朱凌,尹忠偉,黎歡,李志濤,朱莉,詹曉北

(教育部糖化學與生物技術(shù)重點實驗室,江南大學 生物工程學院,江蘇 無錫,214122)

不飽和脂肪酸是維持人體生存的必需營養(yǎng)物質(zhì)之一。Omega族不飽和脂肪酸屬于多不飽和脂肪酸,指含有2個或以上雙鍵且碳鏈長度為18～22個碳原子的直鏈脂肪酸。按第一個不飽和鍵位于甲基端的位置不同,分為omega-3和omega-6。二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)和二十碳四烯酸(arachidonic acid,AA)分別是omega-3和omega-6中具有代表性的物質(zhì)。DHA被稱為腦黃金,是腦細胞的重要組成部分,可參與神經(jīng)突觸形成,對嬰兒的腦發(fā)育具有重要意義[1]。具有維護腦和視網(wǎng)膜、延緩腦衰老、預防和治療心腦血管方面的疾病等多種生物學功能。AA廣泛存在于各種細胞中,通常被認為是半必需脂肪酸,但由于嬰兒合成AA的能力有限,所以在嬰兒時期AA被認為是必需脂肪酸。在細胞內(nèi)通過花生四烯酸級聯(lián),參與細胞的炎癥介導及信號傳遞[2]。AA作為細胞膜上部分磷酸甘油酯的組成部分,對于細胞膜的流動性有一定作用,故對大腦的發(fā)育也起著積極的作用。

人類腸道存在著一個復雜的微生物生態(tài)系統(tǒng),該系統(tǒng)由1 000多種微生物組成,總體豐度約為1014,是人體細胞的10倍,正常情況下與宿主處于相互平衡狀態(tài)[3]。一方面,它們可以為腸道細胞提供必需的營養(yǎng)物質(zhì),如維生素K,而腸道也為腸道細菌提供了良好的環(huán)境。另一方面,共生菌可以促進腸道屏障的完整,以抵御致病菌進入腸道黏膜,故良好的菌群宿主關(guān)系對于維持宿主與微生物區(qū)系的穩(wěn)態(tài)是至關(guān)重要的。一旦打破了這種平衡,將會導致一系列不良反應發(fā)生。腸道微生物的代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFAs)被認為是有益的,對于調(diào)節(jié)腸道菌群和作為健康狀態(tài)的指標有著重要的作用。已有研究顯示了乙酸在免疫調(diào)節(jié)方面的潛力[4],而丙酸可以促進阿克曼菌定植并緩解血管鈣化,修復腸黏膜損傷[5]。

仿生胃腸道反應器是體外研究消化的關(guān)鍵裝備,相較于燒杯厭氧管,其更接近人體真實情況。第一個體外模擬胃腸道的五級系統(tǒng)于1993年由MOLLY等[6]提出,采用5個玻璃套分別模擬小腸和大腸,并通過計算機控制消化液的流加、食糜轉(zhuǎn)運和檢測。隨后,DE BOEVER等[7]在此基礎(chǔ)上又對方法進行完善,使之成為了一個具有模擬人的胃、十二指腸、空腸、回腸、升結(jié)腸、橫結(jié)腸和降結(jié)腸的完整體外動態(tài)消化模型。另外,1999年荷蘭應用科學研究組織(Netherlands Organisation for Applied Scientific Research, TNO)營養(yǎng)與食品研究中心研發(fā)了一種新型的大腸環(huán)境模擬系統(tǒng)[8]。該系統(tǒng)將代謝物和水的去除與蠕動混合相結(jié)合,以獲得和處理微生物、干物質(zhì)和微生物代謝物的生理濃度?；谠摾碚摰奈改c道反應器已經(jīng)由TNO迭代到TIM-agc[9](TIM advanced gastric compartment),與其他TIM模型類似,其通過調(diào)節(jié)玻璃夾套和柔性膜之間空間中的水壓力來實現(xiàn)收縮。作為國際主流的商業(yè)類體外仿生反應器,TNO胃腸模型(TNO gastro-intestinal model, TIM)已被應用到食品醫(yī)療的各個方面。

使用體內(nèi)模型研究食藥品在體內(nèi)的消化過程往往存在周期長、成本高、可靠性差等缺點,因此使用體外消化模型已經(jīng)成為一種趨勢。體外消化模型分為靜態(tài)模型和動態(tài)模型。試管作為傳統(tǒng)的靜態(tài)模型無法在體外模擬剪切、混合和吸收過程,且油脂具有不溶的特性,無法對培養(yǎng)基均一化。而動態(tài)模型很好的解決了這一點。目前,DHA、AA的研究多集中在其對腦發(fā)育的關(guān)鍵性、防治心腦血管疾病等,有研究表明不同飽和度的脂肪酸可能對腸道菌群產(chǎn)生不同的影響[10],本研究對此展開研究。以期填補了不同飽和度及濃度的脂肪酸對健康人腸道微生物影響的研究空白,為利用脂肪酸調(diào)控腸道微生物促進人體健康提出了理論依據(jù)和可行性方案。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

DHA、花生四烯酸油脂,嘉必優(yōu)生物技術(shù)(武漢)股份有限公司;胡姬花花生油,益海嘉里金龍魚糧油食品股份有限公司;椰子油,菲律賓Kirkland Signature;聚乙烯醇1788,無錫市亞泰聯(lián)合化工有限公司;厭氧產(chǎn)氣袋,日本三菱瓦斯化學株式公社;膽汁鹽,美國Sigma-Aldrich公司;黏蛋白,上海麥克林生化科技股份有限公司;其他試劑,國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BGR-03體外仿生大腸反應器,無錫南源生物有限公司;HYQX-Ⅱ厭氧培養(yǎng)箱,上海躍進醫(yī)療器械有限公司;7890A氣相色譜儀,安捷倫科技有限公司;SBA-40E生物傳感儀,山東省科學院生物研究所。

1.3 乳液制作

其中,陽性對照采用混合飽和度的花生油,陰性對照采用純飽和脂肪酸椰子油,omega-3實驗組采用DHA,omega-6實驗組采用花生四烯酸油脂。以下各組簡稱為Peanut、Coco、DHA、AA。

1.4 乳液穩(wěn)定性

使用顯微鏡觀察和表觀觀察。

1.5 體外發(fā)酵設(shè)備及方法設(shè)計

1.5.1 仿生大腸反應器概述

實驗室自制的仿生大腸反應器從外觀、生理、功能相對完整地模擬了人體的大腸[12]。利用硅膠材料,制作了柔性的、具有良好延展性的、透明的仿生大腸膜。將其套在玻璃制成的套管上。利用37 ℃的恒溫水浴鍋持續(xù)向套管內(nèi)輸送穩(wěn)定水溫的壓力水。通過間斷控制上下產(chǎn)生的水壓差,使仿生大腸膜以一定的頻率蠕動,從而模擬了食糜在結(jié)腸中的狀態(tài)。且整個密閉空間呈無氧條件。此時如果使用新鮮的糞便中提取的腸道菌群加以定植,就較完全地模擬了結(jié)腸生理上的狀態(tài)。最后,在發(fā)酵過程中利用中空纖維濾膜模擬大腸的吸收,如SCFAs。

1.5.2 實驗設(shè)計

此外，高溫高濕天氣易引發(fā)水稻、玉米等作物病蟲害，各地要及時做好監(jiān)測和防治工作。云南等地需采取有效的田間管理措施，防范持續(xù)陰雨寡照對糧食作物和經(jīng)濟作物的不利影響。

圖1 體外仿生大腸反應器中發(fā)酵過程的時間線示意圖Fig.1 A schematic diagram of the fermentation process in an in vitro bionic gastrointestinal reactor

在此之前,我們招募了3名健康的6個月內(nèi)未接受抗生素治療的健康志愿者,均為江南大學學生,2女1男,身體質(zhì)量指數(shù)(body mass index,BMI)為(26.60±1.64) kg/m2,遵循正常的中國傳統(tǒng)飲食且無消化系統(tǒng)疾病。約定同一天,在≤3 h的間隔內(nèi)有序取新鮮糞便,存放在含有生物冰袋的厭氧產(chǎn)氣袋內(nèi)。之后分別稱取糞便樣品20 g,于厭氧箱中按1∶2(g∶mL)的比例加入PBS(0.1 mol/L,pH 7.0),攪拌均勻后用4層紗布過濾。取濾液用立式離心管每10 mL分裝。立即于液氮中速凍,制成標準糞菌懸液。存放于-40 ℃冰箱內(nèi)備用。

以下為反應器發(fā)酵的具體時期操作。

在定植期,模擬結(jié)腸液培養(yǎng)基是必要的,該培養(yǎng)基參考文獻[14]的方法,略有修改。該模擬結(jié)腸液培養(yǎng)基:1.2 g淀粉、0.2 g阿拉伯半乳糖、0.4 g果膠、0.2 g木聚糖、0.6 g酵母提取物、0.2 g胰蛋白胨、0.4 g黏蛋白、0.1 gL-半胱氨酸、0.2 g KCl、0.9 g NaCl、0.1 g K2HPO4、0.1 g KH2PO4、0.1 g CaCl2·2H2O、0.002 g MgSO4·7H2O、0.001 g FeSO4·7H2O、0.005 g氯化血紅素、0.08 g膽汁鹽、0.2 mL吐溫-80、1.0 mL維生素混合液,200 mL水。調(diào)pH至5.8。分別加入DHA、AA、花生油、椰子油,紫外燈過夜滅菌后泵入仿生大腸反應器中。之后以10%的接種量取凍藏的糞菌液于37 ℃水浴鍋中孵育30 min,酒精燈旁通過魯爾接頭打入罐體,設(shè)定pH低于5.8自動補堿。

20 h后待碳源消耗完畢,進入饑餓期,該階段持續(xù)4 h,使菌體生長狀態(tài)保持一致。

饑餓期結(jié)束后進入實驗控制期,通過魯爾接頭用無菌針管抽取發(fā)酵液40 mL,模擬營養(yǎng)物質(zhì)的吸收及取樣(記為t=0,n=3)并立刻通入40 mL新鮮的含不同濃度實驗物的模擬結(jié)腸液培養(yǎng)基。-40 ℃冰箱凍存?zhèn)溆?。之后?2 h重復上述步驟,直至控制期結(jié)束。

1.6 SCFAs測定

通過使用GC分析SCFAs產(chǎn)量,包括乙酸、丙酸和丁酸。將1 mL發(fā)酵液的上清液轉(zhuǎn)移至新的Eppendorf離心管中。將約250 μL HCl和1 mL乙醚添加至上清液,以1 mmol/L(終濃度)2-甲基丁酸作為內(nèi)標,并將試管渦旋3 min。收集上層的有機組分并用Na2SO4脫水,收集上清液并使其通過0.22 μm孔徑的過濾器。使用HP-INNOWAX色譜柱。烘箱溫度60 ℃,并在4 min內(nèi)升至190 ℃。進樣器溫度220 ℃,檢測器溫度250 ℃。將5 μL樣品以1∶20的分流比注入GC儀器,氮氣用作載氣,流速1.5 mL/min。根據(jù)內(nèi)標法計算乙酸、丙酸和丁酸含量[15]。

1.7 16S rRNA擴增子測序

16S rRNA基因是一個單一的遺傳位點。它全長1 500 bp,9個可變區(qū)分布在10個保守區(qū)之間。對可變區(qū)V3～V4測序以評估種群內(nèi)的多樣性,并比較相似樣本之間的相對豐度。

使用PowerFecal?DNA Isolation Kit分別提取48 h后的花生油、DHA、AA、椰子油及0 h空白組的基因組DNA。對提取的DNA采用341F、806R進行擴增,在引物的5′端連接上overhang序列,以便MiSeq使用[16]。待Takara Clontech制得擴增后的PCR產(chǎn)物后,使用Nextera XT Index Kit制備文庫。將制備好得文庫使用qPCR進行定量純化,合格后Illumina NovaSeq上機對文庫進行雙末端測序。測序得到的reads使用DADA2進行降噪,并使用過濾器除去豐度低于5的序列,得到ASV表。使用QIIME2進行注釋后使用。

1.8 數(shù)據(jù)處理

上述實驗均獨立重復3次,采用SPSS 22軟件進行雙因素方差分析(two-way ANOVA),采用Tukey法進行多重比較,P<0.05為差異顯著。豐度堆積圖及聚類熱圖采用R語言,ggplot2、ggpubr及ComplexHeatmap包[17]制作,其余均使用GraphPad Prism9制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳液穩(wěn)定性

乳液的穩(wěn)定性由多種因素決定。常見物理化學因素均會導致乳濁液加速崩解。由于實驗中各項理化指數(shù)保持相對穩(wěn)定(如溫度37 ℃,pH保持在5.8),且實驗中含脂肪酸的階段會持續(xù)48 h,期望乳液在48 h內(nèi)可以緩慢的走向相對不穩(wěn)定狀態(tài)。故對48 h內(nèi)的DHA、AA、花生油、椰子油進行簡單的顯微鏡觀察。如圖2所示,4種油脂在0 h時候,無分層現(xiàn)象,且在微觀觀察下分布也較為均一;24 h時,未觀察到分層現(xiàn)象,光學顯微鏡觀察也較為均一;48 h時,觀察到較微弱的分層現(xiàn)象,并且明顯觀察到乳液液滴增大,出現(xiàn)了液滴合并現(xiàn)象。整個乳濁液已經(jīng)不再穩(wěn)定。

圖2 發(fā)酵時間對乳液微觀結(jié)構(gòu)的影響Fig.2 Effect of fermentation time on microstructure of emulsion

2.2 SCFAs

SCFAs是評估腸道菌群發(fā)酵結(jié)果的重要指標。乙酸、丙酸及丁酸占據(jù)了人體腸道總體SCFAs含量的83%,其主要來源于產(chǎn)SCFAs菌,如產(chǎn)丁酸菌、產(chǎn)丙酸菌等[18]。SCFAs是重要的營養(yǎng)能量物質(zhì),SCFAs的生成會被腸道上皮細胞快速吸收。并且SCFAs通過多種局部效應改善腸道健康,包括維持腸道屏障完整性、黏液生成、防止炎癥以及降低結(jié)直腸癌風險[19]。

本研究評估了不同濃度、不同飽和度的脂肪酸對糞菌發(fā)酵過程中SCFAs產(chǎn)量的影響,測定了以花生油、DHA、AA、椰子油,含量分別為1、2、3 mL/L糞菌發(fā)酵過程中48 h的SCFAs濃度。

2 mL/L的DHA、AA每日攝入被認為是合理的。乙酸已被證明可以通過減少IL-1β、IL-6和TNF-α的表達以及p38 MAPK、JNK和NF-κB的磷酸化來減少炎癥信號,同時可被循環(huán)系統(tǒng)轉(zhuǎn)運,為腦、肝提供能量[20]。如圖3-a所示,在2 mL/L條件下,實驗組DHA具有最高的乙酸生成量,陰性對照椰子油具有最低的乙酸生產(chǎn)量,分別為68.36 mmol/L和15.34 mmol/L。DHA組較陽性對照花生油高11.48%,較實驗組AA高45.23%,是陰性對照的4.45倍。雖然2 mL/L下DHA和花生油差異不顯著,但DHA、AA、椰子油之間差異顯著(P<0.05)。丙酸能改善炎癥,減輕高血壓心血管損傷[21],如圖3-b所示,在2 mL/L條件下,陽性對照花生油具有最高的丙酸生成量,陰性對照椰子油具有最低的丙酸生成量,分別為7.80 mmol/L和4.17 mmol/L。2 mL/L下花生油丙酸生成量與DHA丙酸有顯著差異(P<0.05),兩對照組的丙酸生成量較為接近,但花生油組比AA及椰子油高了32.77%和50.59%。丁酸可以協(xié)調(diào)腸上皮和免疫細胞間的相互作用,增加腸道內(nèi)IgA的生成并且可以減少大腸桿菌的黏膜定植[22]。如圖3-c所示,2 mL/L條件下,DHA、AA組的丁酸生成量明顯高于其他兩組,DHA組較花生油組的丁酸生成量高39.81%,較椰子油組高104.03%。

a-乙酸濃度;b-丙酸濃度;c-丁酸濃度;d-總酸濃度圖3 使用不同含量、不同飽和度油脂發(fā)酵腸道菌群的SCFAs濃度Fig.3 Concentration of SCFAs fermented with oils of different saturation and contents

隨著DHA含量的升高,乙酸生成量先升高再降低,丙酸的生成量有小幅度的降低,分別為乙酸54.79、68.36、60.50 mmol/L,丙酸8.34、7.68、7.52 mmol /L,而丁酸有較高幅度的提升。

在發(fā)酵48 h時,AA的添加使得丙酸、丁酸的含量相對的減少。DHA的添加顯著的提升了SCFAs的含量,尤其是丁酸的含量,并且隨著質(zhì)量濃度的增加,丁酸的增加越多。另外2 mL/L的DHA添加相較與1 mL/L和3 mL/L組,提升的乙酸含量最多。DHA的添加,發(fā)酵過程中少量的增加了丙酸的含量,但隨著DHA添加量的增加,丙酸含量的增加逐漸下降。飽和脂肪的攝入大大的減少了乙酸和丙酸的產(chǎn)生,可能對產(chǎn)乙酸丙酸菌有抑制作用。而對乙酸的產(chǎn)生幾乎沒有幫助。

2.3 腸道菌群

圖4為發(fā)酵48 h后的花生油、DHA、AA、椰子油及0 h空白組的門水平豐度堆積圖。

圖4 48 h后不同濃度、飽和度油脂發(fā)酵的腸道菌群在門水平上的相對豐度堆積圖Fig.4 The intestinal bacteria after 48 h with different concentrations and saturations of the intestinal bacteria after 48 h stacked at the phylum level

總的來說,經(jīng)過48 h的發(fā)酵,以變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidota)、放線菌門(Actinobacteriota)及酸桿菌門(Acidobacteriota)占據(jù)了整體豐度的幾乎96%以上。國內(nèi)外達成共識的一點是,在高脂肪飲食中,變形菌門與厚壁菌門的比例會有顯著升高[23]。在本研究中無論是不飽和油脂或是飽和油脂均表現(xiàn)出了這一特性。尤其在純飽和脂肪酸的椰子油中,在3 mL/L組變形菌門與厚壁菌門比例達到7.78。變形菌門的異常擴增被認為是不正常的,它打破了腸道菌群的穩(wěn)態(tài),使得整個腸道菌群趨向失衡,并且潛在可能誘發(fā)如肥胖病、2型糖尿病在內(nèi)的多種疾病[24]。盡管隨著添加量的增加,AA、花生油、椰子油均表現(xiàn)出了變形菌的增加,而DHA組并沒有增加,反而呈現(xiàn)出略微下降,HEREU等[25]認為DHA的攝入可以調(diào)節(jié)腸道菌群,修復腸道屏障。在本實驗中DHA的攝入穩(wěn)定了變形菌門和厚壁菌門的比例,調(diào)節(jié)了腸道菌群,使得整體保持穩(wěn)定。

為了解不同飽和度、不同含量的脂肪酸對腸道菌群變化的影響,將各組的ASV表制成熱圖(圖5)。椰子油組和其他不飽和組形成了截然不同的2塊區(qū)域。其中,椰子油表現(xiàn)出明顯的巨球型菌屬(Megasphaera)、Muribaculaceae、嚴格梭菌屬(Clostridium_sensu_stricto_1)、羅姆布茨菌屬(Romboutsia)、克雷伯菌屬(Klebsiella)、志賀氏菌屬(Escherichia-Shigella)的上調(diào)。巨球型菌屬被認為可能是亞洲人群的特征[26],但也有相關(guān)報道表明巨球型菌屬與潰瘍性結(jié)腸炎、注意力缺陷等呈正相關(guān)。克雷伯氏菌在免疫力正常的人群中幾乎沒有破壞力,且不會出現(xiàn)豐度的過度增長,而當腸道菌群紊亂的時候,可引發(fā)多種疾病,特別是腹瀉、腹膜炎和軟組織感染。免疫能力正常的人類,100個志賀氏菌就足以導致感染,志賀氏菌通常會侵入結(jié)腸上皮細胞的內(nèi)層,引起嚴重的炎癥和結(jié)腸內(nèi)層細胞死亡。可導致痢疾的發(fā)生。而DHA含量高(3 mL/L)時,表現(xiàn)出不動桿菌屬(Agathobacter)、紡錘鏈桿屬(Fusicatenibacter)、殺雄菌屬(Arsenophonus)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)明顯增加;不動桿菌屬為丁酸產(chǎn)生菌,這與SCFAs中含量高的DHA丁酸生成量高一致;殺雄菌屬一般是昆蟲共生菌,此處可能與ASV閾值有關(guān);雙歧桿菌屬中有部分被認為是益生菌,它們廣泛存在于結(jié)腸黏膜,在人體中有至關(guān)重要的作用,幫助人體消化并抑制抵御其他致病菌。AA含量為1、2 mL/L時,花生油含量為1 mL/L時表現(xiàn)出乳桿菌屬(Lactobacillus)、CAG-352、經(jīng)黏液真桿菌屬(Blautia)較明顯增加。乳酸菌是常見的益生菌之一,它可以幫助治療腹瀉、陰道感染和濕疹等皮膚疾病。

圖5 48 h后不同濃度、飽和度油脂發(fā)酵的腸道菌群在屬水平上的聚類熱圖Fig.5 Cluster heatmap of intestinal flora after 48 h fermentation of oil with different content and saturation注:第一個字母D表示DHA,A表示AA,P表示花生油,C表示椰子油;第二個字母H表示高含量(3 mL/L), M表示中含量(2 mL/L), L表示低含量(1 mL/L)。

3 結(jié)論

本研究以花生油、DHA、AA、椰子油為研究對象,探究了不同飽和度的脂肪酸在體外仿生大腸反應器中,對腸道菌群及代謝物生成的影響。這項工作首先克服了傳統(tǒng)靜態(tài)發(fā)酵存在的無法較好的利用油脂的問題,利用聚乙烯醇1788對實驗用的油脂進行乳化,再利用仿生大腸反應器進行動態(tài)發(fā)酵。結(jié)果表明不飽和度對腸道菌群及代謝物有影響,具體表現(xiàn)在,omega-3不飽和度的DHA攝入穩(wěn)定了整體腸道菌群結(jié)構(gòu),并在局部上增加了不動桿菌屬和雙歧桿菌屬等有益菌屬豐度,omega-6不飽和度的AA攝入增加了乳桿菌屬、經(jīng)黏液真桿菌屬等豐度,而飽和的椰子油上調(diào)了志賀氏菌屬、克雷伯菌屬等有害菌屬的豐度。在代謝物水平上,omega-3不飽和DHA的攝入極大的提高了乙酸、丙酸及丁酸的含量,omega-6不飽和度的AA次之。而飽和脂肪酸椰子油抑制它們的生成。綜上,低飽和度的油脂對健康人的腸道菌群的組成和相關(guān)代謝有正向作用。