邵 靜,張 穎,唐 毓,許保增

(中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所,長春 130112)

卵母細胞是現(xiàn)階段所能觀察到的雌性哺乳動物體內(nèi)最大的細胞,也是唯一的生殖細胞。和體細胞相比,卵母細胞的數(shù)量非常有限,并且不會再增殖。隨著體外受精、動物克隆與轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)等生物學技術(shù)的快速發(fā)展,卵母細胞的重要性被體現(xiàn)的淋漓盡致。一顆獲得良好發(fā)育的成熟卵母細胞是保障受精的順利進行、雙倍體合子的形成和早期胚胎基因組激活的物質(zhì)前提[1]。卵母細胞的成熟受到一系列機制細致精密的調(diào)控,是多種信號通路相互協(xié)同又互相拮抗的結(jié)果。在受精過程中,只有細胞核與細胞質(zhì)均發(fā)育成熟的卵母細胞才會對精子的結(jié)合釋放出正確的應答反應,共同形成一個具有發(fā)育潛能的受精卵[2]。

很多研究認為,ERM蛋白參與了卵母細胞成熟和受精的過程。ERM家族是埃茲蛋白(ezrin)、根蛋白(radixin)和膜突蛋白(moesin)的統(tǒng)稱,幾乎所有的哺乳動物中都存在ERM蛋白,并且這3個蛋白的序列高度保守,共有序列高達75%,使它們在功能上非常相似[3]。ERM蛋白憑借其特殊的分子結(jié)構(gòu),可以直接或間接地與跨膜蛋白和肌動蛋白結(jié)合,從而作為“腳手架”,形成膜蛋白-ERM蛋白-細胞骨架蛋白復合體,參與構(gòu)建并維持細胞皮層。細胞皮層通常被定義為質(zhì)膜下方比較致密的肌動蛋白細胞骨架層,由微絲和微絲結(jié)合蛋白交聯(lián)成凝膠狀態(tài)的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),在質(zhì)膜與胞質(zhì)之間形成了均勻的細胞質(zhì)皮質(zhì)區(qū)[4]。細胞皮層可以參與細胞形態(tài)的改變、細胞間的相互作用以及細胞膜對細胞的調(diào)節(jié)作用。ERM作為細胞皮層的核心組分,廣泛分布在細胞質(zhì)基質(zhì)、片狀偽足、絲狀偽足和微絨毛中,控制肌動蛋白細胞骨架動力學,參與細胞膜的組成、囊泡形成、細胞遷移、信號傳遞、跨膜蛋白定位和皮質(zhì)張力調(diào)節(jié)等生理過程[5]。

哺乳動物卵母細胞有高度組織化的細胞皮層,包括密集的微絨毛排列和復雜的微絲帽結(jié)構(gòu)。在哺乳動物卵母細胞成熟過程中,紡錘體要靠皮質(zhì)肌動蛋白的牽拉遠離細胞中心,實現(xiàn)胞質(zhì)不對稱減數(shù)分裂[6]。在哺乳動物受精過程中,卵母細胞質(zhì)膜和細胞骨架之間的關(guān)聯(lián)通路可以保障精子與卵子的成功融合,例如,精子需要與卵質(zhì)膜上的微絨毛結(jié)合才能進入卵母細胞[7],而微絨毛和細胞內(nèi)部的信號傳遞,需要ERM蛋白將質(zhì)膜、跨膜蛋白和基底的肌動蛋白串聯(lián)起來,形成完整的調(diào)節(jié)路徑,改變膜蛋白的動力性能[8]。這類生殖活動普遍都有ERM的參與,但是ERM蛋白家族在其中發(fā)揮的具體作用機制卻很少受到深入研究。本文將以ERM蛋白為中心,概述其在哺乳動物卵母細胞減數(shù)分裂成熟和受精過程中參與的各種調(diào)控作用。

1 ERM蛋白的分子結(jié)構(gòu)及特點

1.1 ERM蛋白的分子結(jié)構(gòu)

ERM蛋白能夠廣泛參與細胞的多個生理過程都是依賴于它特殊的組成結(jié)構(gòu)。在人類中,ezrin、radixin和moesin蛋白分別由585、583和577個氨基酸殘基組成,ERM蛋白質(zhì)家族的氨基(N)末端是由大約300個氨基酸殘基組成的球狀FERM結(jié)構(gòu)域,該結(jié)構(gòu)域由3個子域(F1、F2和F3)一起交疊成三葉草的形狀;羧基(C)末端是由大約100個氨基酸殘基組成的C-ERMAD結(jié)構(gòu)域;兩端中間是約150個氨基酸殘基組成的α-螺旋結(jié)構(gòu),不同物種間ERM蛋白的序列差異幾乎都來自于這段區(qū)域[9]。

ERM有兩種構(gòu)象狀態(tài):一種非活性狀態(tài),大多數(shù)細胞的ERM蛋白都是這種休眠狀態(tài),其N端的FERM結(jié)構(gòu)域和C端的C-ERMAD相互抑制,以頭對尾的方式結(jié)合起來,α螺旋區(qū)盤繞在它們中間,掩蓋了它們與細胞骨架和細胞質(zhì)膜的結(jié)合位點,成為閉合構(gòu)象的失活狀態(tài),在細胞質(zhì)中以單體環(huán)或二聚體的形式存在;另一種是定位在質(zhì)膜上的非折疊的活性狀態(tài),其激活的標志是ezrin、radixin和moesin中第567、564、558位的蘇氨酸殘基被磷酸化,C-ERMAD從FERM結(jié)構(gòu)域中釋放出來,暴露出兩端的結(jié)合位點[10](圖1)。

1.2 ERM蛋白介導質(zhì)膜與肌動蛋白的連接

肌動蛋白是細胞骨架的主要成分,多以球形單體(G-肌動蛋白)和聚合纖維(F-肌動蛋白)兩種形式存在于真核生物中,肌動蛋白聚合成微絲,在細胞表面形成應力纖維、板狀偽足、絲狀偽足、黏著斑、微絨毛、分裂環(huán)等結(jié)構(gòu),參與細胞分裂和細胞遷移等許多生物學過程[12],卵母細胞的減數(shù)分裂和受精也離不開復雜的微絲網(wǎng)絡。

圖1 ERM蛋白的兩種構(gòu)像示意圖[11]Fig.1 Diagrams of two conformations of ERM proteins[11]

ERM蛋白在磷酸化與非磷酸化狀態(tài)中的可逆轉(zhuǎn)變,是調(diào)節(jié)質(zhì)膜與肌動蛋白相互作用的關(guān)鍵。能夠控制ERM活性的分子有很多,包括與肌動蛋白組裝有關(guān)的Ran GTPase[13],與細胞極化有關(guān)的趨化因子,以及針對蘇氨酸的磷酸酶、激酶和它們的抑制劑[14]。當ERM蛋白C-ERMAD結(jié)構(gòu)域的蘇氨酸被去磷酸化,ERM會從細胞皮層脫離,游離于細胞質(zhì)中?！伴_放”的ERM蛋白FERM結(jié)構(gòu)域與酸性的磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(PI(4,5)P2)結(jié)合并經(jīng)過修飾后,可以促進C末端保守的蘇氨酸殘基發(fā)生磷酸化,磷酸化的C-ERMAD結(jié)構(gòu)域帶上負電,與FERM區(qū)域的負電荷發(fā)生排斥,使ERM蛋白的折疊構(gòu)象打開[15]。

ERM蛋白C末端結(jié)構(gòu)域包含肌動蛋白結(jié)合位點,而ERM的N末端FERM結(jié)構(gòu)域可以與跨膜蛋白留在細胞質(zhì)部分的帶正電荷氨基酸簇的尾部直接結(jié)合,也可以通過先與支架蛋白EBP50或E3K-ARP結(jié)合,然后利用該蛋白的PDZ結(jié)構(gòu)域間接關(guān)聯(lián)到膜蛋白[16]。與ERM結(jié)合的膜蛋白很多都是粘附分子,包括CD44、CD43、PSGL-1和ICAM-1-3等[17-19]。目前的研究表明,ERM蛋白是連接整合膜蛋白與作為細胞骨架的皮質(zhì)層肌動蛋白的接頭蛋白。許多跨膜蛋白都是通過與胞質(zhì)中的細胞骨架蛋白結(jié)合來改變細胞形狀,并參與細胞粘附、細胞運動并維持細胞表面的信息交流,包括胞吞和胞吐作用[20-21]。ERM蛋白通過同時與整合膜蛋白、膜相關(guān)細胞質(zhì)蛋白和肌動蛋白絲之間相互結(jié)合,組建專門的膜結(jié)構(gòu)域,將胞外信號輸送到細胞內(nèi),從而介導細胞遷移[22]、細胞分裂[23]、信號傳導[24]、跨內(nèi)皮細胞遷移[25]、微絨毛形成[26]以及細胞極性的建立[27]等重大生物學事件。

2 ERM蛋白參與卵母細胞成熟

卵母細胞的成熟指的是處于第一次減數(shù)分裂前期的雙線期,也就是生發(fā)泡期(GV)的卵母細胞經(jīng)歷連續(xù)兩次減數(shù)分裂并最終停滯在減數(shù)第二次分裂中期(MⅡ)的過程(圖2)。

2.1 ERM蛋白調(diào)控卵母細胞-顆粒細胞間的雙向信號傳導

哺乳動物從出生就已經(jīng)具備了一生的原始卵泡池,里面含有處于GV期的休眠卵母細胞和包裹著它的尚未分化的前顆粒細胞。原始卵泡是雌性哺乳動物的基本生殖單位[29]。卵母細胞只有接收到周圍顆粒細胞釋放的調(diào)節(jié)信號,才能突破休眠開始發(fā)育。該過程包含復雜的信號通路。前顆粒細胞受到營養(yǎng)、壓力、能量、生長因子等信號刺激后,激活mTORC1信號通路,進而分化為顆粒細胞[30]。mTORC1信號通路繼續(xù)促進顆粒細胞分泌生長因子KIT配體,與休眠卵母細胞表面的KIT受體結(jié)合,激活卵母細胞內(nèi)的PI3K信號通路,下游FOXO3a被磷酸化并從卵母細胞的細胞核中轉(zhuǎn)移到細胞質(zhì)中,使休眠的卵母細胞開始生長,原始卵泡被激活為初級卵泡[31-32]。此時的顆粒細胞開始表達縫隙連接蛋白43(CX43),將彼此相鄰的顆粒細胞連通起來;同時卵母細胞表達CX37蛋白,形成卵母細胞-顆粒細胞間的縫隙連接[33]。磷酸化的ezrin蛋白可以與CX43結(jié)合,而中間的α-螺旋區(qū)有一個AKB結(jié)構(gòu)域,可以與蛋白激酶A(PKA)的調(diào)節(jié)亞基結(jié)合,ezrin蛋白將PKA錨定在下游,形成PKA-ezrin-CX43復合體,cAMP激活PKA后,使PKA釋放出兩個催化亞基將CX43在369和373位的絲氨酸殘基磷酸化[34-35]。ezrin蛋白就以這種方式參與由cAMP/PKA信號通路介導的縫隙連接。在縫隙連接的介導下,顆粒細胞將能夠調(diào)節(jié)卵母細胞pH和滲透壓的離子、氨基酸和葡萄糖等分子以及保持卵母細胞長時間停滯在GV期所需的cGMP和cAMP傳遞到卵母細胞中[36]。但是透明帶的形成使卵母細胞-顆粒細胞間有了一層物理性屏障,為了克服這層阻礙,透明帶中出現(xiàn)了兩種不同來源的突起狀結(jié)構(gòu)(圖3)[37]。一種是由顆粒細胞發(fā)射出的跨透明帶的絲狀偽足(granulosa cell transzonal projections, GC-TZPs);另一種則是卵母細胞產(chǎn)生的狀似蘑菇的頂端帶囊泡的微絨毛結(jié)構(gòu)(oocyte microvilli, Oo-Mvi)[38]。與顆粒細胞TZP相比,Oo-Mvi要稀疏很多。

微絨毛是細胞質(zhì)伸出的微細指狀突起,表面被細胞膜包裹,內(nèi)部為細胞質(zhì),軸心是肌動蛋白聚合形成的微絲,廣泛存在于動物細胞的表面,在卵母細胞和上皮細胞等吸收代謝機能旺盛的細胞中尤其常見[39]。因為微絨毛的存在可以增加細胞的表面積,同時微絨毛也可以伸縮和擺動,使細胞與外界微環(huán)境充分接觸,所以富集微絨毛的細胞一般都需要頻繁進行細胞與細胞間的物質(zhì)交換和信息交流。附著在卵母細胞表面的微絨毛比體細胞還有一系列特殊的細胞行為。

微絨毛在卵母細胞不同發(fā)育階段所起的主要作用是不同的。未成熟的卵母細胞會通過微絨毛從周圍的顆粒細胞中獲取營養(yǎng)物質(zhì)和信息分子以滿足自身的發(fā)育需求,也會通過微絨毛釋放生長分化因子9(GDF9)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白15(BMP15)等分泌因子,促進卵泡生長和顆粒細胞增殖[40]。如果阻斷顆粒細胞對卵母細胞的聯(lián)系,微絨毛就會退化,顆粒細胞提前黃體化,這顆卵泡將來會成為不能排卵的閉鎖卵泡[41]。排卵前卵母細胞表面的微絨毛會塌陷回縮,從而切斷與卵丘細胞間的聯(lián)系,方便其從卵泡中排出[42]。排卵后2～4 h,卵母細胞表面塌陷的微絨毛又會再次樹立起來,并且變得更加細長,此時的卵子最適合與精子接觸融合。排卵后8 h還沒與精子結(jié)合的卵母細胞開始老化,卵質(zhì)膜上的微絨毛退化變粗,不利于精子的粘附和細胞膜的融合。

很早就有研究認為,ERM蛋白參與微絨毛的組裝和維持,以確保其與胞質(zhì)的強粘附性[43]。磷酸化的ERM蛋白通過連接肌動蛋白絲與整合膜蛋白形成微絨毛,常與微絨毛結(jié)構(gòu)共定位。敲除ERM家族的radixin后卵母細胞表面微絨毛結(jié)構(gòu)缺失,富集在微絨毛小泡中的卵母細胞分泌因子由于不能排出而堆積在卵母細胞中,抑制了顆粒細胞的增殖擴散,使卵泡發(fā)育水平整體降低,最終導致排卵異常,產(chǎn)仔率低,降低雌性哺乳動物的繁殖力[38]。小鼠卵母細胞中radixin的mRNA水平最高可達卵巢體細胞和其他組織中的700倍,其蛋白通常呈現(xiàn)激活狀態(tài),radixin在卵巢組織中存在如此大的組織特異性表達,可能是因為radixin在卵母細胞中承擔著參與微絨毛形成的特殊功能[38]。

2.2 ERM蛋白調(diào)節(jié)卵母細胞的不對稱分裂

與精子的產(chǎn)生不同,雌性哺乳動物的減數(shù)分裂最終只能形成一個成熟的卵母細胞。初級卵母細胞需要經(jīng)過兩次不對稱分裂才能在形成單倍體的基礎上保證大部分母源物質(zhì)都留在卵母細胞中,以供早期胚胎的發(fā)育[44]。

卵母細胞的極性造成了紡錘體的不對稱定位,從而導致了胞質(zhì)的不均等分裂[45]。GVBD之后,卵母細胞紡錘體在胞質(zhì)中心組裝并向皮質(zhì)區(qū)遷移,這一行為會導致覆蓋于紡錘體上方的皮層形成一個富含肌動蛋白的區(qū)域,稱為肌動蛋白帽[46]。這個區(qū)域幾乎沒有皮質(zhì)顆粒存在,是極體最終排出的位置[47]。介導卵母細胞出現(xiàn)這種皮質(zhì)區(qū)極化現(xiàn)象的是Ran-GTP信號通路[48]。染色體偏離中心向質(zhì)膜移動使細胞出現(xiàn)了Ran-GTP濃度梯度,Ran-GTP濃度梯度通過CDC42激活皮質(zhì)區(qū)的成核促進因子N-WASP,從而激活下游的肌動蛋白成核因子Arp2/3復合物,使紡錘體上方的皮質(zhì)區(qū)積累大量肌動蛋白形成肌動蛋白帽[49]。同時肌動蛋白絲不斷地從肌動蛋白帽流出,形成細胞環(huán)流,推動紡錘體向卵質(zhì)膜移動[50]。到MII時期,紡錘體就會停留在皮質(zhì)區(qū)附近,且平行于細胞皮層。一旦發(fā)生受精,卵母細胞被激活,紡錘體會發(fā)生旋轉(zhuǎn),改為垂直于細胞皮層,進而排出第二極體。但如果敲除ERM蛋白,卵母細胞的皮質(zhì)張力會下降,紡錘體無法正常旋轉(zhuǎn),導致兩極發(fā)生扭曲,向皮層頂起兩個類似極體的凸起,第二極體不能排出,卵母細胞也不能向后發(fā)育[51]。

有研究發(fā)現(xiàn),Ran-GTP酶也可以誘導ERM蛋白的去磷酸化,使肌動蛋白帽缺乏ERM蛋白活性,從而造成該區(qū)域沒有微絨毛的覆蓋(圖4)[13]。微絨毛的區(qū)域性缺失也保障了卵母細胞的順利分裂。因為微絨毛上富集著精卵結(jié)合蛋白,極體從微絨毛缺失的區(qū)域排出,可以避免精子從極體排出的位置入卵,造成父本遺傳物質(zhì)的丟失。這些研究結(jié)果都反映了ERM蛋白在維持卵母細胞的細胞極性,推動胞質(zhì)不對稱分裂等重要的生物學事件中扮演著重要角色。

3 ERM蛋白在精卵融合中的作用

精子與卵子的結(jié)合與融合是受精過程的關(guān)鍵步驟,依賴于精子和卵子之間復雜的分子識別體系和多對配體與受體間的協(xié)作,從而促使兩個配子的質(zhì)膜融合[52]。卵母細胞膜上的微絨毛是精子的初始結(jié)合點,可以捕獲并包裹靠近卵母細胞的精子,將精子拽到卵子內(nèi)部。該行為在受精過程里發(fā)揮著核心作用[53]。哺乳動物成熟卵母細胞表面是不均一的,面積較大的區(qū)域覆蓋著密集的微絨毛,而減數(shù)第二次分裂中期紡錘體貼近的那小部分區(qū)域的卵質(zhì)膜卻是光滑的,這是因為精卵結(jié)合和融合的位點集中在微絨毛上,該區(qū)域缺乏微絨毛可以避免精子從紡錘體方向入卵使父系染色體隨第二極體排出[54]。其實在很多體細胞中,微絨毛也同樣擔負著細胞粘附的功能,例如白細胞粘附分子L-選擇素在微絨毛頂端表達,其尾部可以通過與ERM蛋白的N-末端結(jié)合連接肌動蛋白骨架,使白細胞粘附在內(nèi)皮細胞上并沿著血管內(nèi)皮滾動[55]。

CD9 (cluster of differentiation 9)是四跨膜蛋白超家族的成員之一,有研究發(fā)現(xiàn)該蛋白可以激活卵母細胞膜上的精子與卵子的融合位點;也可以借助外泌體的形式,將自身包裹在囊泡中從卵質(zhì)膜釋放到卵周隙,促進精子附著和精卵融合[56-59]。與磷酸化ERM蛋白的表達模式相似,CD9覆蓋在卵母細胞的表面,但成熟卵母細胞不發(fā)生精卵融合的無微絨毛區(qū)域則沒有CD9的表達[60]。卵母細胞敲除CD9后,微絨毛變得又短又粗[61],不易包裹精子,精子和卵子可以結(jié)合但最終無法融合,導致受精失敗[62],注射外源CD9的mRNA后,受精率大幅度提高[63]。而敲除CD9基因的小鼠雖然可以正常排卵,但是精子卻都被阻擋在卵周隙,無法與卵子融合,導致雌性的生育能力急劇降低[64]。免疫球蛋白超家族成員EWI-2和EWI-F是CD9的伙伴分子,其位于胞質(zhì)的結(jié)構(gòu)域中含有帶正電荷的氨基酸,可以直接與ERM蛋白氨基末端的結(jié)構(gòu)域結(jié)合,共同定位于細胞表面的微絨毛區(qū)域[65]。CD9與EWI-2和EWI-F結(jié)合形成復合體后,可以借助EWI-2和EWI-F與ERM的互作進而與微絨毛核心的肌動蛋白絲偶聯(lián)在一起。也就是說,雖然CD9蛋白需要與細胞膜上的整合素等膜受體相互作用共同調(diào)控受精過程,但是只有通過CD9-EWI-2/EWI-F-ERM復合體將卵母細胞表面的精卵融合蛋白間接錨定到細胞骨架上,才能調(diào)節(jié)最適合精卵融合的微絨毛的動態(tài)結(jié)構(gòu),保障這些蛋白正常發(fā)揮作用[57]。

糖基磷脂酰肌醇錨定蛋白(GPI-APs)是一類借助自身羧基末端糖基-磷脂酰肌醇基團錨定到細胞膜外側(cè)的蛋白質(zhì),不含跨膜組分[66]。磷脂酰肌醇磷酸脂酶C(PI-PLC)可水解大多數(shù)GPI-APs。用PI-PLC剝離卵質(zhì)膜上的GPI-APs,精卵可以結(jié)合但不能融合[67]。葉酸受體4(FOLR4)也是一種參與精卵融合的GPI錨定蛋白,位于卵質(zhì)膜上,與精子膜上的IZUMO1是一對精卵融合蛋白,所以又被命名為IZUMO1R或JUNO,這兩種蛋白是精子和卵子能夠認出對方的“身份證”。JUNO在成熟的卵母細胞上高表達,精卵結(jié)融合后JUNO會通過微絨毛上的小泡釋放到膜外,受精40 min后就已經(jīng)檢測不到了,有研究認為JUNO受精后的脫落機制可能是為了防止多精受精[68]。兩種膜蛋白的結(jié)合也需要CD9的協(xié)助,比如CD9會在受精前將JUNO招募到精卵融合位點,促進JUNO與IZUMO1的結(jié)合[69]。修飾后的GPI-APs到達內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出口位點(ERES)由細胞質(zhì)被膜復合體Ⅱ(COPⅡ)形成分泌小泡后從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運到高爾基體,再運輸?shù)郊毎け砻?作為膜蛋白發(fā)揮功能[70]。有研究發(fā)現(xiàn),ERM家族Radixin和Moesin可能通過介導細胞骨架重組參與驅(qū)動COPⅡ囊泡的運輸從而影響GPI-APs的轉(zhuǎn)運[71]。

4 ERM蛋白阻止多精受精

胎盤類哺乳動物是單精受精動物,只有一個精子與卵子結(jié)合才能保證形成二倍體受精卵。多精受精會使囊胚率降低,流產(chǎn)和畸形胎概率升高[72]。未成熟或老化的卵母細胞都容易多精受精,所以受精時就要求卵母細胞處于良好的胞質(zhì)成熟狀態(tài)。

精子入卵后,迅速激起卵質(zhì)膜下皮質(zhì)顆粒的大量胞吐,該皮質(zhì)反應現(xiàn)象是卵子阻止多精受精的重要機制。例如,小鼠卵母細胞單精注射誘發(fā)皮質(zhì)反應,處理后的卵子進行體外受精會發(fā)生多精入卵。皮質(zhì)顆粒是卵母細胞特有的細胞器,但目前關(guān)于它的形成機制還存在爭議,有研究認為它是由高爾基復合體分泌[73],也有相反的主張,認為皮質(zhì)顆粒與滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)小泡密切相關(guān)[74],但對于皮質(zhì)顆粒在阻擋多精入卵方面的重要性卻是得到研究者廣泛認可的。隨著卵母細胞的生長和成熟,皮質(zhì)顆粒開始形成并且數(shù)量不斷增加。在嚙齒類動物中,皮質(zhì)顆粒的重新分布有明顯的極性,定位與微絨毛相似,與微絲帽的分布互補,成熟卵母細胞覆蓋紡錘體的皮層沒有皮質(zhì)顆粒。而牛、豬和人等物種的MⅡ期卵母細胞中,不能看到明顯的缺失皮質(zhì)顆粒的區(qū)域,有研究發(fā)現(xiàn)這是因為該區(qū)域太小,鏡下不能清楚觀察到[75]。未成熟卵母細胞由于皮質(zhì)顆粒數(shù)目不足且尚未貼近卵質(zhì)膜,不能形成完善的皮質(zhì)反應來阻止多精入卵[76]?！斑^熟”卵子中的皮質(zhì)顆粒會內(nèi)遷或提前胞吐,受精時皮質(zhì)顆粒不能完全釋放到卵周隙,容易造成多精入卵[77]。

皮質(zhì)反應阻擋多精受精的原理是非常復雜的。精子先被透明帶的ZP3糖蛋白識別,誘發(fā)頂體反應后與ZP2糖蛋白結(jié)合才能到達卵質(zhì)膜與卵子融合[78]。精子的磷脂酶C(PLC)水解卵質(zhì)膜上的PI(4,5)P2,生成二?；视?DAG)和1,4,5-三磷酸肌醇(IP3)兩種第二信使分子;IP3結(jié)合內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的IP3受體促進卵子內(nèi)Ca2+釋放并激活鈣調(diào)蛋白依賴的蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ),DAG則負責激活蛋白激酶C(PKC),使肌動蛋白結(jié)合蛋白MARCKS磷酸化,最終鈣調(diào)蛋白與MARCKS結(jié)合,重塑肌動蛋白網(wǎng)絡,使皮質(zhì)顆粒發(fā)生胞吐[79]。

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)兩條皮質(zhì)反應阻擋多精受精的途徑。首先,經(jīng)皮質(zhì)反應釋放到卵周隙的皮質(zhì)顆粒內(nèi)容物中富含蛋白水解酶、卵過氧化物酶、N-乙酰氨基葡萄糖苷酶、糖基化物質(zhì)等[28]。這些物質(zhì)會改變透明帶的結(jié)構(gòu),使其阻止其余精子入卵[80]。例如,SAS1B也叫ovastacin,是一種卵巢組織特異性表達的限制性金屬內(nèi)切蛋白酶,也是皮質(zhì)顆粒的一種成分,最初分布在GV期卵母細胞的胞質(zhì)中,隨著卵母細胞的發(fā)育,SAS1B向邊緣移動,最終定位于MⅡ的微絨毛膜上[81],受精時與精子頂體膜的SLLP1結(jié)合,使兩層膜接觸[82]。受精后皮質(zhì)顆粒發(fā)生胞吐,SAS1B的表達量逐漸下降,到囊胚期幾乎檢測不到。精子入卵后,SAS1B隨皮質(zhì)顆粒排出,將透明帶上的ZP2蛋白裂解,使透明帶不能與精子結(jié)合,阻止多精受精[83]。同樣是通過透明帶反應阻止多精受精,卵母細胞與ERM蛋白家族中的ezrin蛋白共同孵育后,會增加透明帶的消化時間,減少透明帶上結(jié)合的精子數(shù)量,從而降低多精子入卵率[84]。并且,有研究發(fā)現(xiàn)精漿中也含有ezrin蛋白,會在第一個精子入卵后阻滯其余精子進入卵母細胞[85]。同時,精子膜、皮質(zhì)顆粒膜和卵質(zhì)膜都發(fā)生了復雜的融合,可能改變了卵質(zhì)膜的功能元件,從而在卵質(zhì)膜水平上阻止多精受精[86]。不同的物種會采用不同的方法阻擋多精入卵。例如,狗、山羊受精卵的卵周隙幾乎沒有精子,證明這些物種主要依靠透明帶反應阻止多精入卵;兔、豬受精卵的卵周隙存在大量精子,表明他們對多精受精的阻止主要在卵質(zhì)膜水平上;小鼠卵周隙存在少量精子,證明小鼠可以利用兩種途徑來保障單精入卵。有研究發(fā)現(xiàn),ERM蛋白家族與肌動蛋白、肌球蛋白-II共同介導卵母細胞的細胞力學,通過微絲重排牽引皮質(zhì)顆粒由胞質(zhì)向細胞皮層移動,到卵母細胞成熟時皮質(zhì)顆粒會沿質(zhì)膜呈線狀單層排列,這是皮質(zhì)顆粒行使一切功能的基礎[87]。

5 問題與展望

ERM家族特有的蛋白結(jié)構(gòu)讓它成為使很多膜蛋白與肌動蛋白形成互作關(guān)系的重要介質(zhì)。因此,ERM蛋白能夠作為肌動蛋白骨架與膜蛋白的交聯(lián)劑參與調(diào)節(jié)減數(shù)分裂極體的排出、卵母細胞與顆粒細胞間微絨毛的動態(tài)組裝以及成熟后的精卵融合等關(guān)鍵細胞活動。雖然ERM蛋白決定著卵母細胞的成熟質(zhì)量和受精卵能否正常形成。但是多年來很多研究者大都著眼于ERM蛋白在白細胞遷移和各類癌細胞增殖等病理領(lǐng)域的功能探索,對ERM蛋白在哺乳動物繁殖層面的研究尚有不足。近年來的文獻也只是淺顯地提到了ERM蛋白會影響卵母細胞減數(shù)分裂過程和受精指數(shù),缺乏對該蛋白作用機制的深入挖掘。未來從分子機制和生理水平上深入研究ERM蛋白的功能可能會是提高卵母細胞體外培養(yǎng)成熟率、保障后續(xù)的受精卵形成和胚胎發(fā)育的關(guān)鍵。