胡鑫童 凌佳怡 蘇秋弟 杜 婷 沈 宇 瞿秋霞 黃 沁（蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院，蘇州 215026）

全球妊娠期高血壓發(fā)病率為5%～10%，其中2%～5%妊娠合并子癇前期，全球每年約76 000多名女性和50 萬(wàn)名新生兒因該病死亡。子癇前期的發(fā)展原因及病理生理機(jī)制特點(diǎn)尚未闡明，可能發(fā)生機(jī)制和病理生理學(xué)特點(diǎn)包括很多種復(fù)雜因素，包括滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲不足、胎盤(pán)淺著床、子宮螺旋動(dòng)脈重鑄不良、血管內(nèi)皮損傷、免疫系統(tǒng)失衡導(dǎo)致過(guò)度炎癥反應(yīng)等［1-3］。研究表明子癇前期是一種免疫相關(guān)性疾病，機(jī)體呈現(xiàn)固有免疫和適應(yīng)性免疫過(guò)度激活，其發(fā)病與母體免疫失衡密切相關(guān)［4-8］。CD4+T淋巴細(xì)胞在妊娠期健康免疫環(huán)境建立中的研究已引起普遍重視，CD4+T淋巴細(xì)胞中Treg細(xì)胞群對(duì)其他效應(yīng)T細(xì)胞（Foxp3-CD4+T 細(xì)胞）的免疫調(diào)控及對(duì)免疫平衡的維持具有關(guān)鍵意義［9］。已有研究發(fā)現(xiàn)，正常妊娠女性外周血Treg 水平較非妊娠女性明顯升高，形成以Treg 為主的優(yōu)勢(shì)免疫應(yīng)答，而特發(fā)性不孕癥、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、子癇前期和胎兒生長(zhǎng)受限等胎盤(pán)源性疾病均與Treg 數(shù)量或功能缺陷有關(guān)［10-11］。細(xì)胞外三磷酸二磷酸核苷酸水解酶-1（ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase-1，NTPDase-1，即CD39）是Treg 發(fā)揮免疫抑制作用的重要分子，主要負(fù)責(zé)將作為循環(huán)系統(tǒng)“危險(xiǎn)”信號(hào)，促炎、促血栓形成的細(xì)胞外ATP、ADP（二者在組織細(xì)胞，如胎盤(pán)受損、凋亡、缺血缺氧時(shí)被大量釋放到細(xì)胞外）水解為AMP，在CD73（ecto-5′-nucleotidase，細(xì)胞外5′-磷酸-核苷酸酶）作用下，AMP 去磷酸化形成具有抗炎、抗血栓作用的腺苷，CD39分子這種可將細(xì)胞外核苷酸的促炎促血栓環(huán)境轉(zhuǎn)變?yōu)橄佘盏目寡卓寡ōh(huán)境的獨(dú)特作用使其成為調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和血栓形成的重要“開(kāi)關(guān)”［12-13］。CD39 分 子和CD73 分 子均表 達(dá)于Treg，Treg 可高效水解ATP 產(chǎn)生腺苷發(fā)揮免疫抑制作用，在抑制其他效應(yīng)T 細(xì)胞功能方面發(fā)揮關(guān)鍵作用［14-15］。此外，血管內(nèi)皮細(xì)胞高表達(dá)CD39 分子，在抑制血管界面血小板聚集形成血栓和炎癥激活上起重要作用，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞起保護(hù)作用［12］。本研究旨在探索子癇前期患者外周血Treg 數(shù)量及其CD39 分子表達(dá)率、臍靜脈內(nèi)壁細(xì)胞CD31+CD39+細(xì)胞群變化。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 研究對(duì)象 本研究為非干預(yù)性研究，病例組研究對(duì)象為2021 年1 月至2021 年12 月蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院產(chǎn)科收治的妊娠期高血壓患者88例，其中妊娠期高血壓組（GH）23 例、子癇前期組（PE）65 例，入選標(biāo)準(zhǔn)參考中華婦產(chǎn)科雜志《妊娠期高血壓疾病診治指南（2020）》，年齡18～45 歲，入組子癇前患者中37 例出現(xiàn)嚴(yán)重表現(xiàn)（如收縮壓≥160 mmHg和/或舒張壓≥110 mmHg、胎兒生長(zhǎng)受限、胎兒窘迫、肝酶升高、血小板減低、腹水、胸腔積液等）歸為重度子癇前期（Severe PE）組；28 例未合并嚴(yán)重表現(xiàn)的子癇前期患者歸為輕度子癇前期（Mild PE）組。妊娠20周后首次出現(xiàn)高血壓、尿蛋白陰性者納入妊娠期高血壓組。排除標(biāo)準(zhǔn)：慢性高血壓合并妊娠者；慢性高血壓并發(fā)子癇前期者；具有近期感染證據(jù)者；妊娠合并自身免疫性疾病者；妊娠合并腫瘤性疾病者；妊娠合并血栓性疾病者；妊娠合并糖尿病者；胎膜早破、臨產(chǎn)及先兆早產(chǎn)者；有既往不良妊娠史者。另外選取2021 年1 月至2021 年12 月在蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院產(chǎn)科分娩的無(wú)妊娠期內(nèi)外科并發(fā)癥的健康妊娠婦女59 例作為正常妊娠（NP）組，年齡18～45歲，知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：妊娠合并內(nèi)外科疾病者；妊娠合并傳染病及感染性疾病者；胎膜早破、臨產(chǎn)及先兆早產(chǎn)者；有既往不良妊娠史者。入組人群全部簽署知情同意書(shū)，本課題經(jīng)蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理審核編號(hào)：（2021）倫研批第011號(hào)；（2021）倫研批第012號(hào)。

1.1.2 主要試劑與儀器 熒光抗體FITC anti-humman CD4、PE/Cyanine7 anti-humman CD39、PE/Cyanine7 anti-human CD45、APC anti-human CD31、PE anti-humman CD45、PE anti-humman Foxp3 均購(gòu)自美國(guó)BioLegend 公司；Stem cell 分離液購(gòu)自美國(guó)Alere Technologies AS 公司；C6885-Ⅱ型膠原酶購(gòu)自美國(guó)Sigmaaldrich 公司；eBioscience Fixation/Permeabilization Concentrate、eBioscience Fixation/Permeabilization Diluent、Bioscience Permeabilization Buffer（×10）均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；FACS Calibur 型流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Beckman公司。

1.2 方法

1.2.1 主要溶液配制 固定破膜工作液：實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前30 min 將固定破膜濃縮液和固定破膜稀釋液按照1∶3 比例混合，配制1×固定破膜工作液。破膜緩沖液：實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前30 min 使用蒸餾純化水稀釋10×破膜緩沖液為1×破膜緩沖液。Ⅱ膠原酶溶液：100 mg Ⅱ型膠原酶粉劑溶解于100 ml DMEM 溶液配制0.01%濃度膠原酶溶液，-20 ℃儲(chǔ)存。

1.2.2 外周血處理 Ficoll密度梯度離心法獲取外周全血單個(gè)核細(xì)胞，制作600 μl單個(gè)核細(xì)胞懸濁液，分裝至96 孔板的6 個(gè)微孔（100 μl/孔），按順序加入熒光抗體各1 μl，4 ℃避光孵育30 min，抗體標(biāo)記順序：①空白對(duì)照；②CD4 FITC；③CD45 PE；④CD45 PC7；⑤CD4 FITC+Foxp3 PE；⑥CD4 FITC+Foxp3 PE+CD39 PC7；Foxp3 PE抗體為胞內(nèi)抗原標(biāo)記，細(xì)胞經(jīng)固定及破膜處理后標(biāo)記，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血CD4+T 細(xì)胞比例及CD39 表達(dá)率、Foxp3+CD4+T 細(xì)胞（Treg）比例及CD39 表達(dá)率、Foxp3-CD4+T 細(xì)胞比例及CD39表達(dá)率。

1.2.3 臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞提取及處理 將臍帶放入醫(yī)用彎盤(pán)，剪去臍帶上有鉗夾痕及血腫部分，生理鹽水清洗表面及臍靜脈內(nèi)血液；止血鉗夾住臍帶一端，用小鼠胃管向臍靜脈另一端注入0.01%Ⅱ型膠原酶溶液至臍靜脈充盈，結(jié)扎臍帶兩端，37 ℃恒溫水浴消化15 min。收集臍靜脈消化液和沖洗液共同放入15 ml 離心管，吹勻消化細(xì)胞，1 800 r/min 離心5 min，去上清，留取臍靜脈內(nèi)壁細(xì)胞沉淀，制作細(xì)胞懸濁液400 μl，將細(xì)胞懸液分別加入96 孔板的4 個(gè)微孔中各100 μl，按下列順序加入相應(yīng)熒光抗體各1 μl 進(jìn)行標(biāo)記：①空白對(duì)照；②CD45 PC7；③CD31 APC；④CD31 APC+CD39 PC7，4 ℃避光孵育30 min，1 800 r/min離心5 min，洗滌1次，流式細(xì)胞檢測(cè)臍靜脈血管內(nèi)壁細(xì)胞CD31+CD39+內(nèi)皮細(xì)胞群比例。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，將所有結(jié)果資料進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)，滿(mǎn)足正態(tài)分布的連續(xù)型數(shù)值變量采用兩個(gè)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或K 個(gè)獨(dú)立樣本單因素方差分析，不滿(mǎn)足正態(tài)分布的連續(xù)型數(shù)值變量資料使用兩獨(dú)立樣本Man-WitneyU檢驗(yàn)或K 個(gè)獨(dú)立樣本Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，分類(lèi)資料進(jìn)行卡方檢驗(yàn)。以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。Graph Pad Prims 9.0軟件繪圖，F(xiàn)lowJo v10.7.2軟件進(jìn)行流式分析。

2 結(jié)果

2.1 入組人群一般資料及臨床資料比較 各組年齡、孕次、產(chǎn)次差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。NP 組收縮壓、舒張壓明顯低于GH 組、輕度PE 組及重度PE組（P<0.05）。重度PE 組24 h 尿蛋白量明顯高于GH 組及輕度PE 組（P<0.05），輕度PE 組高于GH 組（P<0.05）。重度PE組分娩孕周明顯小于NP組、GH組及輕度PE 組（P<0.05）；輕度PE 組分娩孕周明顯小于NP 組（P<0.05）。重度PE 組新生兒出生體重明顯低于NP 組、GH 組及輕度PE 組（P<0.05）。各組小于育齡兒出生比例存在明顯差異，重度PE組小于育齡兒出生比例明顯高于其他各組（P<0.05）。

表1 觀(guān)察對(duì)象一般資料及臨床資料Tab.1 General and clinical data of four groups of subjects

2.2 各組外周血比較

2.2.1 正常妊娠組、妊娠期高血壓組、子癇前期組三組間比較 正常妊娠組、妊娠期高血壓組、子癇前期組母體外周血CD4+T 淋巴細(xì)胞比例及CD39 表達(dá)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。正常妊娠組Treg 比例及CD39 表達(dá)率明顯高于子癇前期組（P<0.01），而妊娠期高血壓組與正常妊娠組、子癇前期組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；正常妊娠組Foxp3-CD4+T 細(xì)胞比例明顯低于子癇前期組（P<0.05），但CD39 表達(dá)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；妊娠期高血壓組Foxp3-CD4+T 細(xì)胞比例及CD39表達(dá)率與正常妊娠組、子癇前期組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05，圖1、圖2）。

圖1 NP 組、GH 組、PE 組外周血CD4+T 細(xì)胞、Treg、Foxp3-CD4+T細(xì)胞比例比較Fig.1 Comparison of proportions of CD4+T cells，Treg and Foxp3-CD4+T cells in peripheral blood of NP group，GH group and PE group

圖2 NP 組、GH 組、PE 組CD4+T 細(xì)胞、Treg、Foxp3-CD4+T細(xì)胞CD39表達(dá)率比較Fig.2 Comparison of CD39 expression rates of CD4+T cells，Treg and Foxp3-CD4+T cells in NP group，GH group and PE group

2.2.2 輕度子癇前期組及重度子癇前期組比較

輕度子癇前期組和重度子癇前期組外周血淋巴細(xì)胞中CD4+T 細(xì)胞、Treg、Foxp3-CD4+T 細(xì)胞比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；輕度子癇前期組CD4+T細(xì)胞、Treg、Foxp3-CD4+T 細(xì)胞CD39 表達(dá)率均明顯高于重度子癇前期組（P<0.01，圖3、圖4）。

圖3 輕度PE 組與重度PE 組外周血CD4+T 細(xì)胞、Treg、Foxp3-CD4+T細(xì)胞比例比較Fig.3 Comparison of proportions of CD4+T，Treg and Foxp3-CD4+T cells in peripheral blood between mild PE group and severe PE group

圖4 輕度PE 組與重度PE 組外周血CD4+T 細(xì)胞、Treg、Foxp3-CD4+T細(xì)胞CD39表達(dá)率比較Fig.4 Comparison of CD39 expression rates on CD4+T cells，Treg and Foxp3-CD4+T cells in peripheral blood between mild PE group and severe PE group

2.3 臍靜脈血管內(nèi)壁細(xì)胞CD31+CD39+內(nèi)皮細(xì)胞群占比分析 以CD31 分子作為內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)志分子，重度子癇前期組臍靜脈血管內(nèi)壁細(xì)胞CD31+CD39+內(nèi)皮細(xì)胞群比例明顯低于正常妊娠組［6.32（3.27～10.55）vs18.95（9.90～27.48），P=0.020，圖5］。

圖5 NP 組與重度PE 組臍靜脈血管內(nèi)壁細(xì)胞CD31+CD39+內(nèi)皮細(xì)胞群比例比較Fig.5 Comparison of proportions of CD31+CD39+ endothelial cells in inner wall cells of umbilical vein between NP group and severe PE group

3 討論

子癇前期是妊娠期婦女最常見(jiàn)妊娠期特有的并發(fā)癥，是引起孕產(chǎn)婦、圍產(chǎn)兒死亡的最重要原因，與母體免疫失衡狀態(tài)密切相關(guān)，表現(xiàn)為機(jī)體免疫抑制功能受損，促炎反應(yīng)過(guò)度激活［6-7］。對(duì)正常妊娠維持來(lái)說(shuō)，Treg 介導(dǎo)的母體對(duì)胎兒抗原的免疫耐受和母體免疫平衡是必不可少的［16-18］。本研究中，子癇前期患者體內(nèi)發(fā)揮免疫抑制功能的Treg 水平較正常妊娠婦女明顯下降，而外周血Foxp3-CD4+T 細(xì)胞水平（主要包括Th1、Th17、Th2 等效應(yīng)T 細(xì)胞）較正常妊娠婦女升高，說(shuō)明子癇前期患者機(jī)體可能長(zhǎng)期處于炎癥不受控制的免疫失衡狀態(tài)。DARMOCHWAL-KOLARZ 等［19］、EGHBAL-FARD 等［20］也得到了一致結(jié)果，子癇前期患者外周血Treg 減少，且存在促炎CD4+T效應(yīng)細(xì)胞如Th17細(xì)胞增加，Treg/Th17細(xì)胞比例失衡。子癇前期的慢性炎癥學(xué)說(shuō)、內(nèi)皮功能障礙學(xué)說(shuō)、螺旋動(dòng)脈重鑄不足學(xué)說(shuō)可能與這種不平衡有關(guān)［21］。研究顯示，子癇前期大鼠（RUPP）補(bǔ)充IL-10 因子可使外周血Treg 增加，降低RUPP 大鼠平均動(dòng)脈壓、促炎因子IL-6 和TNF-α 和AT1-AA（血管緊張素受體自身抗體，可作用于自身AT1 受體引起高血壓）表達(dá)，減輕氧化應(yīng)激［22］。CORNELIUS 等［23］將正常妊娠小鼠Treg 注射至RUPP 大鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)RUPP+NP Tregs 大鼠平均動(dòng)脈壓較未接受NP 小鼠Treg 注射的RUPP 大鼠顯著下降，且外周血促炎因子TNF-α、IL-17水平及胎盤(pán)和腎臟ROS水平也明顯降低?？梢?jiàn)Treg 減少可能是子癇前期母體免疫失衡的重要原因。

除Treg 減少外，子癇前期患者外周血Treg CD39表達(dá)陽(yáng)性率也較正常妊娠婦女明顯降低，循環(huán)中Treg 可能還存在免疫抑制功能減弱。雖然重度子癇前期與輕度子癇前期相比，Treg 在CD4+T 細(xì)胞中的比例無(wú)明顯差異，但Treg CD39 表達(dá)陽(yáng)性率上，重度子癇前期患者明顯低于輕度子癇前期患者，因此Treg CD39 分子表達(dá)陽(yáng)性率可能與子癇前期嚴(yán)重程度有關(guān)。實(shí)驗(yàn)證明CD39 在Treg 中持續(xù)而豐富地表達(dá)，與CD73 組成完整的核苷酸代謝環(huán)，通過(guò)將外周環(huán)境中的ATP 高效率代謝產(chǎn)生具有抗炎效應(yīng)的腺苷，并作用于其他免疫細(xì)胞及自身A2A/A2B 受體，發(fā)揮且放大其免疫抑制、抗炎功能［14，24］；CD39/CD73分子機(jī)制改變可破壞由Treg 主導(dǎo)的自身抗原免疫耐受的復(fù)雜機(jī)制，從而導(dǎo)致一些自身免疫性疾病發(fā)展［25-26］。如BORSELLINO 等［24］發(fā)現(xiàn)MS 患者外周血中CD39+Treg 數(shù)量明顯低于健康對(duì)照者。也有研究證明系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者Tregs 中CD39 表達(dá)降低，而非Treg數(shù)量減少［27］。

但Treg CD39 分子表達(dá)與妊娠期高血壓發(fā)生發(fā)展是否相關(guān)知之甚少。Treg CD39 表達(dá)下降或功能受損可導(dǎo)致局部ATP積累，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，ATP積累可抑制大鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞浸潤(rùn)和螺旋動(dòng)脈重鑄能力［28］。亦有學(xué)者表示子癇前期患者循環(huán)中被作為危險(xiǎn)信號(hào)的ATP 水平較正常妊娠者明顯升高，子癇前期婦女血漿中ATP/腺苷是健康孕婦的1.5 倍，意味著子癇前期患者ATP/腺苷向血管收縮和炎癥方向轉(zhuǎn)變，可能是CD39 分子表達(dá)降低水解ATP 能力下降所致［29-30］。本研究結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明子癇前期患者Treg功能受損可能是導(dǎo)致母體免疫失衡的原因之一。

除免疫失衡機(jī)制外，子癇前期另一重要的病理生理機(jī)制是內(nèi)皮細(xì)胞損傷，血小板易被激活形成微血栓［3］。本研究結(jié)果提示重度子癇前期患者CD31+CD39+臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞群比例與正常妊娠者明顯降低。CD39 是內(nèi)皮細(xì)胞表面最重要的細(xì)胞外核苷酸水解酶，可水解致血小板激活的重要調(diào)節(jié)信號(hào)細(xì)胞外ATP 和ADP，生成抗血小板募集的腺苷，是內(nèi)皮細(xì)胞主要的抗血栓因子［31-33］。GOEPFERT 等［34］用人CD39cDNA（RAdCD39）構(gòu)建重組復(fù)制缺陷腺病毒轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC），發(fā)現(xiàn)人HUVEC 細(xì)胞外核苷三磷酸二磷酸水解酶活性明顯升高，CD39分子高表達(dá)抑制ATP 誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)血管性血友病因子（von willebrand factor，vWF）、E-選擇素（E-selectin，介導(dǎo)白細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞黏附）表達(dá)。其次是內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的CD39 對(duì)血管炎癥的調(diào)節(jié)，通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞周?chē)堰蕽舛扔绊懨庖呒?xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞黏附。高濃度ATP 可使這種黏附作用增強(qiáng)，而增加的腺苷可抑制這種黏附作用［35］。ANYANWU等［36］的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CD39 基因缺陷小鼠在深靜脈血栓模型中會(huì)形成較野生型小鼠更大的血栓，同時(shí)顯著增強(qiáng)白細(xì)胞激活、趨化運(yùn)動(dòng)及與內(nèi)皮細(xì)胞黏附。高血壓小鼠模型動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)CD39 表達(dá)和活性降低，可加劇動(dòng)脈損傷、重塑和血小板活化［37］。子癇前期患者循環(huán)中血小板活化也是重要的病理生理機(jī)制，不僅促進(jìn)胎盤(pán)微血栓形成，還可能加重子癇前期患者血管功能障礙［38］。

綜上，子癇前期患者Treg 數(shù)量減少及其CD39表達(dá)率降低可能與免疫失衡機(jī)制密切相關(guān)；血管CD31+CD39+內(nèi)皮細(xì)胞群減少可能與血管內(nèi)皮損傷機(jī)制有關(guān)。