陸燕 韓敏 孟立平

隨著醫(yī)療技術(shù)水平的提高，化療藥物以及新型靶向藥物的問世，惡性腫瘤患者長期存活率不斷提升。但是，抗腫瘤藥物是一把雙刃劍，在殺傷腫瘤細胞的同時，也會損傷自身的組織細胞，特別是心臟細胞。心血管疾病現(xiàn)在已經(jīng)成為長期生存的癌癥患者的第二大死亡原因。如何減輕腫瘤藥物的心臟毒性，是腫瘤科醫(yī)師和心血管醫(yī)師當下共同面對的挑戰(zhàn)。阿霉素（doxorubicin，Dox）是目前廣泛應用的抗腫瘤藥物之一，可有效抑制腫瘤細胞的生長，同時也是公認可以引起心臟毒性的藥物。心臟纖維化導致的心臟重構(gòu)是Dox 心臟毒性作用發(fā)生過程中的關鍵一步，而心臟成纖維細胞是誘導纖維化的主要原因。然而，目前尚未發(fā)現(xiàn)可有效抑制Dox 心臟毒性的藥物。黃酒多酚（yellow wine polyphenolic compounds，YWPC）不僅能抑制同型半胱氨酸誘導的血管平滑肌細胞遷移和增殖，還能抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinases-2，MMP-2）的表達，減緩高脂飲食誘導小鼠的動脈粥樣硬化斑塊形成[1-2]。此外，本團隊前期研究發(fā)現(xiàn)YWPC 可以降低Dox 的大鼠心臟毒性作用[3]。本研究旨在探索YWPC 對Dox 心臟毒性的保護作用及其可能機制。

1 材料和方法

1.1 材料 （1）實驗動物：Wistar大鼠32只，180～220 g，購自浙江省動物研究中心。（2）實驗試劑：YWPC 從黃酒中提?。ㄓ缮虾Ｖ兴幹扑幖夹g(shù)有限公司，國家中藥制藥工程技術(shù)研究中心提供），具體操作步驟參照文獻[4]，YWPC 為白色粉末狀，溶解于無菌水（YWPC 1 g溶解于1 000 mL 無菌水）后按照30 mg/kg 給大鼠灌胃（200 g 體重大鼠灌胃6 mL）；Dox 粉劑購自美國Sigma公司，溶解于無菌水（1 g Dox 溶解于1 000 mL 無菌水）后按照3 mg/kg 腹腔注射（200 g 體重大鼠腹腔注射0.6 mL）；過氧化物酶體增殖物激活受體-γ（peroxisome proliferator activated receptor-γ，PPAR-γ）拮抗劑GW9662 購自美國Sigma 公司，溶解于無菌水（1 g GW9662 溶解于1 000 mL 無菌水）后按照1 mg/kg 腹腔注射（200 g 體重大鼠腹腔注射0.2 mL）。兔抗鼠肌動蛋白α（smooth muscle actin α，SMα）（ab128857）、轉(zhuǎn)錄因子21（transcription factor 21，Tcf21）（ab182134）、MMP-2（ab256748）、PPAR-γ（ab310323）單克隆抗體購自美國ABCOM 公司；辣根過氧化酶標記的羊抗兔或者羊抗鼠二抗以及蛋白免疫印跡相關試劑購自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所。本研究經(jīng)浙江大學實驗動物福利倫理審查委員會審查通過（批準文號：11883）。

1.2 方法

1.2.1 分組及干預 將32 只Wistar 大鼠飼養(yǎng)1 周后，按隨機數(shù)字表法分為對照組、Dox 組、Dox+YWPC 組、Dox+YWPC+GW9662 組，每組各8 只。對照組大鼠不做處理，僅給予正常飲食；Dox 組大鼠在正常飲食基礎上每2 d 腹腔注射1 次Dox 3 mg/kg；Dox+YWPC 組大鼠在正常飲食和腹腔注射Dox 的基礎上，同時每天灌胃YWPC 30 mg/kg[4]；Dox+YWPC+GW9662 組大鼠在正常飲食、腹腔注射Dox、YWPC 灌胃的基礎上，在Dox 治療前30 min 腹腔注射GW9662 1 mg/kg。所有大鼠干預4周，均飼養(yǎng)在黑暗的房間里，12 h 光照和12 h 黑暗循環(huán)，嚴密監(jiān)測各組大鼠的健康狀況和活動情況，以及液體攝入量和食物攝入量，每周監(jiān)測體重。

1.2.2 心功能檢測 干預4 周后，將各組大鼠腹腔注射氯胺酮75 mg/kg 麻醉后使用實驗動物心電圖機記錄心電圖檢查結(jié)果，并根據(jù)心電圖示蹤計算心率。使用Philips iE33 系統(tǒng)（荷蘭Philips Medical 公司）行心臟超聲檢查評估心臟結(jié)構(gòu)和功能，測定左心室縮短分數(shù)（left ventricular fractional shortening，LVFS）和左心室射血分數(shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）評價左心室收縮功能，檢測舒張早期二尖瓣峰值流速（E）和心房收縮（A），計算E/A 比值。測量連續(xù)3 個心臟周期后取平均值。實驗重復3 次。

1.2.3 心臟纖維化程度檢測 干預4 周后，采用頸椎脫臼法處死大鼠，取出完整心臟，部分心臟組織用10%甲醛固定，石蠟包埋，切成5 μm 薄片，進行HE 染色和Masson 染色檢測大鼠心臟纖維化程度，使用Image-Pro Plus 6（美國Media Cybernetics 公司）軟件計算心臟纖維化程度，結(jié)果以百分比表示。

1.2.4 心肌細胞超微結(jié)構(gòu)檢測 上述1.2.3 方法取出的部分心臟組織用PBS 清洗。用眼剪低溫切左心室心肌成直徑1 mm×1 mm 的組織，固定、浸泡、逐步乙醇脫水、置換、包埋、聚合、切片、染色后記錄圖像，采用電鏡（日本日立公司，型號：JEM-2000EX）觀察心肌細胞超微結(jié)構(gòu)變化。實驗重復3 次。

1.2.5 心臟成纖維細胞中PPAR-γ 表達的檢測 采用免疫組化法。上述1.2.3方法獲取的薄片使用抗PPARγ 抗體（1∶100）進行免疫組化染色。薄片用蘇木精反染色，顯微鏡（德國萊卡公司，型號：DM3000）下成像，用Image pro-Plus 6 軟件分析PPAR-γ 在各組大鼠心臟成纖維細胞中的表達和分布情況。實驗重復3次。

1.2.6 心臟成纖維細胞中SMα、Tcf21、MMP-2 和PPAR-γ 表達的檢測 采用Western blot 法。將1.2.3取出的部分心臟組織勻漿后，4 ℃、13 000 r/min 離心5 min。 然后用BCA 法檢測上清液中蛋白質(zhì)的濃度。將上清液與5×SDS 樣品緩沖液混合，在沸水浴中加熱5 min，使蛋白變性。之后將變性蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，與SMα、Tcf21、MMP-2 和PPAR-γ 一抗（1∶1 000）在4 ℃孵育過夜。用TBS-T 沖洗膜3 次，10 min/次，室溫下在辣根過氧化物酶標志的二抗（1∶5 000）中孵育1 h。信號由Immobilon Western chemiluminescent HRP Substrate（Millipore）測定，以βactin 做參照。辣根過氧化物酶標記的二抗孵育后ECL化學發(fā)光法檢測目標蛋白。暗室柯達膠片顯影，Quantity one 軟件定量分析各組大鼠心臟成纖維細胞中SMα、Tcf21、MMP-2和PPAR-γ的表達情況。實驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 4 組大鼠心功能指標的比較 干預4 周后，與對照組比較，Dox 組大鼠心率增加，而LVEF、LVFS、E/A下降（均P＜0.05）。與Dox 組比較，Dox+YWPC 組大鼠心率降低，LVEF、LVFS、E/A 增加（均P＜0.05）。此外，與Dox+YWPC 組比較，Dox+YWPC+GW9662 組大鼠心率增加，而LVEF、LVFS、E/A 均下降（均P＜0.05），見表1；4 組大鼠心超檢查結(jié)果見圖1。

圖1 4 組大鼠心臟超聲檢查結(jié)果

表1 4 組大鼠心功能指標的比較

2.2 4 組大鼠心臟纖維化程度的比較 HE 染色顯示，對照組大鼠心臟成纖維細胞排列規(guī)則，Dox 組大鼠心臟成纖維細胞排列出現(xiàn)不規(guī)則，Dox+YWPC 組大鼠心臟成纖維細胞排列恢復規(guī)則，而GW9662 則減弱了YWPC 的作用，見圖2A（插頁）。Masson 染色顯示，與對照組比較，Dox 組大鼠心臟纖維化明顯，加入YWPC減弱了Dox 引起心臟纖維化的作用，同時，GW9662 可以逆轉(zhuǎn)YWPC 的作用，見圖2B（插頁）。電鏡檢查顯示，與對照組比較，Dox 組心肌細胞線粒體數(shù)量增加，肌絲排列紊亂；YWPC 可緩解Dox 引起的線粒體和肌絲變化，加入GW9662 后，YWPC 的作用被消除，見圖2C（插頁）。4 組大鼠心臟成纖維化程度比較見圖2D（插頁）。

圖2 4 組大鼠心臟組織HE 染色、Masson 染色、電鏡檢查結(jié)果（A：HE 染色結(jié)果，×20；B：Masson 染色結(jié)果，×20；C：電鏡檢查結(jié)果，×30 000；D：4 組大鼠心臟纖維化程度比較）

2.3 4 組大鼠心臟成纖維細胞中PPAR-γ 表達情況的比較 與對照組比較，Dox 組PPAR-γ 表達量減少（P＜0.05）；與Dox 組比較，Dox+YWPC 組PPAR-γ 表達量增加（P＜0.05）；與Dox+YWPC 組比較，Dox+YWPC+GW9662 組大鼠心臟成纖維細胞中PPAR-γ 表達量降低（P＜0.05）。見圖3。

圖3 4 組大鼠心臟成纖維細胞中PPAR-γ 的表達及分布（A：4 組大鼠中PPAR-γ 表達的電泳圖；B：4 組大鼠中蛋白電泳檢測PPAR-γ 相對表達量比較；C：4 組大鼠中免疫組化檢測PPAR-γ 相對表達量比較；D：4 組大鼠中PPAR-γ 檢測的免疫組化染色結(jié)果，×20）

2.4 4 組大鼠心臟成纖維細胞中SMα、Tcf21 和MMP-2表達情況的比較 與對照組比較，Dox 組大鼠心臟組織中SMα、Tcf21 和MMP-2 的表達量增加（均P＜0.05）；與Dox 組比較，Dox+YWPC 組中SMα、Tcf21 和MMP-2 的表達量減少（均P＜0.05）；與Dox+YWPC 組比較，Dox+YWPC+GW9662 組中SMα、Tcf21 和MMP-2的表達量增加（均P＜0.05）。見圖4。

圖4 4 組大鼠心臟成纖維細胞中SMα、Tcf21 和MMP-2 的表達情況（A：4 組大鼠中SMα、Tcf21 和MMP-2 表達的電泳圖；B：4 組大鼠中SMα 相對表達量比較；C：4 組大鼠中Tcf21 相對表達量比較；D：4 組大鼠中MMP-2 相對表達量比較）

3 討論

與以往關注Dox 對心肌細胞損傷的研究不同，最近的一些研究表明Dox 對心臟成纖維細胞的影響也是其產(chǎn)生心臟毒性的關鍵步驟[5]。Mancilla 等[6]研究結(jié)果顯示Dox 通過誘導線粒體損傷，引起心臟成纖維細胞的線粒體自噬，最終產(chǎn)生心臟毒性。此外，Doroshow等[7]發(fā)現(xiàn)Dox 誘導的活性氧可促進心臟成纖維細胞凋亡。此外，Narikawa 等[8]發(fā)現(xiàn)Dox 可以增加人心臟成纖維細胞中MMP-1、IL-6、TGF-β 和膠原蛋白的表達。這些研究從心臟成纖維細胞的纖維化改變的角度提出了Dox 心臟毒性的潛在新機制。

在正常的心肌組織中，大多數(shù)構(gòu)成心臟網(wǎng)狀纖維結(jié)構(gòu)成纖維細胞處于靜止狀態(tài)。靜止的心臟成纖維細胞呈梭形，增殖和遷移能力較弱。在各種炎癥介質(zhì)、細胞因子、物理張力和其他病理因素刺激的作用下，靜止的心臟成纖維細胞被激活并轉(zhuǎn)化為活化的心臟成纖維細胞?；罨毎哂幸韵绿卣鳎海?）表達促炎和促纖維化因子水平升高，直接促進炎癥細胞浸潤和成纖維細胞增殖；（2）分泌高水平MMPs 促進成纖維細胞遷移；（3）促進膠原蛋白和其他細胞外基質(zhì)蛋白沉積，導致瘢痕形成；（4）表達SMα、Tcf21 和其他特異性標記蛋白。在病理因素刺激下，活化的心臟成纖維細胞大量增殖和遷移，并分泌MMP-2 等促進心臟重構(gòu)的蛋白酶，改變心臟的間質(zhì)結(jié)構(gòu)，最終導致心臟重構(gòu)。本研究結(jié)果表明，Dox 可以促進激活型心臟成纖維細胞標志物的表達，包括SMα、Tcf21 和MMP-2。這些結(jié)果表明，除了引起心肌細胞凋亡或焦亡外，心臟成纖維細胞的激活可能是Dox 心臟毒性的另一個關鍵機制。

流行病學研究表明，適量飲酒，尤其是紅酒，與某些心臟疾病的風險成反比。在前人對紅酒研究的基礎上，筆者團隊過去研究一直專注黃酒對心臟疾病的潛在保護作用。最早筆者團隊發(fā)現(xiàn)黃酒可顯著降低同型半胱氨酸誘導的大鼠血管平滑肌細胞中MMP-2的表達[9]。后續(xù)還證明了黃酒通過抑制低密度脂蛋白受體敲除小鼠中MMP-2 的表達和激活來改善動脈粥樣硬化斑塊[10]。黃酒是一種復雜的混合物，含有多種成分，包括多肽、低聚糖和YWPC 等多種對人體有益物質(zhì)，筆者團隊在前期研究中從黃酒中提取了上述成分，發(fā)現(xiàn)YWPC 和多肽在動物和細胞層面對冠心病都有保護作用[1,11]。之后的研究進一步證實YWPC 可以通過靶向雷帕霉素/P70S6K 通路的哺乳動物靶點抑制血管平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)化[11]。在上述研究結(jié)果的基礎上，本研究證明了YWPC 還具有預防Dox 心臟纖維化的作用，同時YWPC 可以降低Dox 誘導的心臟成纖維細胞激活。這可能是YWPC 防止Dox 產(chǎn)生心臟毒性的機制。

引起心臟成纖維細胞激活的機制過去已有不少報道。Tian 等[12]發(fā)現(xiàn)Anoctamin-1 通過atir 介導的MAPK 信號通路調(diào)節(jié)心臟成纖維細胞增殖。Miao 等[13]報道了Toll 樣受體/MyD88 信號通路參與心臟成纖維細胞遷移的調(diào)節(jié)。最近，Chen 等[14]也發(fā)現(xiàn)PPAR-γ 通過抑制瘦素下游信號STAT3 磷酸化在心肌纖維化和心肌重塑活性中發(fā)揮關鍵作用。PPAR 是配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子，分為3 個亞型，即α、β/δ 和γ。其中，PPAR-γ 在心肌重塑中具有多種藥理活性。例如，PPAR-γ 具有抗心臟纖維化作用，抑制局部血管緊張素Ⅱ誘導的瘦素自分泌活性，抑制心臟成纖維細胞增殖和遷移。本研究發(fā)現(xiàn)，Dox 處理的大鼠心臟成纖維細胞中PPAR-γ 被抑制，而YWPC 可以增加PPAR-γ 的表達。這些結(jié)果表明YWPC 可能是通過增加PPAR-γ的表達來抑制Dox 的心臟毒性。此外，在加入PPAR-γ拮抗劑GW9662 后，YWPC 對Dox 誘導的心臟成纖維細胞活化和心臟纖維化的保護作用消失，從另一個層面證明YWPC 可能是通過增加PPAR-γ 的表達來抑制Dox 的心臟毒性。

本研究發(fā)現(xiàn)，YWPC 可以抑制Dox 誘導的大鼠心臟成纖維細胞的激活和心臟纖維化，從而減緩Dox 的心臟毒性。YWPC 的心臟保護作用可能與其增加PPAR-γ 表達的能力有關。因此，筆者推測少量飲用黃酒可能可以減少Dox 的心臟毒性。本研究沒有進一步通過體外培養(yǎng)成纖維細胞來驗證YWPC 作用，是一大遺憾，有待今后再作努力。