張路陽　張有建　饒聰穎　許燕彪　謝可　李偉　鄭聰

摘要：DUF538基因是沒有功能注釋的蛋白，在根結(jié)線蟲脅迫的響應(yīng)過程中，含有DUF538結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)的基因表達(dá)發(fā)生變化。鑒定煙草DUF538基因家族，為煙草DUF538基因功能研究提供理論依據(jù)，有利于篩選防御根結(jié)線蟲的有效基因?；跓煵萑蚪M數(shù)據(jù)，通過BLAST對煙草DUF538基因家族進(jìn)行鑒定，利用生物信息學(xué)的方法分析了該家族成員的理化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域、染色體分布、系統(tǒng)進(jìn)化及啟動(dòng)子，并利用qRT-PCR驗(yàn)證了DUF538基因家族在K326各個(gè)組織的表達(dá)情況及響應(yīng)南方根結(jié)線蟲侵染的表達(dá)情況。結(jié)果表明，煙草中共鑒定出8個(gè)NtDUF538基因，將其分為3類；已知的NtDUF538基因位于不同的染色體上且分布不均勻，所有NtDUF538基因均具有保守的結(jié)構(gòu)域；NtDUF538基因家族啟動(dòng)子區(qū)域顯著富集生長發(fā)育和激素響應(yīng)的順式元件，部分NtDUF538基因還具有低溫脅迫的作用元件；7個(gè)NtDUF538基因在K326不同組織中存在不同程度的表達(dá)，NtDUF538-7基因只在葉和花中表達(dá)，其中NtDUF538-5和NtDUF538-6在遭受根結(jié)線蟲侵染后表達(dá)量增加。研究結(jié)果揭示了煙草NtDUF538基因家族成員在根結(jié)線蟲侵染過程中起到重要作用，為探究煙草NtDUF538基因家族的生物學(xué)功能提供了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：煙草；DUF538基因；全基因組鑒定；生物信息學(xué)；表達(dá)分析；根結(jié)線蟲

中圖分類號：S572.01文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2023）20-0034-09

煙草（Nicotiana tabacum L.）是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物，病蟲害是制約其生產(chǎn)的主要因素之一，每年因?yàn)椴∠x害造成的經(jīng)濟(jì)損失到達(dá)15%以上，其中煙草根結(jié)線蟲病是煙草上危害程度深、范圍廣、防治難度大的一類病害［1-3］。目前，有關(guān)煙草根結(jié)線蟲病防治的研究和報(bào)道主要在化學(xué)防治和生物防治方面，但是煙草根結(jié)線蟲病并沒有得到徹底解決。煙草抗南方根結(jié)線蟲基因的篩選為南方根結(jié)線蟲抗性育種提供了新的基因資源，具有重要的理論及實(shí)際意義，有著廣闊的應(yīng)用前景［4-6］。未知功能域蛋白（domain of unknown function，DUF）家族是具有1個(gè)或多個(gè)沒有功能注釋的保守結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，目前已有超過20%的蛋白含有未知功能域［7］。DUF538基因家族已被證實(shí)具有約19～21 ku的分子量并編碼大約170個(gè)氨基酸殘基。目前DUF538家族已經(jīng)廣泛被發(fā)現(xiàn)存在于單子葉和雙子葉植物中［8-9］。但是在藻類和藍(lán)細(xì)菌中未發(fā)現(xiàn)DUF538蛋白［10］。盡管DUF538基因家族未明確功能，但目前已經(jīng)有大量研究證明DUF538基因家族參與植物多個(gè)生長發(fā)育和脅迫應(yīng)答反應(yīng)。據(jù)報(bào)道含有DUF538保守結(jié)構(gòu)域的基因參與毛狀體的發(fā)育，影響葉綠素的合成［8-10］。DUF538基因的表達(dá)變化存在于植物發(fā)育的各個(gè)階段以及響應(yīng)各種非生物脅迫。Ashraf等研究表明，DUF538基因（AJ535713）在雞冠花（Celosia cristata）葉片中表達(dá)，在干旱脅迫下該基因顯著上調(diào)［11-12］。另外，有一些研究顯示DUF538基因也參與生物脅迫。Xu等通過QTL定位大豆（Glycine max）抗根結(jié)線蟲基因，發(fā)現(xiàn)具有DUF538結(jié)構(gòu)域的大豆Glyma10g02180基因可能具有抗根結(jié)線蟲的功能［13］。在Araujo等的研究中，首次驗(yàn)證了從野生花生分離出來的DUF538基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥中過表達(dá)可以抵抗根結(jié)線蟲的侵染［14］。一些報(bào)道發(fā)現(xiàn)DUF538基因響應(yīng)真菌病原體的感染。Elagamey等研究發(fā)現(xiàn)DUF538基因參與馬鈴薯（Solanum tuberosum）抵抗黃萎病的途徑；Brunings 等發(fā)現(xiàn)水稻DUF538基因（Os11g0594800）在感染稻瘟病后顯著上調(diào)；此外也有報(bào)道DUF538基因跟植物抵抗赤霉病和灰霉病相關(guān)［15-18］。目前尚未有關(guān)于煙草DUF538基因家族及其成員表達(dá)的報(bào)道，因此，本研究以擬南芥DUF538家族蛋白質(zhì)序列為比對條件，在煙草全基因組的基礎(chǔ)上，利用生物信息學(xué)的方法鑒定煙草8個(gè)DUF538基因，并分析其家族成員的理化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進(jìn)化，通過 qRT-PCR 技術(shù)研究基因在煙草K326品種不同組織中的表達(dá)及接種南方根結(jié)線蟲后DUF538基因家族的表達(dá)情況。通過分析DUF538基因家族在煙草中的表達(dá)，為全面了解DUF538基因家族在煙草整個(gè)生長發(fā)育過程中的生物學(xué)功能提供了新的信息，篩選有利于防御南方根結(jié)線蟲抗病基因。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為普通煙草K326，由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院育種實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 試驗(yàn)時(shí)間及地點(diǎn)

本試驗(yàn)于2022年9月在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)育種實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.3 根結(jié)線蟲的培養(yǎng)

南方根結(jié)線蟲在番茄（Solanum lycopersicum L.）感病品種中擴(kuò)繁，由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院育種實(shí)驗(yàn)室提供。待番茄根部大量根結(jié)形成時(shí)，對有南方根結(jié)線蟲卵塊的根結(jié)進(jìn)行挑選，用1% NaClO溶液消毒，去離子水沖洗多次，去除表面的NaClO，然后放置于26 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵化。3 d左右，收集孵化出來的二齡幼蟲（J2s），在顯微鏡下計(jì)數(shù)，然后制成500條/mL的J2s懸浮液，懸浮液需在24 h內(nèi)進(jìn)行接種處理［19］。

1.4 煙草DUF538基因家族成員鑒定及序列特征分析

從擬南芥數(shù)據(jù)庫（www.arabidopsis.org）中下載擬南芥所有的DUF538蛋白序列，在茄科基因組數(shù)據(jù)庫（https：//solgenomics.net/）中進(jìn)行比對（BLASTP，E值<100），獲得普通煙草DUF538蛋白的氨基酸序列。通過在線網(wǎng)站（https：//web.expasy.org/protparam/）分析煙草DUF538蛋白的氨基酸數(shù)目、等電點(diǎn)（pI）、相對分子量大小、親水性等理化性質(zhì)。

1.5 煙草DUF538基因家族的進(jìn)化關(guān)系分析

將煙草DUF538基因家族蛋白序列與模式植物擬南芥的DUF538基因家族蛋白序列，利用MEGA 11軟件進(jìn)行Clustal W比對，使用鄰接法（neighbor-joining method，NJ），設(shè)置參數(shù)自展值（bootstrap replications）為1 000，利用J-T-T（Jones-Taylor-Thornton）模型構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。蛋白質(zhì)序列比對使用DNAMAN軟件，使用默認(rèn)參數(shù)。

1.6 煙草DUF538基因結(jié)構(gòu)、保守基序及結(jié)構(gòu)域分析

通過MEME在線網(wǎng)站（http：//meme-suite.org/tools/meme）對煙草DUF538蛋白序列進(jìn)行motif分析，CBLs設(shè)置Motif數(shù)量為10，其他設(shè)置使用默認(rèn)參數(shù)。保守結(jié)構(gòu)域（Domain）分析采用NCBI中的CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）；利用TBtools中Gene Structure View進(jìn)行Motif和保守結(jié)構(gòu)域的可視化。

1.7 煙草DUF538基因家族染色體定位

從煙草基因組的數(shù)據(jù)中獲得DUF538基因在染色體上的位置信息，利用Tbtools（v1.082）軟件構(gòu)建可視化染色體定位圖［20］。

1.8 煙草DUF538基因家族順式作用元件分析

通過軟件TBtools對煙草DUF538家族基因起始密碼子上游1 500 bp的啟動(dòng)子區(qū)序列進(jìn)行提取，然后通過PlantCARE數(shù)據(jù)庫（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）對煙草DUF538家族基因啟動(dòng)子區(qū)序列進(jìn)行順式作用元件分析，最后利用TBtools對結(jié)果可視化。

1.9 表達(dá)模式分析

利用植物總RNA提取試劑盒，分別提取根、莖、葉、花瓣、幼蕾、萼片的RNA。然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，取RNA溶液9 μL，（dT）18 引物 4 μL，在70 ℃反應(yīng) 10 min；加入5×buffer 4 μL，dNTP（10 nm）? 2 μL，反轉(zhuǎn)錄酶0.5 μL，RNA酶抑制劑 0.5 μL，在40 ℃反應(yīng)2 h，70 ℃反應(yīng)15 min，在-20 ℃保存。

檢測cDNA的質(zhì)量，確認(rèn)反轉(zhuǎn)錄成功后，再進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR。根據(jù)煙草NtDUF538的CDS設(shè)計(jì)引物（表1），將引物序列交給北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行合成。熒光實(shí)時(shí)定量PCR采用諾唯贊生物公司的Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix，采用的20 μL體系是：2×Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL；模板0.4 μL；水 8.8 μL；引物0.8 μL。熒光實(shí)時(shí)定量PCR程序：95 ℃ 預(yù)變性30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s，生成熔解曲線。采用2-ΔΔCT法對基因相對表達(dá)量進(jìn)行計(jì)算［21］。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草DUF538基因家族鑒定及基本特征分析

以擬南芥AtDUF538核苷酸序列為檢索序列，基于煙草全基因組數(shù)據(jù)庫，總共鑒定出8個(gè)煙草NtDUF538基因（表2）。煙草DUF538基因家族編碼的氨基酸長度范圍為170～203個(gè)氨基酸，分子量范圍為19.119～21.967 ku，等電點(diǎn)的值范圍為8.66～9.65。除了DUF538-1蛋白GRAVY值為正，其他煙草DUF538蛋白的GRAVY值為負(fù)，表明它們都是親水性的蛋白。

2.2 煙草DUF538基因家族結(jié)構(gòu)分析

基因結(jié)構(gòu)分析（圖1）顯示，煙草的8個(gè)DUF538基因家族成員結(jié)構(gòu)比較簡單，全部具有編碼區(qū)域（CDS），NtDUF538-3和NtDUF538-4不具有非翻譯區(qū)（UTR），8個(gè)基因都具有內(nèi)含子，且所有基因都具有DUF538結(jié)構(gòu)域（圖2）。

此外，為了更好地了解煙草DUF538蛋白序列的結(jié)構(gòu)（motif）特征，采用MEME軟件分析對保守motif和數(shù)量進(jìn)行分析，鑒定了5個(gè)不同的保守基序（圖3），依次命名為motif 1～motif 5。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，煙草DUF538家族成員保守基序均呈現(xiàn)一定的排列方式，為motif 5-motif 2-motif 1-motif 3-motif 4。每個(gè)亞組內(nèi)的DUF538蛋白大部分具有高度保守的motif，而不同的亞組具有不同的保守motif。

2.3 煙草DUF538基因家族成員的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析及染色體定位

為了分析煙草DUF538基因家族的進(jìn)化關(guān)系，本研究選用了模式植物雙子葉植物擬南芥與煙草共同構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。8個(gè)煙草DUF538蛋白和13個(gè)擬南芥蛋白在系統(tǒng)進(jìn)化樹中呈現(xiàn)了明顯的聚類現(xiàn)象。在圖4中，根據(jù)基因聚類DUF538基因家族可分為3類。8個(gè)煙草NtDUF538基因中NtDUF538-1分為一類；NtDUF538-2、NtDUF538-3和NtDUF538-4分為一類；NtDUF538-5、NtDUF538-6、NtDUF538-7和NtDUF538-8歸為一類。

從NtDUF538基因的染色體分布情況來看，在8個(gè)煙草NtDUF538基因中，4個(gè)基因在1條染色體上呈現(xiàn)不均勻分布，其余4個(gè)基因位于未組裝到染色體上的重疊群上，其余染色體不含煙草NtDUF538基因（圖4）。

2.5 煙草DUF538家族基因啟動(dòng)子區(qū)的順式作用元件分析

為進(jìn)一步了解煙草DUF538啟動(dòng)子區(qū)域順式作用元件特征，利用TBtools提取其轉(zhuǎn)錄起始位置上游1 500 bp序列上傳到 PlantCARE網(wǎng)站查找各類順式作用元件。發(fā)現(xiàn)4個(gè)煙草DUF538存在光信號響應(yīng)順式作用元件，推測其功能與光響應(yīng)通路有關(guān)。還鑒定到5種激素響應(yīng)元件，其中2個(gè)煙草DUF538基因含有赤霉素響應(yīng)元件（Gibberellin-responsive element），這部分家族成員會響應(yīng)赤霉素的應(yīng)答反應(yīng)；1個(gè)煙草NtDUF538基因含有水楊酸響應(yīng)（Salicylic acid responsiveness）元件，這部分基因家族成員會響應(yīng)水楊酸的應(yīng)答反應(yīng)；5個(gè)煙草NtDUF538基因含有茉莉酸甲酯響應(yīng)（MeJA-responsiveness）元件，這些基因家族成員會響應(yīng)茉莉酸的應(yīng)答反應(yīng)；4個(gè)煙草NtDUF538基因含有脫落酸響應(yīng)（Abscisic acid responsiveness）元件，這些基因家族成員會響應(yīng)脫落酸的應(yīng)答反應(yīng)；1個(gè)煙草NtDUF538基因含有生長素響應(yīng)（Auxin-responsive）元件，這些基因家族成員會響應(yīng)生長素應(yīng)答反應(yīng)。另外，還有與生長發(fā)育和逆境脅迫相關(guān)的順式作用元件，主要包括玉米蛋白代謝調(diào)節(jié)（Zein metabolism regulation）和低溫響應(yīng)（Low-temperature responsiveness）（圖5）。綜上，DUF538基因家族可能參與煙草生長發(fā)育調(diào)控及多種脅迫調(diào)控途徑。

2.6 煙草DUF538基因家族成員的表達(dá)分析

2.6.1 煙草DUF538基因在不同組織的表達(dá)分析 為了分析NtDUF538基因在不同組織或器官中的表達(dá)情況 本研究利用qRT-PCR技術(shù)分析了8個(gè)NtDUF538基因在煙草K326根、莖、葉、花、蕾、萼片中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，在K326中不同的NtDUF538基因的表達(dá)差異較大，NtDUF538-1、NtDUF538-3、NtDUF538-4和NtDUF538-5基因主要蕾中表達(dá)較高；NtDUF538-4、NtDUF538-5、NtDUF538-6、NtDUF538-7和NtDUF538-8在葉中表達(dá)相對較高；NtDUF538-2基因在萼片中表達(dá)較高；所有NtDUF538基因在莖中的相對較低；NtDUF538-7基因在葉和花中表達(dá)較高，在其他部位幾乎不表達(dá)（圖6）。

2.6.2 南方根結(jié)線蟲侵染后煙草DUF538基因的表達(dá)分析

為了驗(yàn)證NtDUF538基因?qū)δ戏礁Y(jié)線蟲脅迫下的表達(dá)情況，本研究利用qRT-PCR技術(shù)分析了8個(gè)NtDUF538基因在南方根結(jié)線蟲侵染煙草0、7、14、21 d的表達(dá)情況。結(jié)果表明：NtDUF538-1基因在遭受根結(jié)線蟲7 d時(shí)相比未接種的煙草基因表達(dá)量增加；NtDUF538-2和NtDUF538-3基因在根結(jié)線蟲侵染后基因表達(dá)量降低，在7、14 d時(shí)基因表達(dá)量與對照相比無顯著差異，在21 d時(shí)表達(dá)量與對照具有顯著差異；NtDUF538-4在遭受根結(jié)線蟲侵染7 d后表達(dá)量降低，然后升高再降低，而對照在遭受根結(jié)線蟲侵染后表達(dá)量逐漸降低；NtDUF538-5在根結(jié)線蟲侵然后表達(dá)量增高，在 21 d 時(shí)與對照表達(dá)量相當(dāng)；NtDUF538-6在根結(jié)線蟲侵染后7 d表達(dá)量增加，在14 d時(shí)顯著降低；NtDUF538-8在根結(jié)線蟲侵染后表達(dá)量先降低再升高，在14 d時(shí)表達(dá)量最低，而對照基因表達(dá)量逐漸降低，在21 d時(shí)表達(dá)量最低（圖7）。

3 討論

3.1 煙草DUF538家族基因的結(jié)構(gòu)特征及功能預(yù)測

DUF538基因已經(jīng)被證明廣泛分布在植物中，并在多個(gè)生長發(fā)育和脅迫應(yīng)答過程起作用。目前的研究已經(jīng)在多種植物中鑒定出DUF538家族基因，玉米含有DUF538成員20個(gè)，水稻和大麥都有14個(gè)，菠蘿中有8個(gè)，甘藍(lán)型油菜有40個(gè)，大豆有22個(gè)，擬南芥有13個(gè)，葡萄有9個(gè)。本研究對煙草DUF538基因家族成員[JP+2]進(jìn)行了鑒定和分析，共鑒定了8個(gè)煙草DUF538基因，低于其他物種中DUF538基因數(shù)量［22］。

目前，順式作用元件在植物生長發(fā)育、植物激素反應(yīng)和脅迫反應(yīng)中具有重要的作用。煙草DUF538基因家族包含了大量的順式作用元件，如光響應(yīng)的元件、激素響應(yīng)元件、低溫響應(yīng)元件等（圖5）。煙草DUF538基因家族亞細(xì)胞定位分析顯示煙草DUF538蛋白位于細(xì)胞核中，NtDUF538s基因可能是煙草重要的一類轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因，參與了煙草生長發(fā)育和抵抗逆境脅迫的調(diào)控過程。盡管DUF538尚未明確功能，但最近的研究表明，它們可能在植物脅迫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，在40多種植物中發(fā)現(xiàn)，DUF538基因表達(dá)行為響應(yīng)各種非生物脅迫，包括干旱、高溫、碳水化合物缺乏和氮毒性。據(jù)報(bào)道，DUF538蛋白還參與角質(zhì)蠟的細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸，影響葉片表面滲透性和水分損失控制［12，23-26］。

3.2 根結(jié)線蟲脅迫下，煙草DUF538基因家族的表達(dá)

當(dāng)植物受到病原物侵染后，體內(nèi)的抗性基因上調(diào)表達(dá)促進(jìn)寄主發(fā)生抗性反應(yīng)，破壞病原物的生存環(huán)境，阻止其生長發(fā)育。植物中的抗根結(jié)線蟲病基因，如番茄中的Mi基因、辣椒中的N基因等，在遭受根結(jié)線蟲侵染時(shí)會產(chǎn)生過敏（HR）反應(yīng)，同時(shí)該基因表達(dá)量顯著升高。在本研究中具有相似的情況，NtDUF538-5和NtDUF538-6基因在遭受根結(jié)線蟲入侵時(shí)，NtDUF538基因表達(dá)上調(diào)，未接種根結(jié)線蟲的根系NtDUF538基因相對表達(dá)量差異較?。▓D7），這表明根結(jié)線蟲的入侵促進(jìn)了NtDUF538基因的上調(diào)表達(dá)［27-28］。而且從進(jìn)化關(guān)系看，NtDUF538-5和NtDUF538-6親緣關(guān)系最近 同屬一個(gè)分支（圖4），同時(shí)也與擬南芥根結(jié)線蟲抗性基因距離較近。在之前的研究中已經(jīng)驗(yàn)證了DUF538基因在3種不同植物物種（花生、大豆和擬南芥）的RKN易感基因型中的過表達(dá)可以提高根結(jié)線蟲的抗性，這也是DUF538基因的首次驗(yàn)證［14］。NtDUF538-5和NtDUF538-6還具有響應(yīng)茉莉酸和水楊酸的順式作用元件（圖5）。水楊酸（SA）和茉莉酸（JA）是參與許多植物抗病途徑的主要植物防御激素。對于RKN侵染，植物在取食部位受到其分泌效應(yīng)物的影響，導(dǎo)致體內(nèi)SA和JA生物合成途徑相關(guān)基因的表達(dá)降低，從而降低SA和JA水平并抑制植物防御［29-30］?；谝陨涎芯?，煙草NtDUF538-5和NtDUF538-6可能與根結(jié)線蟲的抗性具有一定聯(lián)系。

4 結(jié)論

本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)，鑒定了煙草8個(gè)NtDUF538基因，進(jìn)行了理化性質(zhì)、遺傳進(jìn)化和表達(dá)模式分析，并研究了煙草K326侵染根結(jié)線蟲后其表達(dá)情況，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)煙草NtDUF538-5和NtDUF538-6基因遭受根結(jié)線蟲侵染后表達(dá)量發(fā)生顯著變化，這證明了南方根結(jié)線蟲入侵時(shí)，DUF538基因起到了關(guān)鍵作用。本研究結(jié)果將為煙草NtDUF538基因的功能研究奠定堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)，篩選有利于防治根結(jié)線蟲的抗性基因。

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收稿日期：2023-01-06

基金項(xiàng)目：浙江中煙工業(yè)有限責(zé)任公司項(xiàng)目（編號：NYK2022-04-03）。

作者簡介：張路陽（1997—），男，河南鄭州人，碩士研究生，主要從事煙草育種研究。E-mail：zhangluyang97@126.com。

通信作者：鄭 聰，碩士，農(nóng)藝師。E-mail：npyczc@163.com。