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），表明TMWE和TMWE-CP 均能夠顯著增強特異性增敏效應T細胞介導的淋巴細胞免疫反應。此外，與TMWE組相比，TMWE-CP 組小鼠的DTH 水平顯著提高（P<0.05），與免疫抑制小鼠脾淋巴細胞增殖轉化能力的試驗結果趨勢一致。以上結果表明，TMWE及TMWE-CP 組分可顯著增強T 細胞介導的免疫應答能力，增強免疫抑制小鼠細胞免疫功能，且TMWE-CP 組分作用效果更加顯著。

圖7 TMWE 和TMWE-CP 對免疫抑制小鼠DTH 的影響Fig.7 Effects of TMWE and TMWE-CP on DTH in immunosuppressed mice

2.6 TMWE 和TMWE-CP 對免疫抑制小鼠血清半溶血值（HC50）的影響

通過測定HC50值來評價TMWE 及其不同組分對免疫抑制小鼠體液反應的影響。如圖8 所示，MC 組的溶血素產生水平明顯低于NC 組（P<0.05），說明CTX 顯著抑制了小鼠血清總補體溶血活性。與MC 組相比，TMWE 和TMWE-CP 組HC50水平顯著提升（P<0.05）。另一方面，與NC 組相比，TMWE 和TMWE-CP 組HC50水平差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01），但TMWE 與TMWE-CP 組之間HC50水平不顯著（P>0.05）。以上結果表明，TMWE和TMWE-CP 組分的灌胃干預可較好的拮抗CTX的免疫抑制作用，增強免疫抑制小鼠的體液免疫功能。

2.7 TMWE 和TMWE-CP 對免疫抑制小鼠血清免疫球蛋白（IgG、IgM）的影響

小鼠血清中IgG、IgM 含量如圖9 所示，MC 組與NC 組相比，在注射CTX 后，IgG、IgM 的表達水平顯著降低（P<0.05）。與MC 組相比，灌胃TMWE和TMWE-CP 能夠顯著增強CTX 免疫抑制小鼠的IgG、IgM 的表達水平（P<0.05）。其中，TMWECP 的小鼠IgG 表達水平顯著高于TMWE 組（P<0.05），IgM 表達水平未見顯著性差異（P>0.05）。由此表明，TMWE 和TMWE-CP 組分的灌胃干預均可恢復免疫抑制小鼠的IgG 和IgM 水平，可改善免疫抑制小鼠的體液免疫功能，且以TMWE-CP組分作用效果較優(yōu)。

圖9 TMWE 和TMWE-CP 對免疫抑制小鼠血清免疫球蛋白的影響Fig.9 Effects of TMWE and TMWE-CP on IgG（a）and IgM（b）in serum of immunosuppressed mice

3 討論

環(huán)磷酰胺（CTX）是一種應用十分廣泛的抗腫瘤藥物之一，但同時它也是一種高效的免疫抑制藥物，故本研究以CTX 作為動物免疫抑制模型的制備藥物[25]。試驗結果顯示，腹腔注射CTX 后，MC組及各試驗組小鼠均表現(xiàn)出不同程度的精神萎靡不振，伴隨小鼠體重明顯下降，這與衣偉萌等[27]對太子參參須提取物免疫抑制改善研究中的免疫抑制小鼠表現(xiàn)特征相近。此外，MC 組的免疫器官指數(shù)、碳顆粒清除能力、脾淋巴細胞增殖轉化活性、DTH、HC50、IgG 與IgM 水平較NC 組小鼠相比均顯著降低，表明CTX 使小鼠免疫功能受到抑制，免疫抑制模型成功建立。

脾臟和胸腺是動物體內主要的免疫器官，含有大量的淋巴細胞和巨噬細胞，在細胞免疫和體液免疫中發(fā)揮重要作用，而CTX 可抑制巨噬細胞分化，并減少免疫器官中的淋巴細胞數(shù)量，從而使體重、脾臟和胸腺質量下降[28]。因此，小鼠體重、脾臟病理學特征以及免疫器官指數(shù)能夠反映機體非特異性免疫水平。在本研究中，MC 組的體重和免疫器官指數(shù)較NC 組顯著降低，小鼠脾臟的脾囊被破壞，生發(fā)中心離散，淋巴細胞數(shù)量減少，紅、白髓邊界不清晰，組織表現(xiàn)較差，脾臟病理學特征提示存在脾臟損傷的情況。當小鼠經TMWE 和TMWE-CP 的持續(xù)干預，免疫器官指數(shù)均出現(xiàn)了不同程度的改善，經TMWE 干預的小鼠胸腺指數(shù)顯著（P<0.01）高于TMWE-CP 組，所有受試組小鼠體重呈逐漸恢復趨勢，特別是TMWE-CP 組。此外，組織病理學觀察也表明，TMWE 和TMWE-CP處理可改善CTX 誘導的脾臟損傷，保護脾囊，促進生發(fā)中心融合，恢復淋巴細胞數(shù)量，小鼠的脾臟組織結構逐漸改善。另一方面，巨噬細胞是單核-巨噬細胞系統(tǒng)的重要組成部分，其通過吞噬作用吞噬病原體，并參與先天和后天免疫，而巨噬細胞吞噬能力則是評價機體的非特異性免疫功能重要檢測指標[5]。碳廓清試驗是檢測巨噬細胞吞噬能力的經典試驗方法，它通過測定血液中碳粒的消失速率反映巨噬細胞系統(tǒng)吞噬異物的能力[24]。試驗結果顯示，灌胃TMWE 和TMWE-CP 組分均能夠預防并逆轉CTX 的免疫抑制作用，且TMWE 作用效果明顯高于TMWE-CP 組分給藥處理。綜合以上結果表明，TMWE 和TMWE-CP 的干預處理能拮抗CTX 對免疫器官的抑制作用，改善脾臟組織結構，恢復并提升小鼠碳顆粒清除能力，增強機體的非特異性免疫功能，從而提高機體的免疫力。另外，與TMWE-CP 相比，TMWE 受試干預在機體非特異性免疫方面表現(xiàn)出較優(yōu)的免疫改善效果。

DTH 和脾淋巴細胞增殖轉化能力是評價動物體內和體外細胞免疫的兩個重要參數(shù)。本研究采用跖骨增厚法檢測免疫抑制小鼠DTH 的程度，通過注射SRBC 致敏并激活T 淋巴細胞，使局部組織發(fā)生膨脹，以反映動物體內細胞免疫功能[29]。本研究結果表明，SRBC 致敏后，與MC 組相比，TMWE 和TMWE-CP 持續(xù)干預處理可明顯增強免疫抑制小鼠遲發(fā)型超敏反應，且TMWE-CP 組分比TMWE 組分DTH 效果更加顯著。通常DTH 的發(fā)生與效應T 細胞、巨噬細胞及其產生的細胞因子或細胞毒性介質有關，由此推測，TMWE 和TMWE-CP 組分對免疫抑制小鼠DTH 的促進作用，可能是通過促進T 細胞轉化為效應細胞及增強巨噬細胞的活性來實現(xiàn)的。Con A 常作為一種非特異性促有絲分裂調節(jié)劑使用，而CTX 是一種非特異性抗有絲分裂免疫抑制劑，前者單獨作用于淋巴細胞時，可促進T 淋巴細胞增殖轉化，后者對T、B 淋巴細胞增殖和分化具有抑制作用，導致機體免疫系統(tǒng)和器官的損傷[22，30]，因此，本研究采用Con A 誘導活化免疫抑制小鼠脾臟淋巴細胞，通過CCK-8 試劑盒檢測T 淋巴細胞增殖活性，結果表明TMWE 和TMWE-CP 組分均顯著增加Con A 誘導的T 淋巴細胞的增殖活性，與TMWE 相比，TMWE-CP 的作用效果更加顯著（P<0.05）。綜上，在細胞免疫方面，TMWE 和TMWE-CP 組分的持續(xù)干預可使細胞免疫功能顯著增強，且TMWECP 的DTH 和脾淋巴細胞增殖活性作用效果均顯著優(yōu)于TMWE 組分，即TMWE-CP 組分在細胞免疫方面作用效果更顯著。

免疫球蛋白是指B 細胞響應特定抗原后增殖和分化而產生的蛋白質，它廣泛存在于所有脊椎動物的血液、淋巴和體液中[7]。當受到抗原性刺激后，IgM 首先被合成并誘導其它免疫細胞破壞外源刺激物，其在初次免疫中占據(jù)重要地位，IgG 是免疫球蛋白中分子質量最小和最常見的抗體類型，IgG 在脾臟和淋巴結中產生，在激活補體系統(tǒng)、中和免疫反應中的毒素方面發(fā)揮重要作用[31-32]。它們都與體液免疫密切相關。ELISA 法測定小鼠血清IgG、IgM 水平的結果表明，注射CTX 使正常小鼠的IgG、IgM 表達量下降，而TMWE 和TMWECP 組分持續(xù)干預能夠顯著增強CTX 免疫抑制小鼠的IgG、IgM 的表達水平，與TMWE 組分相比，TMWE-CP 能夠顯著增強血清IgG 的表達水平，而二者在IgM 的表達水平上作用效果無顯著性差異（P>0.05）。此外，B 淋巴細胞在受到SRBC 刺激后，在免疫抑制小鼠的體液免疫反應中產生溶血素特異性抗體，且溶血素特異性抗體與體液免疫呈正相關，血清中溶血素特異性抗體的水平可以通過測定體外溶血過程中釋放的血紅蛋白量來反映出來[33]。HC50測定試驗結果表明，經TMWE 與TMWE-CP 組分持續(xù)干預顯著增加了免疫抑制小鼠的血清溶血素特異性抗體水平，二者作用效果相近（P>0.05）。綜上，TMWE 和TMWE-CP 均可有效改善CTX 處理小鼠的體液免疫功能，且以TMWE-CP 組分體液免疫改善效果較優(yōu)。

大量研究表明，食用菌多糖在一定程度上具有良好的增強免疫作用[14]。在本研究中，TMWE 和TMWE-CP 主要成分測定結果表明，TMWE 含有更豐富的粗多糖，但試驗結果發(fā)現(xiàn)TMWE-CP 特異性免疫調節(jié)作用（體液免疫和細胞免疫）優(yōu)于TMWE 組分。這可能是因為，TMWE 組分中雖存在較多比例的粗多糖，但其生物活性與其中多糖分子的糖單元組成、糖苷鍵類型及支鏈的長度、取代度等有關[34]。另外，當?shù)鞍踪|和多糖在同一體系共存時，其分子間具有共價鍵與非共價鍵的相互作用，相互作用導致體系內部微觀結構形態(tài)的變化，進而影響體系的物理化學性質[35]。此外，提取物中蛋白質經人體攝入后，大多于消化道內被酶解為小肽的形式，通過腸壁轉運消化吸收，而氨基酸的物理化學特性（正電荷數(shù)量、疏水性和鏈長等）可影響免疫效應，如帶正電荷的肽類似于趨化因子，與免疫細胞上的受體結合，激活免疫反應[36-37]。所以，TMWE 與TMWE-CP 的免疫調節(jié)作用的差異可能與受試物提取分離工藝，受試物體內消化吸收特性以及受試物所在體系中的不同成分間相互作用相關，其免疫調節(jié)機制仍需進一步研究論證。

4 結論

本研究基于CTX 誘導免疫抑制BALB/C 小鼠模型，從非特異性免疫、細胞免疫和體液免疫3 個角度評價松茸低溫水提物（TMWE）及其粗蛋白組分（TMWE-CP）的免疫調節(jié)作用。研究結果表明，TMWE 和TMWE-CP 組分可恢復和增強免疫抑制小鼠的免疫調節(jié)能力，其作用表現(xiàn)在增強免疫抑制小鼠的免疫器官指數(shù)、碳顆粒清除能力、遲發(fā)型超敏反應、脾淋巴細胞增殖能力及改善免疫抑制小鼠脾臟組織形態(tài)和血清免疫指標。此外，TMWE在非特異性免疫方面具有較好的免疫調節(jié)效果，TMWE-CP 在細胞免疫和體液免疫方面的免疫調節(jié)作用較顯著，這可能與其提取分離純化工藝、體內消化吸收特性以及其所在體系中相互作用有關。因此，關于TMWE 和TMWE-CP 組分的體內免疫調節(jié)機制，以及TMWE 和TMWE-CP 組分中主要免疫活性成分的篩選仍需進一步的研究。本研究表明TMWE 和TMWE-CP 組分是一種具有良好開發(fā)前景的免疫調節(jié)劑。本研究可為松茸保健食品的研發(fā)提供理論依據(jù)。