杜秀芳 李建棣 顏詩白 李建軍 黃志廣 黨裔武 陳 罡 危丹明

1 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科,廣西南寧市 530021; 2 廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院普通外科

癌癥是中國及世界范圍內(nèi)的主要公共衛(wèi)生問題之一,中國癌癥的發(fā)生率和死亡率一直上升,已成為頭號(hào)死亡原因[1]。而肝膽胰惡性腫瘤占據(jù)主要位置,盡管醫(yī)療診治水平逐漸提高,但其死亡率仍居前列,預(yù)后極差[2]。盡管肝細(xì)胞癌、胰腺導(dǎo)管腺癌、膽囊癌及膽管癌已經(jīng)有相應(yīng)的診斷相關(guān)標(biāo)志物,但其敏感性和特異性相對(duì)較差。隨著對(duì)肝膽胰惡性腫瘤的深入研究,越來越多的基因調(diào)控和信號(hào)通路等分子機(jī)制被揭示,尋找新的診斷、預(yù)后標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)亟待進(jìn)行。

隨著轉(zhuǎn)錄組測序和全基因組技術(shù)的深入發(fā)展,越來越多的長鏈非編碼RNA(lncRNA)被發(fā)現(xiàn),并成為腫瘤研究的重要領(lǐng)域。lncRNA是長度從200個(gè)核苷酸到100個(gè)堿基的非編碼RNA,不同的RNA之間存在相互作用,lncRNA 通過控制基因表達(dá)參與了一系列與癌癥相關(guān)的生物學(xué)過程[3-5]。目前有部分文獻(xiàn)報(bào)道了LINC01140在非小細(xì)胞肺癌、骨肉瘤、轉(zhuǎn)移性肉瘤、腦膠質(zhì)瘤及乳腺癌中的表達(dá)情況及作用機(jī)制。然而不同報(bào)道,LINC01140的調(diào)控作用尚有差異,如在非小細(xì)胞肺癌、骨肉瘤、轉(zhuǎn)移性肉瘤及乳腺癌中發(fā)揮抑癌作用,在腦膠質(zhì)瘤及肺癌中發(fā)揮癌基因的作用,促進(jìn)癌癥的發(fā)生發(fā)展。然而在消化系統(tǒng)惡性腫瘤中LINC01140的差異表達(dá)及其作用差異表達(dá)miRNAs的靶向mRNAs預(yù)測未見報(bào)道。而膽囊、肝外膽管系統(tǒng)、肝及胰均起自胚胎第4周出現(xiàn)的中腸肝憩室[6],具有一定的相關(guān)聯(lián)系。本研究旨在研究分析肝膽胰惡性腫瘤(肝細(xì)胞癌、胰腺導(dǎo)管腺癌、膽囊癌、膽管癌)中LINC01140的表達(dá)及作用機(jī)制,為預(yù)后的生物標(biāo)志物或有效的治療靶點(diǎn)提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 肝膽胰癌中基因微陣列及高通量測序數(shù)據(jù)獲取及分析 從GEO、TCGA-GTEx、SRA、ArrayExpress數(shù)據(jù)庫及PubMed、Web of Science、中國知網(wǎng)、維普、萬方數(shù)據(jù)庫中檢索肝細(xì)胞癌、胰腺導(dǎo)管腺癌、膽囊癌、膽管癌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。納入數(shù)據(jù)集滿足以下條件:(1)人原發(fā)性肝細(xì)胞癌、胰腺導(dǎo)管腺癌、膽囊癌、膽管癌組織(若為miRNAs芯片也可納入體液樣本);(2)樣本量≥6。剔除重復(fù)樣本及缺乏對(duì)照的數(shù)據(jù)集。對(duì)納入數(shù)據(jù)集進(jìn)行平臺(tái)合并、批次效應(yīng)移除、數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理。所得矩陣即平臺(tái)表達(dá)矩陣。

1.2 預(yù)后分析 為評(píng)估LINC01140在肝膽胰癌患者中的預(yù)后性能,從Kaplan-Meier Plotter中收集肝細(xì)胞癌、胰腺導(dǎo)管腺癌、膽囊癌及膽管癌隊(duì)列研究預(yù)后資料(包含免疫治療隊(duì)列),分析LINC01140表達(dá)對(duì)患者總體生存期(Overall survival,OS)的影響。以LINC01140中位表達(dá)值為界,將患者分為LINC01140高表達(dá)組、LINC01140低表達(dá)組,利用Kaplan-Meier生存分析評(píng)估兩組間預(yù)后差異。

1.3 差異表達(dá)分析 分別利用上述移除批次效應(yīng)后平臺(tái)表達(dá)矩陣進(jìn)行基因差異表達(dá)分析。肝細(xì)胞癌、胰腺導(dǎo)管腺癌、膽囊癌及膽管癌差異表達(dá)mRNAs或差異表達(dá)miRNAs需滿足以下條件:(1)標(biāo)準(zhǔn)化平均差(Standardized mean difference,SMD)絕對(duì)值>0;(2)P值<0.05。

1.4 LINC01140靶向miRNAs預(yù)測分析 根據(jù)RNA相互作用百科全書在線預(yù)測LINC01140作用miRNAs。通過繪制韋恩圖對(duì)差異表達(dá)miRNAs及LINC01140靶向miRNAs進(jìn)行交集。對(duì)LINC01140作用差異表達(dá)miRNAs的靶向mRNAs進(jìn)行預(yù)測。

1.5 基因交集分析 鑒于miRNAs發(fā)揮功能得益于其基因調(diào)控作用,本研究通過繪制韋恩圖對(duì)肝細(xì)胞癌、胰腺導(dǎo)管腺癌、膽囊癌及膽管癌高表達(dá)基因、LINC01140作用miRNAs的靶向mRNAs進(jìn)行交集。對(duì)LINC01140、LINC01140作用差異表達(dá)miRNAs及其靶向mRNAs構(gòu)建ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1.6 基因功能注釋 對(duì)“基因交集分析”中的交集基因進(jìn)行基因本體(Gene Ontology,GO)—生物過程(Biological process,BP)、GO-細(xì)胞成分(Cellular component,CC)、GO-分子功能(Molecular function,MF)功能注釋,同時(shí)利用京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集初步分析肝膽胰癌中LINC01140-miRNA-mRNA調(diào)控軸的潛在分子生物學(xué)機(jī)制。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 在R、STATA統(tǒng)計(jì)軟件中進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。從上述批次后平臺(tái)表達(dá)矩陣提取LINC01140表達(dá)值,計(jì)算其例數(shù)、均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差,用隨機(jī)效應(yīng)模型計(jì)算其合并的SMD值。利用Egger檢驗(yàn)、漏斗圖評(píng)估發(fā)表偏倚。通過進(jìn)行亞組分析和敏感性分析探尋異質(zhì)性來源。繪制受試者工作特征(Receiver operating characteristic,ROC)曲線及匯總受試者工作特征(summary ROC,sROC)曲線,計(jì)算其曲線下面積(Area under the curve,AUC)、評(píng)估LINC01140對(duì)肝膽胰癌的區(qū)別能力,<0.7、0.7～<0.9、≥0.9分別提示區(qū)別能力較弱、中等、較強(qiáng)。計(jì)算敏感度、特異度、陽性似然比及陰性似然比。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LINC01140在肝膽胰癌組織中低表達(dá) 本研究基于平臺(tái)數(shù)據(jù)集,整合分析2 215例肝膽胰癌及1 679例周圍正常組織對(duì)照樣本中的LINC01140表達(dá)量,可見LINC01140在肝膽胰癌中低表達(dá)(P<0.01),其標(biāo)準(zhǔn)化均數(shù)差(SMD)值為-0.47[-0.76,-0.18],差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖1a)。經(jīng)漏斗圖分析未見明顯發(fā)表偏倚(見圖1b)。整合分析結(jié)果可靠,計(jì)算sROC曲線AUC為0.64[0.60,0.68](見圖1c),似然比、陽性似然比、陰性似然比森林圖結(jié)果提示LINC01140用于區(qū)分肝膽胰癌的準(zhǔn)確性欠佳(見圖1d、圖2)。

圖1 LINC01140在肝膽胰癌組織中顯著低表達(dá)

圖2 LINC01140低表達(dá)對(duì)肝膽胰癌組織的區(qū)分能力

2.2 LINC01140低表達(dá)在肝膽胰癌組織中的亞組分析 LINC01140肝膽胰癌中低表達(dá)(P<0.01),對(duì)其進(jìn)行亞組分析,分別肝細(xì)胞癌、膽囊癌及膽管癌、胰腺導(dǎo)管腺癌中低表達(dá)(見圖3)。其中在肝細(xì)胞癌中低表達(dá)(P<0.01),其SMD值為-0.60 [-1.06,-0.14],差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,計(jì)算sROC 曲線AUC 為 0.80 [0.76,0.83],見圖4a;在膽囊癌及膽管癌中低表達(dá)(P<0.01),其SMD值為-0.75[-1.59,0.09],差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義, 計(jì)算sROC 曲線AUC 為 0.91 [0.88,0.93] ,見圖4b;在胰腺導(dǎo)管腺癌中低表達(dá)(P=0.16),其SMD值為-0.08 [-0.25,0.08],具有低表達(dá)趨勢, 計(jì)算sROC 曲線AUC 為 0.60[0.55,0.64],見圖4c。

圖3 LINC01140低表達(dá)在肝膽胰癌組織中的亞組分析

圖4 INC01140低表達(dá)區(qū)分肝膽胰癌組織的sROC曲線a.肝細(xì)胞癌 b.膽管癌及膽囊癌 c.胰腺癌

2.3 LINC01140低表達(dá)在免疫治療隊(duì)列中的預(yù)后價(jià)值 基于LINC01140表達(dá)的肝膽胰癌患者Kaplan-Meier生存曲線,低表達(dá)患者總生存期明顯低于高表達(dá)患者[HR=0.61(0.52～0.73),P<0.001,見圖5a],無進(jìn)展生存期明顯低于高表達(dá)患者[HR=0.57(0.45～0.72),P<0.001,見圖5b],LINC01140低表達(dá)提示預(yù)后較差。

圖5 LINC01140低表達(dá)在免疫治療隊(duì)列中的預(yù)后價(jià)值a.總體生存期 b.無進(jìn)展生存期

2.4 探索肝膽胰癌LINC01140-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 經(jīng)過基因表達(dá)差異分析發(fā)現(xiàn)LINC01140作用的差異表達(dá)miRNAs 54個(gè),肝細(xì)胞癌中差異表達(dá)miRNAs 499個(gè),胰腺癌中差異表達(dá)miRNAs 397個(gè),其中hsa-miR-199a-3p、hsa-miR-382-3p、 hsa-miR-452-5p及hsa-miR-4677-3p參與肝膽胰癌中LINC01140調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(見圖6a、b)。取肝膽胰癌高表達(dá)基因與LINC01140作用miRNAs的靶向mRNAs交集,預(yù)測LINC01140作用差異表達(dá)miRNAs的靶向mRNAs 273個(gè)(見圖6c)。

圖6 LINC01140 ceRNA交集分析a.LINC01140作用的差異表達(dá)miRNAs b.LINC01140作用miRNAs統(tǒng)計(jì) c.肝膽胰癌高表達(dá)基因、LINC01140作用miRNAs靶向mRNAs交集

2.5 LINC01140-miRNA-mRNA調(diào)控軸GO富集分析及KEGG富集分析 LINC01140參與的ceRNA GO功能富集分析結(jié)果(見圖7a)顯示主要參與的生物過程(Biological processes, BP)包括細(xì)胞器組織的正向調(diào)節(jié)、有絲分裂細(xì)胞周期及細(xì)胞成分生物發(fā)生的正向調(diào)節(jié)等,同時(shí)細(xì)胞成分(Cell component,CC)主要富集在黏著斑、細(xì)胞—基質(zhì)連接及紡錘體等,而分子功能(Molecular function,MF)富集結(jié)果主要集中在泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、泛素蛋白連接酶結(jié)合及鈣粘蛋白結(jié)合等。KEGG功能富集分析結(jié)果顯示,根據(jù)富集程度排在前三位的信號(hào)通路分別為Salmonella infection、Focal adhesion及Hippo signaling pathway(見圖7b)。

圖7 LINC01140 ceRNA在肝膽胰癌中的潛在分子機(jī)制a.GO分類 b.KEGG通路

3 討論

消化道惡性腫瘤肝細(xì)胞癌、膽囊癌及膽管癌、胰腺導(dǎo)管腺癌早期起病隱匿,不易被發(fā)現(xiàn),病情進(jìn)展快,以手術(shù)切除為主要治療手段,然而通常晚期治療效果不佳,患者預(yù)后差。盡管肝細(xì)胞癌的分子和免疫治療已建立標(biāo)準(zhǔn)治療方案,早期射頻、中期肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)、晚期分子治療占據(jù)主導(dǎo)位置,但其治療效果仍然不佳[7]。晚期膽道癌一線治療的標(biāo)準(zhǔn)參考方案仍為吉西他濱聯(lián)合順鉑,然而免疫治療也具有一定的局限性[8]。雖然輔助治療可以為肝膽癌出現(xiàn)癥狀的晚期疾病患者提供較好的結(jié)果,但常規(guī)輔助化療和放射治療的作用機(jī)制尚不清楚[9]。胰腺導(dǎo)管腺癌以預(yù)后極差而著稱,且難以早期發(fā)現(xiàn),通常錯(cuò)過了最佳手術(shù)時(shí)期,然而即使當(dāng)腫瘤被及早發(fā)現(xiàn)時(shí),成功切除的患者,預(yù)后仍然嚴(yán)峻,估計(jì)中位總生存期(OS)不到23個(gè)月[10]。手術(shù)切除往往與化療和(或)放射治療相結(jié)合,然而這些方法能適度改善總體存活率,但它們對(duì)大多數(shù)人來說根本不是治愈的[11]。因此迫切需要探索治療肝膽胰癌的治療靶點(diǎn)及預(yù)后標(biāo)志物。

近年來,有文獻(xiàn)報(bào)道LINC01140在腫瘤組織中的調(diào)控作用及其機(jī)制。然而在尚未報(bào)道LINC01140在肝膽胰癌中的生物學(xué)作用及調(diào)控機(jī)制。本研究基于平臺(tái)數(shù)據(jù)集,整合分析2 215例肝膽胰癌及1 679例周圍正常組織對(duì)照樣本中的LINC01140表達(dá)量,證實(shí)了LINC01140在肝膽胰癌中低表達(dá),納入的樣本量更大、面更廣,對(duì)研究LINC01140表達(dá)的臨床意義有極大的補(bǔ)充。

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)LINC01140在轉(zhuǎn)移性肉瘤中的表達(dá)較低,預(yù)示著肉瘤的總體生存率、無病生存率和疾病特異性生存率較低[12]。LINC01140在乳腺癌患者腫瘤組織中低表達(dá),低表達(dá)患者預(yù)后不良[13]。這些研究表明LINC01140分別在轉(zhuǎn)移性肉瘤及乳腺癌中可能發(fā)揮抑癌作用,且低表達(dá)還提示預(yù)后不良。本研究中,基于LINC01140表達(dá)的肝膽胰癌患者Kaplan-Meier生存曲線分析,低表達(dá)患者總生存期明顯低于高表達(dá)患者,無進(jìn)展生存期明顯低于高表達(dá)患者,LINC01140低表達(dá)提示預(yù)后較差。同時(shí)推測LINC01140調(diào)控的hsa-miR-199a-3p、hsa-miR-382-3p、hsa-miR-452-5p及hsa-miR-4677-3p參與肝膽胰癌中LINC01140調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。hsa-miR-199a-3p是與肝癌相關(guān)的關(guān)鍵miRNAs,顯著上調(diào),且上調(diào)的核心調(diào)控通路與肝細(xì)胞癌通路相關(guān)[14-15]。相關(guān)研究表明,LINC01140調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用,如非小細(xì)胞肺癌中LINC01140表達(dá)下調(diào),通過海綿作用miR-4742-5p正向調(diào)節(jié)TACC1的表達(dá)[16]。LINC01140下調(diào)通過靶向miR-139-5p/HOXA9軸,抑制骨肉瘤細(xì)胞的侵襲、增殖和EMT[17]。LINC01140、miR140-5p和FGF9形成了一個(gè)lncRNA-miRNA-mRNA軸,它調(diào)節(jié)膀胱癌的表型,通過腫瘤微環(huán)境影響巨噬細(xì)胞M2極化,進(jìn)而影響膀胱癌細(xì)胞的侵襲性[18]。然而部分文獻(xiàn)報(bào)道其他腫瘤中LINC01140的生物學(xué)作用有一定的差異,LINC01140在腦膠質(zhì)瘤中表達(dá)增強(qiáng),通過調(diào)節(jié)miR199a-3p/ZHX1軸來促進(jìn)膠質(zhì)瘤的發(fā)展[19]。LINC01140在肺癌組織和細(xì)胞系中高表達(dá),LINC01140水平升高與肺癌患者的生存不良有關(guān)。LINC01140過表達(dá)可保護(hù)c-Myc和PD-L1mRNA免受miRNAs的抑制,促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和免疫逃逸[20]。結(jié)果提示LINC01140在不同腫瘤中可能發(fā)揮著不同的調(diào)控作用,然而其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)機(jī)制仍需進(jìn)一步的探索及驗(yàn)證。

眾所周知,細(xì)胞周期的異常調(diào)節(jié)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞無法控制的增殖,并發(fā)生各種癌癥,包括肝膽胰癌。然而,以前從未研究過確切的調(diào)控機(jī)制。在本項(xiàng)研究中,構(gòu)建LINC01140-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及富集分析,LINC01140參與有絲分裂細(xì)胞周期調(diào)節(jié),下調(diào)的LINC01140可能誘導(dǎo)細(xì)胞周期的異常調(diào)節(jié),在有絲分裂核分裂過程中,當(dāng)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化時(shí),有絲分裂基因容易被激活,這為癌細(xì)胞的增殖創(chuàng)造了有利條件。當(dāng)然還需要進(jìn)一步的研究來驗(yàn)證這些結(jié)論。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)LINC01140在肝膽胰癌中低表達(dá),可能發(fā)揮抑癌作用,低表達(dá)具有較差的預(yù)后,預(yù)示其可能成為肝膽胰癌的預(yù)后生物標(biāo)志物。在肝膽胰癌中LINC01140可能通過LINC01140-miRNA-mRNA來實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的調(diào)控,為肝膽胰癌患者靶向治療提供新思路。