呂孟玲，唐禎玥，張雨松，邵美麗

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 哈爾濱 150030）

沙棘果渣是沙棘果經(jīng)榨汁后的副產(chǎn)物，僅有少量用于飼料行業(yè)，大部分直接丟棄，造成資源浪費(fèi)及環(huán)境污染。沙棘果渣含有氨基酸、維生素、黃酮類化合物及膳食纖維等多種營養(yǎng)素[1]，目前研究主要集中于黃酮類、沙棘油及花青素等方面，而膳食纖維尚未被開發(fā)利用。膳食纖維被譽(yù)為人類第七大營養(yǎng)素[2]，具有極強(qiáng)的水合性質(zhì)，可以增加人體飽腹感，控制食物的攝取，促進(jìn)排便，能有效預(yù)防肥胖和便秘等健康問題；同時(shí)膳食纖維具有多種活性基團(tuán)，可以吸附NO2-、丙烯酰胺等物質(zhì)，減少食品加工中有毒、有害物質(zhì)對人體的危害[3-4]。

膳食纖維提取方法主要有水提法、化學(xué)提取法、酶提法等。水提法工藝簡單，提取率低；化學(xué)法使用大量的強(qiáng)酸和強(qiáng)堿，對環(huán)境造成污染；酶提法雖然操作條件溫和、節(jié)約能源、無污染，但是提取效率低[5-6]。近年來超聲波技術(shù)已成功應(yīng)用于各種活性物質(zhì)的提取工藝中。研究發(fā)現(xiàn)超聲輔助提取不僅能夠改變植物多糖微觀形態(tài)，增加抗氧化能力[7-8]，改善膠原蛋白的溶解性，提高體外消化過程的酶解效率[9]，還能夠增加膳食纖維的提取效率，改善膳食纖維的理化性能[10]。

本研究采用超聲輔助酶法提取沙棘果渣膳食纖維，對提取工藝進(jìn)行單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化，提高膳食纖維得率。對總膳食纖維、不溶性膳食纖維及可溶性膳食纖維進(jìn)行理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特性和功能性質(zhì)分析，為深入研究沙棘果渣膳食纖維功能及資源再利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

沙棘（品種：深秋紅），黑龍江牡丹江；堿性蛋白酶，北京奧博星生物科技有限公司；丙烯酰胺，美國Amresco 公司；玉米赤霉烯酮，大連美倫生物技術(shù)有限公司；脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，阿拉丁生化科技股份有限公司；無水乙醇、石油醚等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 設(shè)備與儀器

小型高速多功能粉碎機(jī)，浙江永康市紅太陽機(jī)電有限公司；KQ-400KDB 數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；S-3400N 掃描電子顯微鏡，日本日立；1260II Prime 高效液相色譜儀，美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 沙棘果渣基本成分的測定 分別參照GB 5009.3-2010 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測定》、GB 5009.4-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中灰分的測定》、GB 5009.5-2016 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》、GB 5009.6-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪的測定》、GB 5009.88-2014 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中膳食纖維的測定》對沙棘果渣基本成分進(jìn)行測定。

1.3.2 沙棘果渣膳食纖維制備

1.3.2.1 沙棘果渣預(yù)處理 將沙棘果渣置于60℃熱風(fēng)干燥箱中干燥24 h 后，去除其中的沙棘籽等雜質(zhì)，采用小型粉碎機(jī)粉碎，過60 目篩得到粉末樣品，稱取定量的粉末樣品用索式抽提裝置脫脂8 h 后干燥備用。

1.3.2.2 沙棘果渣膳食纖維制備工藝 稱取一定量的脫脂沙棘果渣樣品于燒杯中，設(shè)置不同的提取工藝參數(shù)（料液比、pH 值、酶解溫度、堿性蛋白酶添加量、超聲功率和超聲時(shí)間）進(jìn)行膳食纖維提取，提取結(jié)束后，于100 ℃水浴中保溫15 min。將提取液離心，然后分別用70 ℃去離子水、78%、95%乙醇清洗沉淀1 次，得到沙棘果渣不溶性膳食纖維（IDF）；同時(shí)向上清液中加入4 倍體積的95%乙醇，4 ℃下醇沉4 h，收集沉淀，用78%、95%乙醇各洗滌1 次，即得到沙棘果渣可溶性膳食纖維（SDF），將IDF 和SDF 于60 ℃下烘干至恒重。IDF 和SDF 的總和為沙棘果渣總膳食纖維（TDF）。TDF 得率按如下公式（1）計(jì)算：

1.3.2.3 單因素試驗(yàn) 本試驗(yàn)以液料比[10∶1～30∶1（mL/g）]、pH（7.0～11.0）、酶解溫度（40～60 ℃）、堿性蛋白酶添加量（7%～15%）、超聲功率（0～400 W）以及超聲時(shí)間（10～50 min）進(jìn)行單因素單驗(yàn)，考察各因素對TDF 得率的影響。

1.3.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果分析，按照Box-Behnken 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以液料比（A）、pH 值（B）、酶解溫度（C）、堿性蛋白酶添加量（D）為自變量，以TDF 得率為響應(yīng)值，采用四因素三水平的響應(yīng)面分析方法優(yōu)化酶解條件。試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 Box-Behnken 設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素水平及編碼Table 1 Four factors，levels and codes of Box-Behnken design

1.3.3 理化性質(zhì) 持水力、持油力、膨脹力參考Li等[11]的方法測定；陽離子交換能力參考Qi等[12]方法測定。

1.3.4 結(jié)構(gòu)特性

1.3.4.1 掃描電鏡 將待掃描的IDF、SDF 及TDF樣品經(jīng)干燥處理后置于載物臺(tái)上，表面噴金處理。通過掃描電鏡觀察待測樣品微觀形態(tài)。

1.3.4.2 傅里葉紅外光譜 IDF、SDF 及TDF 樣品用KBr 壓片法制樣后，采用紅外光譜儀測定纖維中基團(tuán)的種類，波數(shù)測定范圍400～4 000 cm-1。

1.3.5 吸附特性

1.3.5.1 丙烯酰胺吸附能力的測定 參考Shen等[13]的方法，稍作修改。將5.0 mg 沙棘果渣膳食纖維加入到10 mL 50 μg/mL 丙烯酰胺中，調(diào)節(jié)pH值，37 ℃，120 r/min 避光振搖5 h，離心，用高效液相色譜法測定上清中丙烯酰胺。以未加入膳食纖維的丙烯酰胺為空白對照組。丙烯酰胺吸附能力按照式（2）計(jì)算。

式中：c0——對照組丙烯酰胺濃度，μmol/L；ce——吸附平衡時(shí)丙烯酰胺濃度，μmol/L；V——丙烯酰胺溶液體積，L；m——樣品質(zhì)量，g。

1.3.5.2 NO2-吸附能力的測定 參考Zhang等[14]測定方法。稱取0.1 g 沙棘果渣膳食纖維加入到20 mL 100 μmol/L 的亞硝酸鈉中，調(diào)節(jié)pH 值至2.0 或7.0，120 r/min，37 ℃恒溫振蕩2 h，離心，參照GB 5009.33-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》 測定上清液中NO2-含量。以未加入膳食纖維的亞硝酸鈉為空白對照組。NO2-吸附能力按照式（3）計(jì)算。

式中：c0——對照組NO2-濃度，μmol/L；ce——吸附平衡時(shí)NO2-濃度，μmol/L；V——NO2-溶液體積，L；m——樣品質(zhì)量，g。

1.3.5.3 玉米赤霉烯酮吸附能力的測定 參考Sun等[15]的測定方法，在10 mL 棕色離心管加入4.0 mg 沙棘果渣膳食纖維，然后加入2 mL 2 μg/mL 玉米赤霉烯酮，調(diào)節(jié)pH 值至2.0 或6.8，37 ℃，180 r/min 振蕩5 h，離心，用高效液相色譜法測定上清液玉米赤霉烯酮含量。以未加入膳食纖維的玉米赤霉烯酮為空白對照組。玉米赤霉烯酮吸附能力按照式（4）計(jì)算。

式中：c0——對照組玉米赤霉烯酮質(zhì)量濃度，μg/L；ce——吸附平衡時(shí)玉米赤霉烯酮質(zhì)量濃度，μg/L；V——玉米赤霉烯酮溶液體積，L；m——樣品質(zhì)量，g。

1.3.5.4 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇吸附能力的測定參考Zhang等[16]的測定方法，稍作修改。稱取4.0 mg 沙棘果渣膳食纖維于10 mL 棕色離心管中，加入2 mL 10 μg/mL 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，調(diào)節(jié)pH值至2.0 或6.8，180 r/min，37 ℃振蕩5 h，用高效液相色譜儀測定上清液中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇含量。以未加入膳食纖維的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇為空白對照組。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇吸附能力按照式（5）計(jì)算。

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇吸附能力（μmol/g）

式中：c0——對照組脫氧雪腐鐮刀菌烯醇濃度，μmol/L；ce——吸附平衡時(shí)脫氧雪腐鐮刀菌烯醇濃度，μmol/L；V——脫氧雪腐鐮刀菌烯醇溶液體積，L；m——樣品質(zhì)量，g。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有測定均重復(fù)3 次，結(jié)果用平均數(shù)±方差（x±s）表示。采用Statistix 8.1 和Origin 2019 對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，P<0.05 為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 沙棘果渣基本成分分析

由表2 可知，沙棘果渣基本成分中含量最多的是總膳食纖維，質(zhì)量分?jǐn)?shù)占比47.16%，可用作提取膳食纖維的原料。此外，沙棘果渣中蛋白質(zhì)、脂肪含量較多，需要進(jìn)行脫脂和除蛋白處理，增加沙棘果渣膳食纖維純度。

表2 沙棘果渣基本成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)（%）Table 2 Mass fraction of basic components of sea-buckthorn pomace（%）

2.2 沙棘果渣膳食纖維提取條件的優(yōu)化

2.2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1.1 液料比對TDF 得率的影響 如圖1 所示，隨著液料比的增加，TDF 得率呈下降趨勢，這是因?yàn)樯臣蠺DF 含量有限，當(dāng)TDF 在水中達(dá)到平衡后，隨料液比增加，可能使其水解，從而使TDF 得率降低[17]。液料比過高，后續(xù)提取需要大量乙醇增加生產(chǎn)成本，因此選定液料比10∶1，15∶1、20∶1 進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 不同液料比對TDF 得率的影響Fig.1 Effect of different solid-liquid ratio on the yield of TDF

2.2.1.2 pH 值對TDF 得率的影響 如圖2 所示，在pH 7.0～11.0 范圍內(nèi)，TDF 得率先隨著pH 值的增大而逐漸增加；至pH 9.0 時(shí)，TDF 得率達(dá)到最大值；隨著pH 值的繼續(xù)增大，TDF 得率開始降低。分析可能是pH 9.0 最接近堿性蛋白酶的最適pH 值。因此，選定pH 8.0、pH 9.0、pH 10.0 進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖2 不同pH 值對TDF 得率的影響Fig.2 Effect of different pH on the yield of TDF

2.2.1.3 酶解溫度對TDF 得率的影響 如圖3 所示，在40～60 ℃范圍內(nèi)，TDF 得率隨著溫度增加，先增加后降低。45 ℃時(shí)，TDF 得率最高，此時(shí)為酶的最適溫度；當(dāng)溫度繼續(xù)升高時(shí)，蛋白酶活性降低，使TDF 得率下降。因此在后續(xù)試驗(yàn)中選定40，45，50 ℃。

圖3 不同酶解溫度對TDF 得率的影響Fig.3 Effect of different temperature on the yield of TDF

2.2.1.4 堿性蛋白酶添加量對TDF 得率的影響如圖4 所示，在7%～15%范圍，TDF 得率隨著酶添加量增加，呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。這是因?yàn)槊柑砑恿康牟粩嘣龆啵瑢?dǎo)致更多的蛋白質(zhì)被酶解，進(jìn)而釋放出更多的TDF；而當(dāng)?shù)鞍酌笇悠芬呀?jīng)達(dá)到飽和后，仍繼續(xù)增加酶添加量時(shí)，會(huì)導(dǎo)致TDF得率有所降低[18]。因此選定酶添加量9%，11%，13%進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖4 不同酶添加量對TDF 得率的影響Fig.4 Effect of different enzyme additions on the yield of TDF

2.2.1.5 超聲功率對TDF 得率的影響 如圖5 所示，超聲輔助法的TDF 得率顯著高于無超聲輔助時(shí)的TDF 得率（P<0.05）。在240～400 W 范圍內(nèi)，TDF 得率隨著功率增加，呈現(xiàn)先增長后降低趨勢，但各組之間差異不顯著（P>0.05），因此后續(xù)未將超聲功率進(jìn)一步優(yōu)化，選定280 W 為后續(xù)試驗(yàn)的最優(yōu)功率。

2.2.1.6 超聲時(shí)間對TDF 得率的影響 如圖6 所示，隨著超聲時(shí)間的延長，TDF 得率呈先增加后降低趨勢，各組之間差異不顯著（P>0.05）。后續(xù)試驗(yàn)對超聲時(shí)間未作為進(jìn)一步優(yōu)化。在40 min 時(shí)TDF得率最高，因此超聲時(shí)間選定為40 min。

圖6 不同超聲時(shí)間對TDF 得率的影響Fig.6 Effect of different ultrasonic time on the yield of TDF

2.2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化

2.2.2.1 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果 采用Design-Expert.8.0.6 統(tǒng)計(jì)軟件，對沙棘果渣膳食纖維提取進(jìn)行Box-Behnken 設(shè)計(jì)，試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面分析結(jié)果Table 3 The results of response surface analysis

將表3 數(shù)據(jù)用Design-Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行擬合，得到如下回歸方程：

Y=58.93-2.17A-0.32B+0.086C+0.54D-0.55AB-0.66AC+0.50AD+0.68BC-0.77BD+0.82CD-0.46A2-1.22B2-0.92C2-0.93D2。該方程二次項(xiàng)系數(shù)均為負(fù)，說明該方程存在最大值。

2.2.2.2 回歸模型建立與討論 回歸模型方差分析見表4，整體模型極顯著（P<0.001），且失擬項(xiàng)P＞0.05，R2=0.9602，表明模型擬合程度好。變異系數(shù)C.V%=0.89＜10，RAdj2為0.9204，說明試驗(yàn)可靠性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高，TDF 得率可以用該模型進(jìn)行分析和預(yù)測。模型一次項(xiàng)A、D，二次項(xiàng)B2、C2、D2及交互項(xiàng)BD、CD 對TDF 得率影響差異極顯著（P<0.05，P<0.01）；一次項(xiàng)B，二次項(xiàng)A2及交互項(xiàng)AB、AC、BC 對TDF 得率影響差異顯著（0.01

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析Table 4 Variance analysis of response surface method

2.2.2.3 響應(yīng)面分析 各交互項(xiàng)對TDF 得率的影響結(jié)果如圖7 所示，從3D 模型圖來看，隨著酶添加量、pH 值、酶解溫度的增加，TDF 得率先增加后減小，這與單因素結(jié)果一致。等高線的疏密程度和形狀可以反映各因素之間的相互作用[19]。AB 等高線為橢圓形，說明液料比和pH 值交互作用顯著；從AC 等高線圖可知，液料比對TDF 得率的影響大于溫度；BD、CD 等高線圖分析可知，酶添加量對TDF 得率的影響大于溫度和pH 值；BC 等高線沿著pH 值方向相對密集，說明pH 值對TDF 得率影響更大。

圖7 交互作用的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface plots

2.2.2.4 確定最優(yōu)條件及驗(yàn)證試驗(yàn) 通過模型分析，確定最優(yōu)工藝條件為：液料比10 ∶1（mL/g），pH 9.19，溫度47.77 ℃，堿性蛋白酶添加量11.38%。此條件下TDF 得率為60.87%。為了驗(yàn)證模型分析的準(zhǔn)確性，綜合單因素結(jié)果，選取料液比10 ∶1（mL/g），pH 9.2，溫度48 ℃，堿性蛋白酶添加量11.40%，超聲功率280 W，超聲時(shí)間40 min，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，重復(fù)3 次，所得沙棘果渣TDF 得率為（60.74±0.33）%，與理論預(yù)測值相近，該模型具有重現(xiàn)性、可行性。

2.3 理化性質(zhì)測定結(jié)果

持水性、持油性和膨脹性是衡量膳食纖維生理功能的重要因素。由表5 可知，沙棘果渣IDF 的持水性和持油性優(yōu)于IDF 和TDF，有研究表明這與顆粒和比表面積大小有關(guān)[20]；SDF 的膨脹性顯著優(yōu)于IDF 和TDF（P<0.05），原因可能是SDF 和水形成了凝膠態(tài)[21]；3 種膳食纖維陽離子交換能力大小依次為：SDF>TDF>IDF，分析原因可能與SDF粒徑小，可暴露更多的活性基團(tuán)有關(guān)[22]。

表5 沙棘果渣膳食纖維理化性質(zhì)Table 5 Physicochemical properties of dietary fibers from sea-buckthorn pomace

2.4 結(jié)構(gòu)分析

2.4.1 掃描電鏡 如圖8 所示，SDF、IDF、TDF 結(jié)構(gòu)差異較大，SDF 的粒徑較小、質(zhì)地緊密、表面附著較多的顆粒；IDF 表面具有明顯的片層結(jié)構(gòu)，表面褶皺較多，同時(shí)具有一定量的孔洞；TDF 塊狀較大，形狀不規(guī)則，表面褶皺較多，結(jié)構(gòu)相對蓬松，同時(shí)有小團(tuán)塊出現(xiàn)。

圖8 沙棘果渣膳食纖維微觀結(jié)構(gòu)Fig.8 The micro-structure of dietary fibers from sea-buckthorn pomace

2.4.2 傅里葉紅外光譜分析 3 種膳食纖維的紅外光譜均具有多種典型的多糖特征吸收峰（圖9），符合膳食纖維的紅外基本結(jié)構(gòu)。在3 436 cm-1和2 930 cm-1附近出現(xiàn)的吸收峰是纖維素、半纖維素分子間或分子內(nèi)-OH 和甲基或亞甲基上C-H的收縮振動(dòng)所致，SDF 在波數(shù)3 436 cm-1處吸收譜帶相對較寬，說明SDF 分子間氫鍵相互作用較強(qiáng)[23]。1 739 cm-1和1 614 cm-1左右的吸收峰是半纖維素C=O 收縮振動(dòng)產(chǎn)生，說明樣品中存在半乳糖醛酸[24]；1 244 cm-1處的尖峰是木質(zhì)素強(qiáng)組分的特征性彎曲或拉伸導(dǎo)致的；1 017 cm-1附近的吸收峰是纖維素和半纖維素的醚鍵C-O-C 和C-O-H中的O-H 變形振動(dòng)峰所致[25]；617 cm-1處是糖分子中β 型C-H 直立鍵的變角振動(dòng)產(chǎn)生的[26]。

圖9 沙棘果渣膳食纖維紅外光譜圖Fig.9 The infrared spectrum of dietary fibers from sea-buckthorn pomace

2.5 膳食纖維吸附能力

丙烯酰胺、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、NO2-及玉米赤霉烯酮均為食源性污染物，具有潛在的健康危害。而利用吸附劑進(jìn)行體內(nèi)吸附，可有效抑制危害物的吸收，減緩其體內(nèi)毒性。本試驗(yàn)結(jié)果表明，沙棘果渣膳食纖維對以上4 種危害物均具有一定的吸附能力。

由表6 可知，pH 2.0（胃環(huán)境）時(shí)膳食纖維對丙烯酰胺、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和NO2-的吸附能力顯著高于pH 7.0（腸環(huán)境），這與阮傳英等[27]、Horke等[28]和王志宏等[29]研究結(jié)果一致，說明膳食纖維對這3 種危害物的吸附主要發(fā)生在胃部。分析原因可能是酸性環(huán)境有利于膳食纖維吸附這3種危害物[30]。但膳食纖維對玉米赤霉烯酮在腸環(huán)境的吸附優(yōu)于胃環(huán)境，這可能是由于中性環(huán)境對玉米赤霉烯酮具有一定的破壞作用[31]。

表6 沙棘果渣膳食纖維吸附性能力Table 6 Adsorption capacity of dietary fibers from sea-buckthorn pomace

在相同pH 值情況下，不同種類膳食纖維對4種毒素的吸附能力也有明顯差異。其中，IDF 對丙烯酰胺和玉米赤霉烯酮的吸附能力顯著優(yōu)于SDF（P<0.05），這可能與IDF 的片層結(jié)構(gòu)有關(guān)[32]；而SDF 對NO2-和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的吸附能力顯著優(yōu)于IDF（P<0.05），可能是因?yàn)镾DF 的粒徑小，增加了分子間的吸引力所致[33]。

3 結(jié)論

本研究優(yōu)化超聲輔助酶解法提取沙棘果渣膳食纖維的最佳工藝條件是：液料比10∶1（mL/g）、pH 9.2、溫度48 ℃、蛋白酶添加量11.40%、超聲功率280 W、超聲時(shí)間40 min。此條件下TDF 得率為60.74%。3 種膳食纖維（TDF、IDF 和SDF）具有相似的糖類紅外特征吸收峰，而在微觀結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和功能性質(zhì)方面存在一定差異。SDF 粒徑較小、質(zhì)地緊密、表面附著較多的顆粒，有更好的膨脹性、陽離子交換能力和對NO2-、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的吸附能力；IDF 具有明顯的片層結(jié)構(gòu)，表面褶皺較多，表現(xiàn)出更好的持水性、持油性和對丙烯酰胺和玉米赤霉烯酮的吸附能力；TDF 塊狀較大，形狀不規(guī)則，表面褶皺較多，結(jié)構(gòu)相對蓬松，同時(shí)有小團(tuán)塊形成，由于IDF 是TDF 的主要成分，因此TDF 具有和IDF 相似的理化性質(zhì)和功能性質(zhì)。該研究結(jié)果可為沙棘果渣廢棄資源綜合利用和沙棘果渣膳食纖維功能研究提供理論依據(jù)。