林 曉，趙俊澤，周舒文，邱 琳

(1 常州大學質(zhì)量管理與評估中心，江蘇 常州 213164；2 常州大學藥學院，江蘇 常州 213164)

《教育部關(guān)于深化本科教育教學改革全面提高人才培養(yǎng)質(zhì)量的意見》指出，要強化科研育人功能，推動高效及時把最新科研成果轉(zhuǎn)化為教學內(nèi)容，激發(fā)學生專業(yè)學習興趣[1]。相比于傳統(tǒng)機械式的實驗教學，以教師的科研工作為基礎(chǔ)構(gòu)建的創(chuàng)新實驗項目更有利于科研反哺教學計劃的落實。在此過程中，學生由被動的接受者轉(zhuǎn)變?yōu)樽灾鳌皩W習研究和發(fā)展”的主體，不再抱著功利性的心態(tài)去完成實驗教學目標，而是嘗試著主動思考，及時拓寬知識面查缺補漏，用更加積極的態(tài)度面對并解決問題，真正做到學以致用[2-5]。

由獲得耐藥性或通過生物膜形成引起的抗生素耐藥性細菌感染愈發(fā)增加，為傷口感染治療帶來了巨大挑戰(zhàn)?；诩{米載藥系統(tǒng)負載靶向抗菌肽的治療方法，能夠逃避現(xiàn)有細菌獲得耐藥性的相關(guān)機制。此外，納米材料的獨特尺寸和物理性質(zhì)使它們能夠靶向穿透和破壞生物膜，克服頑固感染。本文以實現(xiàn)抗菌肽和納米材料在抗菌治療中的實際應用為目標，圍繞納米載藥系統(tǒng)的設(shè)計與合成展開研究工作。本文在筆者前期的科研工作基礎(chǔ)上設(shè)計了一個光熱增強的抗菌水凝膠用于體外抗菌活性研究的綜合性創(chuàng)新實驗。水凝膠富含的大量水分和類細胞外基質(zhì)(ECM)的三維網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)使其具有了“理想敷料”的大部分特征，包括維持傷口濕潤和氧交換，提供敏感組織的無粘合覆蓋，并以優(yōu)異的順應性減少傷口疼痛[6-8]。納米載藥系統(tǒng)是指納米載體為基礎(chǔ)，可以包封或負載藥物，粒徑分布在一到數(shù)百納米之間，可以將藥物高效遞送至病灶部位的藥物輸送系統(tǒng)，目前已在傷口感染、癌癥治療等領(lǐng)域被廣泛研究。納米載藥系統(tǒng)的核心目的是以最小的副作用達到治療部位所需的藥理作用，因此納米載藥系統(tǒng)的研發(fā)策略是以生物安全性為基礎(chǔ)，提高藥物分子的治療效果為方向，進行開發(fā)和優(yōu)化。泊洛沙姆(F127)是一種聚氧乙烯和聚氧丙烯醚的共嵌物，在水介質(zhì)中可自組裝形成水凝膠，此過程可由濃度和溫度控制[9]。金納米星(AuNs)是具有多分支尖端結(jié)構(gòu)的金納米顆粒，相較于其他形態(tài)，AuNs有更大的表面體積比，有利于進行藥物裝載。AuNs的分支尖端有利于磁場聚焦效應，表現(xiàn)為更高效的光熱轉(zhuǎn)化效率，同時具有良好的光穩(wěn)定性和生物安全性。

在本實驗中，首先將Cy7標記的抗菌肽(序列為GLFVDK-GKRWWKWWRRGC)和PEG-SH通過金硫鍵錨定在金納米星上，以提高納米材料整體的穩(wěn)定性和光熱抗菌活性。然后將其引入至F127水凝膠中進行包裹，利用抗菌肽固有的殺菌活性和Cy7與金納米星在近紅外光下優(yōu)異的光熱轉(zhuǎn)換能力，賦予水凝膠光熱增強的抗菌性能。該抗菌水凝膠作為新型敷料在細菌感染的傷口愈合方面具有潛在的應用價值。

1 實 驗

1.1 實驗試劑與儀器

試劑：化學修飾的α-氨基酸、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)、1-羥基苯并三唑(HOBt)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺(EDC)，吉爾生化有限公司；三異丙基硅烷(TIS)、N-乙基二異丙胺(DIEPA)、1，2-乙二硫醇(EDT)、三氟乙酸(TFA)、氫氧化鈉、巰基聚乙二醇(PEG-SH)，國藥基團化學試劑有限公司；H-Rink Amide ChemMatrix樹脂、4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、氯金酸，Sigma；Cy7，百靈威化學技術(shù)有限公司；金納米星(AuNS)是根據(jù)先前報道的方法進行合成[10]；胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(TSA)、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(TSB)，杭州微生物試劑有限公司；其余試劑均購自Adamas-Beta。

儀器：Shimadzu LC-8A高效液相色譜，日本島津；Tecnai G20透射電子顯微鏡，美國 FEI公司；ZS90 Malvern粒度儀，英國馬爾文；Synergy NEO酶標儀，美國伯騰公司；MDL-N-808-10W近紅外激光器，長春新產(chǎn)業(yè)光電技術(shù)有限公司；FOTRIC 220s熱像儀，蘇州科努德電子科技有限公司；Alpha 2-4 LSC basic冷凍干燥機，德國CHRIST；LRH-100恒溫細菌培養(yǎng)箱，上海葉拓；SW-CJ-2F超凈工作臺，素凈安泰；YCT-50A恒溫搖床，上海捷呈實驗儀器有限公司。

1.2 抗菌水凝膠的制備

1.2.1 Cy7標記的抗菌肽的合成

Cy7標記的抗菌肽GLFVDK(-Cy7)GKRWWKWWRRG-PLGVRGC(AMP-Cy7)是以ChemMatrix樹脂為載體，采用Fmoc固相合成法合成的[11-12]。該條多肽的側(cè)鏈引入了一個Mtt保護的賴氨酸氨基酸，多肽序列合成完畢后用切割液(1%的TFA溶于DCM中，并且添加5%的TIS)切除Mtt保護基團，暴露出氨基，稱取5倍多肽當量的Cy7和等摩爾比的EDC，DIEA，HOBt在DMF溶液中攪拌反應過夜，即可將Cy7標記其上。使用裂解液(TFA∶EDT∶TIS∶H2O=94∶2.5∶1∶2.5)浸泡樹脂3 h將多肽剝離，用冰乙醚沉淀后高速離心分離，洗滌三次。將最終的沉淀溶解于超純水中，采用半制備高效液相色譜純化，收集HPLC產(chǎn)物峰，凍干后得藍綠色抗菌肽粉末，其準確性由LC-MS確定。

1.2.2 納米金星的合成

實驗開始前，用現(xiàn)配制的王水(HNO3∶HCl=1∶3)徹底洗滌所有需要使用的容器，之后用雙蒸水反復沖洗。完成準備后，取1 g AuCl4·4H2O放入洗滌過的玻璃瓶中，加入100 mL超純水中，避光下渦旋，得到濃度為40 mM的氯金酸溶液，避光4 ℃保存。稱取3 g HEPES粉末，轉(zhuǎn)移至梨形瓶，使用5 mL移液器精確加入超純水85.2 mL，超聲下攪拌溶解，備用。稱取0.4 g NaOH，轉(zhuǎn)移至15 mL離心管，加入10 mL超純水，振蕩渦旋后得到濃度為1 mol/L的NaOH溶液，從中取出4.8 mL于HEPES溶液中，攪拌均勻。使用經(jīng)過校正的pH計對該混合溶液進行酸堿度測定，使用剩余NaOH溶液可少量逐滴加入，將溶液pH調(diào)至7.4左右，得到HEPES緩沖液。

精準吸取濃度為40 mM的氯金酸溶液1 350 μL，迅速滴加至上述HEPES緩沖液中，使用玻璃棒快速攪勻約5 s，溶液澄清透明，避光下靜置。45 min后反應結(jié)束，溶液呈紫黑色，分裝至離心管中，使用高速冷凍離心機，在室溫下13 000 rpm離心15 min。黑色沉淀附著于離心管壁上，除去淡藍色透明上清液，用超純水反復吹打并超聲，將附著在管壁的沉淀重懸，配平后在室溫下13 000 rpm離心15 min。重復操作2次，以完全去除HEPES緩沖液殘留。最終用5 mL超純水重懸各離心管中沉淀，收集后用超純水定容至10 mL，得到0.2 nM AuNs水溶液，避光下放入4 ℃冰箱密封保存。

1.2.3 AuNS-PEG-AMP(APA)的制備

APA是利用Au-S配位鍵的形成制得的。簡而言之，將500 μL的PEG-SH(1 mg/mL)加入10 mL AuNS(0.2 nM)中，室溫反應30 min后加入500 μL的AMP-Cy7(28 μM)，避光反應12 h。反應液離心后棄去上清，沉淀分散在超純水中進行進一步的應用。

1.2.4 復合抗菌凝膠(APA-F127)的制備

取不同濃度的APA水溶液2 mL，加入0.6 g的F127粉末充分攪拌，然后放置4 ℃冰箱中溶解過夜。由于F127具有顯著的溫敏性，即可隨溫度的變化進行溶膠—凝膠的相互轉(zhuǎn)換，因此將F127與APA的混合溶液置于室溫中即可形成復合抗菌水凝膠。

1.2.5 AuNs-PEG-AMPs納米顆粒水合粒徑和Zeta電位測定

啟動馬爾文粒度儀，預熱30 min。準備經(jīng)超純水稀釋后的AuNs、AuNs-PEG、AuNs-PEG-AMPs各2 mL，備用。超純水沖洗粒徑皿3次，吸取1 mL AuNs水溶液，放入粒徑皿中，輕微搖晃均勻，使納米顆粒完全分散，注意避免因搖晃產(chǎn)生氣泡，影響檢測結(jié)果。確認粒徑皿擺放方向，扣上皿蓋，小心插入樣品槽。運行Malvern工作站，測量溫度25 ℃，測量3次取平均值。重復上述操作，完成其余樣品粒徑測定。

超純水沖洗電位皿3次，吸取1 mL AuNs水溶液，放入電位皿中，避免皿中產(chǎn)生氣泡，插好皿塞，確認好電位皿擺放方向、外部電極無液體、電位皿中液面平衡。小心插入樣品槽。運行Malvern工作站，測量溫度25 ℃，平衡時間2 min，測量3次取平均值，重復上述操作，完成其余樣品Zeta電位測定。

1.2.6 AuNs-PEG-AMPs-Gel載藥系統(tǒng)流變學表征

準備濃度為2 nM的AuNs-PEG-AMPs-Gel 1 mL，啟動流變儀，將溫度測定范圍設(shè)置為0～50 ℃，頻率1 Hz，加熱速率為1 ℃/min。測量AuNs-PEG-AMPs-Gel在各溫度下的的儲能模量和損耗模量，以判斷成膠溫度，表征前AuNs-PEG-AMPs-Gel至少靜置24 h。

1.3 抗菌水凝膠的抗菌活性

1.3.1 細菌培養(yǎng)

選擇金黃色葡萄球菌(ATCC6538，G+)來檢測水凝膠的體外抗菌性能。將細菌在TSB中搖晃12 h(37 ℃，250 rpm)，傳代后進入對數(shù)生長期。通過測定菌液在600 nm處的光密度(OD)值來確定其濃度，當OD600為0.1時，金黃色葡萄球菌的對應濃度分別為2 × 108CFU/mL。

1.3.2 最小抑菌濃度(MIC)的測定

將200 μL含有不同濃度APA的水凝膠溶液添加到48孔板的孔中，在37 ℃下形成水凝膠。將10 μL預熱的細菌懸液(108CFU/mL)緩慢添加到水凝膠表面，PBS處理組作為陰性對照。在37 ℃下孵育4 h后，將預熱的TSB溶液添加到每個孔中重懸細菌，稀釋適當倍數(shù)后接種于TSA平板上，最后置于細菌培養(yǎng)箱中37 ℃孵育16 h。

1.3.3 生物膜的抑制

將處于對數(shù)生長期的金黃色葡萄球菌和含有1 nM APA的水凝膠加入96孔板中，光照組使用1.8 W/cm2的近紅外光照射6 min，PBS處理組為陰性對照，37 ℃共孵育48 h。結(jié)束后棄去上層培養(yǎng)基，用PBS輕輕洗去懸浮的細菌后加入1%(V/V)結(jié)晶紫乙醇溶液反應20 min。最后用PBS洗去多余的結(jié)晶紫溶液，底部殘留物用80%乙醇溶液溶解，測定其在590 nm處的吸光度。根據(jù)各組的吸光度評價生物膜的抑制效果。

2 結(jié)果與討論

2.1 APA納米粒子的制備與表征

圖1(a)給出了AMP-Cy7的質(zhì)譜圖，[M+4H]4+的m/z計算值為758.0，實測值為757.8；[M+5H]5+的m/z計算值為606.6，實測值為606.2，確認了AMP-Cy7的成功合成。圖1(b)的透射電鏡圖顯示了AuNS的形貌，其呈多個尖峰的星形結(jié)構(gòu)，分散均勻，粒徑主要維持在(50±2.1)nm，具有較高的比表面積。圖1(c)的Zeta電位顯示，AuNS表面帶負電荷，數(shù)值在-35 mV左右；當跟PEG-SH和AMP-Cy7結(jié)合后，導致其表面電荷中和與反轉(zhuǎn)，證明了APA納米粒子的成功合成。圖1(d)的紫外可見光譜中AuNS的局域表面等離子共振(LSPR)峰在與PEG-SH和AMP-Cy7結(jié)合后發(fā)生了紅移，同樣證明了APA納米粒子的成功制備。

圖1 APA納米粒子構(gòu)成組分的表征數(shù)據(jù)圖Fig.1 Characterization of the constituent components of APA nanoparticles

2.2 APA-F127復合抗菌水凝膠的合成及表征

圖2 抗菌水凝膠的物理性質(zhì)研究Fig.2 Physical properties of antibacterial hydrogels

流變學表征結(jié)果可以判斷溫敏型AuNs-PEG-AMPs-Gel載藥系統(tǒng)的成膠溫度。結(jié)果顯示，當溫度大于20 ℃后，儲能模量大于損耗模量，此時AuNs-PEG-AMPs-Gel載藥系統(tǒng)發(fā)生彈性形變，載藥系統(tǒng)變?yōu)楣虘B(tài)凝膠。而彈性模量小于儲能模量時，AuNs-PEG-AMPs-Gel載藥系統(tǒng)發(fā)生粘性形變，載藥系統(tǒng)為液態(tài)(圖2)。此結(jié)果表明，溫敏型AuNs-PEG-AMPs-Gel載藥系統(tǒng)制備成功，在20 ℃時，有形變?yōu)楣虘B(tài)水凝膠趨勢，成膠溫度低于人體表面溫度(約37 ℃)。

2.3 APA-F127復合抗菌水凝膠的殺菌性能研究

如圖3(a)所示，抗菌水凝膠對金黃色葡萄球菌的殺菌活性與包裹的APA濃度呈正相關(guān)，當APA的濃度僅為1 nM時便可殺滅50%的細菌，顯示出極其優(yōu)異的殺菌性能。此外，圖3(b)是抗菌水凝膠及附加光照后對金黃色葡萄球菌生物膜抑制的結(jié)晶紫染色圖像及相應吸光度。從圖中可以看出，1 nM APA濃度下的抗菌水凝膠對金黃色葡萄球菌生物膜也有顯著的抑制效果，并且在附加近紅外光照后進一步提升，最終抑制率高達80%以上。綜上所述，抗菌水凝膠具有優(yōu)良的體外殺菌活性，并可通過近紅外光的照射協(xié)同殺菌，起到很好的抑菌效果。

圖3 抗菌水凝膠的體外抗菌活性Fig.3 In vitro antibacterial activity of antibacterial hydrogels

3 結(jié) 論

本實驗將APA納米顆粒裝載到F127水凝膠中，通過抗菌肽固有殺菌活性和光熱劑在近紅外光照射下產(chǎn)生的熱量對細菌進行雙重殺傷，在體外抗菌實驗中顯示出優(yōu)異的殺菌效果，證明我們成功構(gòu)建了光熱增強的水凝膠殺菌平臺，并且作為傷口敷料具有進一步的臨床轉(zhuǎn)換價值。該實驗結(jié)合了有機化學、微生物學、分析化學、生物化學、儀器與分析等專業(yè)基礎(chǔ)理論知識，對學生的實驗操作技能和所學知識的運用提出了較高要求。在實驗實施的過程中，學生展現(xiàn)出飽滿的科研熱情和良好的團隊凝聚力，通過查閱文獻和反復實驗得到了理想的數(shù)據(jù)結(jié)果，深化所學知識的同時也提升了科研熱情。此創(chuàng)新實驗對學生綜合素質(zhì)的培養(yǎng)具有良好的促進作用。