董宏偉，涂清波

(南京中醫(yī)藥大學(xué)翰林學(xué)院，江蘇 泰州 225300)

肉桂(Cinnamomum cassia Presl)是樟科樟屬植物的一種常綠樹，具有較高的醫(yī)用和食用價(jià)值?！侗静菥V目》記載肉桂具有“補(bǔ)下焦不足，治沉寒痼冷之病，滲泄止渴，去榮衛(wèi)中風(fēng)寒，表虛自汗”等功效。我國是肉桂原產(chǎn)地和種植大國，國內(nèi)資源豐富及產(chǎn)量巨大。肉桂精油是從桂皮、桂枝、桂葉等部位提取的芳香味油狀液體?，F(xiàn)代藥理表明[1]，其具有抗氧化、抗炎、抗菌和抗癌等多種生物活性。中藥治療疾病存在多成分、多靶點(diǎn)、多通路同時(shí)作用的特性[2]。氧化應(yīng)激是一種生物體內(nèi)部產(chǎn)生的自由基和活性氧物質(zhì)引起的一系列有害生理過程[3]，會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)損傷、DNA斷裂等多種細(xì)胞損傷，進(jìn)而引起許多疾病，如心血管疾病、腫瘤等。肉桂精油的抗氧化作用明確，但其具體的作用機(jī)制研究還不夠清楚。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)適用于中藥復(fù)雜成分的解析和開發(fā)[4]，可對肉桂精油抗氧化的作用機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)全面的分析。本研究運(yùn)用氣質(zhì)聯(lián)用和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對肉桂精油活性成分、作用靶點(diǎn)、信號(hào)通路等進(jìn)行系統(tǒng)分析，初步探究肉桂精油的抗氧化機(jī)制，為其進(jìn)一步藥理研究和產(chǎn)品開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

桂皮粉為食品級(jí)，購自泰州市邦藍(lán)食品有限公司；甲醇為色譜級(jí)，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 肉桂精油化學(xué)成分分析

根據(jù)劉彤[5]等提取方法稍加修改，稱取 100 g 肉桂粉置于 1 L 燒瓶中，加入 600 mL 蒸餾水回流提取 2 h，收集得到肉桂精油。運(yùn)用氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)[6]。簡單地說，用色譜甲醇稀釋肉桂精油，經(jīng) 0.22 μm 微孔濾膜過濾后進(jìn)氣相色譜，色譜柱為HP-INNOWax polyethylene glycol(30 m×0.32 mm×0.25 μm)，載氣為氦氣，流速為 2.0 mL/min。設(shè)置 40 ℃ 開始保溫 2 min，5 ℃/min 升高至 240 ℃，保持 18 min，注射口溫度為 250 ℃，分流比為20∶1。電離源和傳輸線的溫度分別為230 ℃和250 ℃，離子能量為 70 eV，質(zhì)量范圍為40～400 Da。

1.3 肉桂精油活性成分對應(yīng)靶點(diǎn)的獲取

利用TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索肉桂精油主要化學(xué)成分的對應(yīng)靶點(diǎn)[7]，通過Pubchem數(shù)據(jù)庫，獲得主要成分的SMILE Name，并導(dǎo)入SWISS Taget Prediction數(shù)據(jù)庫中，獲取單個(gè)主要成分的Gene名。

1.4 肉桂精油抗氧化相關(guān)靶點(diǎn)的收集

在Genecards疾病數(shù)據(jù)庫中，以“Anti-oxidant”為關(guān)鍵詞，在Genecards數(shù)據(jù)庫中檢索并獲取對應(yīng)靶點(diǎn)[8]，從而獲得與抗氧化相關(guān)的靶點(diǎn)信息，去除重復(fù)值，匯總抗氧化的相關(guān)靶點(diǎn)。將藥物和疾病靶基因取交集，獲得兩者的共同靶點(diǎn)基因，繪制Venn圖。

1.5 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及可視化分析

將共同靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫[9]，得到蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，通過運(yùn)用Cytoscape軟件構(gòu)建“藥材-成分-靶點(diǎn)”可視化、多元素、多水平間的作用關(guān)系。網(wǎng)絡(luò)中各節(jié)點(diǎn)分別代表活性成分和關(guān)鍵靶點(diǎn)基因；網(wǎng)絡(luò)中邊用來連接活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)基因；連接到網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(diǎn)以度值為單位進(jìn)行表示。某節(jié)點(diǎn)與其他節(jié)點(diǎn)連接的邊數(shù)越多，則說明該節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中扮演的角色越重要，度值也越大。

1.6 GO與KEGG富集分析

對篩選得到的化合物對應(yīng)的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路富集分析[10]，GO富集分析選擇生物過程(BP)、分子功能(MF)和細(xì)胞組成(CC)3個(gè)模塊，通路分析選擇KEGG，設(shè)定p<0.05，選取物種為人類，通過KEGG分析可以得到肉桂抗氧化的潛在作用通路。

1.7 “活性成分-核心靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

將涉及的活性成分與通路及其相關(guān)靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape軟件得到“活性成分-核心靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)[11]，計(jì)算網(wǎng)絡(luò)中成分節(jié)點(diǎn)進(jìn)行拓?fù)浞治?，反向篩選肉桂精油抗氧化的有效成分及關(guān)鍵基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 肉桂精油化學(xué)成分分析

經(jīng)GC-MS和NIST標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫對比分析，肉桂精油的化學(xué)成分包含36個(gè)化學(xué)物質(zhì)(α-蒎烯、莰烯、1，2-二甲基-3-(1-甲基乙烯基)環(huán)戊烷、3，7，7-三甲基雙環(huán)[4.1.0]庚烷、鄰薄荷-8-烯、3-蒈烯、1，4-桉葉素、o-環(huán)己烯、D-檸檬、桉樹醇、苯甲醇、雙戊烯、1，3，3-三甲基雙環(huán)[2.2.1]庚烷-2-氧、2-(4-甲基苯基)丙-2-醇、反式-1-乙烯基-2-甲基環(huán)己烷、水楊酸甲酯、反式肉桂醛、9-甲氧基雙環(huán)[6.1.0]壬-2，4，6-三烯、巴倫西亞橘烯、2，3，4，7，8，8a-六氫-3，6，8，8-四甲基-1H-3a，7-亞甲基薁-5-甲醇、苯甲酸芐酯、N-(1-甲基乙基)-苯甲胺、鄰苯二甲酸二異丁酯、鄰苯二甲酸二丁酯、肉桂酸芐酯、[2-甲基-2-(4-甲基-3-戊烯基)環(huán)丙]-甲醇、α-紫羅蘭酮、甲位異丁酸松油酯、鳶尾酮、2，4，5-三甲基苯乙醛、(+)-3-蒈烯、環(huán)氧石竹烯、1R，4R-對-甲基-2，8-二烯-1-過氧化氫、1，2-二甲基-1，2-乙二醇、順-7-十四烯醛、(E)-6-十六碳烯-4-炔)，其中峰面積比大于1%的主要成分有5個(gè)，分別是反式肉桂醛(74.42%)、鄰苯二甲酸二丁酯(8.28%)、水楊酸甲酯(4.51%)和鄰苯二甲酸二異丁酯(4.05%)和鳶尾酮(1%)。

2.2 活性成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

肉桂精油36個(gè)化學(xué)成分對應(yīng)的潛在藥物靶點(diǎn)為185個(gè)。構(gòu)建的活性成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)如圖1所示，共有108個(gè)節(jié)點(diǎn)(91個(gè)基因靶點(diǎn)，1個(gè)中藥名稱節(jié)點(diǎn)和16個(gè)成分節(jié)點(diǎn))150條邊。根據(jù)自由度對活性成分進(jìn)行排序，主要活性成分分別是甲位異丁酸松油酯、鄰苯二甲酸二異丁酯、肉桂酸芐酯、α-紫羅蘭酮、反式肉桂醛。

圖1 藥物-成分-靶點(diǎn)相互作用圖(其中，黃色代表活性成分，藍(lán)色代表靶點(diǎn))

2.3 抗氧化靶點(diǎn)和核心靶點(diǎn)的獲取

將Genecards數(shù)據(jù)庫收集到的靶點(diǎn)合并去除重復(fù)后，得到肉桂精油成分靶點(diǎn)和抗氧化相關(guān)靶點(diǎn)的維恩圖如圖2所示，抗氧化的靶點(diǎn)有2038個(gè)，肉桂精油中活性成分對應(yīng)的靶點(diǎn)和抗氧化對應(yīng)的靶點(diǎn)的交集靶點(diǎn)有91個(gè)。

圖2 肉桂精油成分靶點(diǎn)和抗氧化相關(guān)靶點(diǎn)的維恩圖

2.4 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING據(jù)庫后，構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)如圖3a所示，其中抗氧化交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖中有91個(gè)節(jié)點(diǎn)，591條邊線組成。通過Cytoscape軟件中的Betweenness、Degree和Closeness算法依次取前50%篩選出肉桂抗氧化的核心靶點(diǎn)，如圖3b所示，肉桂活性成分中抗氧化的核心靶點(diǎn)有10個(gè)，分別為CASP3、PTGS2、EGFR、HIF1A、STAT3、TLR4、ESR1、APP、RELA、PPARA。

圖3 a：肉桂精油抗氧化核心靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)；b：肉桂精油活性成分靶點(diǎn)與靶點(diǎn)互相關(guān)系

2.5 關(guān)鍵靶點(diǎn)的GO功能注釋和KEGG通路富集分析

利用DAVID數(shù)據(jù)庫，對10個(gè)肉桂精油活性成分抗氧化靶點(diǎn)基因進(jìn)行GO和KEGG功能富集分析。GO注釋如圖4所示，富集BP、CC、MF、的富集條目一共有546個(gè)。其中BP的條目主要有379個(gè)，富集主要部位在細(xì)胞膜上，主要涉及細(xì)菌的免疫原性和致病性。CC的主要條目有60條，主要涉及細(xì)胞的代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，蛋白質(zhì)合成與折疊，物質(zhì)運(yùn)輸。MF主要條目有107條，主要涉及酶催化的速率、底物選擇性以及酶的穩(wěn)定性。經(jīng)KEGG通路富集分析，得到肉桂精油抗氧化的潛在作用通路共獲得132條通路，按P值按照降序排列，排名前十的信號(hào)通路制作氣泡圖，如圖5所示。氣泡點(diǎn)的大小表示相應(yīng)功能通路中靶基因的數(shù)量，富集度表示屬于該通路中所有被注釋基因的靶基因數(shù)量的比率。P值越低、顏色越紅代表KEGG富集程度更高。表明TNF、FoxO、C-type lectin receptor、PD-L1等信號(hào)通路在肉桂精油抗氧化中起主要作用，糖尿病性心肌病通路被認(rèn)為是一組關(guān)鍵通路。肉桂精油抗氧化的關(guān)鍵靶點(diǎn)富集在：多巴胺能突觸、糖尿病性心肌病、細(xì)胞凋亡、腫瘤壞死、生長激素缺乏癥等相關(guān)途徑和通路中。

圖4 肉桂精油抗氧化核心靶點(diǎn)的GO富集分析

圖5 肉桂精油抗氧化核心靶點(diǎn)的KEGG富集分析

2.6 成分-靶點(diǎn)-通路的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將核心靶點(diǎn)及其相關(guān)的活性成分與前20條通路及其相關(guān)靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape軟件。刪除16條重復(fù)得到“活性成分-核心靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)如圖6所示，該網(wǎng)絡(luò)包括192個(gè)節(jié)點(diǎn)(其中包括化合物16個(gè)，91個(gè)靶點(diǎn)，10個(gè)通路網(wǎng)絡(luò))267條邊。從通路角度來看，連接度較高的為hsa04728、hsa05415。從靶點(diǎn)角度分析篩選出6個(gè)DC≥10的靶點(diǎn)，分別為MAPK11、PIK3CA、CYP19A1、PIK3CA、MAPK14、MAPK10。從化合物角度來看，共篩選出5個(gè)主要化合物，分別為甲位異丁酸松油酯、鄰苯二甲酸二異丁酯、肉桂酸芐酯、α-紫羅蘭酮、反式肉桂醛。肉桂精油中存在多成分作用于一個(gè)靶點(diǎn)，成一個(gè)靶點(diǎn)作用于多個(gè)成分，也存在一條通路多個(gè)靶點(diǎn)，或不同通路同屬于一個(gè)靶點(diǎn)的現(xiàn)象，表明肉桂精油通過多成分、多靶點(diǎn)、多通路方式的抗氧化作用。

圖6 成分-核心靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)

3 結(jié)論

植物精油因其良好的生物活性、安全性、滲透性和生物降解性，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥化工、食品工業(yè)和化妝品行業(yè)中。本文運(yùn)用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，發(fā)現(xiàn)肉桂精油主要成分為36個(gè)，篩選出對應(yīng)靶點(diǎn)185個(gè)，疾病靶點(diǎn)2038個(gè)，共有靶點(diǎn)91個(gè)，涉及546個(gè)基因功能條目和132條通路。經(jīng)“活性成分-核心靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)分析，篩選出5種核心成分、6個(gè)核心靶點(diǎn)以及2個(gè)連接度較高的信號(hào)通路，說明肉桂精油可通過多種成分、多個(gè)靶點(diǎn)以及不同通路的來實(shí)現(xiàn)其抗氧化作用，初步探討了肉桂精油的抗氧化作用機(jī)制，為后續(xù)藥理研究和產(chǎn)品開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。