王利霞,朱利塞,鐘永亮,田 欣,林福新,王貴平,白挨泉,賈愛卿*

(1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院,廣東 佛山 528231;2.廣東海大畜牧獸醫(yī)研究院有限公司,廣東 廣州 511400;3.廣東省養(yǎng)豬與豬病防控技術(shù)研究企業(yè)重點實驗室,廣東 廣州 511400)

豬細小病毒病(porcine parvovirus infection,PPI)是懷孕母豬感染豬細小病毒(porcine parvovirus,PPV)導(dǎo)致產(chǎn)木乃伊胎、死胎、弱仔和分娩周期延長、重復(fù)配種和不孕等繁殖障礙疾病[1]。PPV對各種年齡、性別的豬都易感,特別對初產(chǎn)母豬和仔豬的危害最為嚴(yán)重,且母豬不表現(xiàn)出臨床癥狀[2]。迄今為止,在豬身上發(fā)現(xiàn)了7種PPV基因型(PPV1～PPV7)。有研究調(diào)查在2016—2020年之間中國8個省份采集的435份臨床樣本中共有241份為PPV陽性,感染率占55.4%[3]。PPV基因組主要包含2個主要的開放閱讀框,上游開放閱讀框編碼非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2和NS3),對病毒DNA復(fù)制和基因表達調(diào)控起重要作用[4]。下游開放閱讀框編碼結(jié)構(gòu)蛋白(VP1、VP2和VP3),在病毒組裝和感染中起主要作用,包括病毒吸附、侵入、運輸及定位、自組裝和釋放等[5-6]。其中VP2蛋白是主要的衣殼蛋白,含有多種抗原表位,為主要中和抗體的靶蛋白并可自組裝成病毒樣顆粒(virus-like particles,VLPs)[7],在研發(fā)疫苗和診斷試劑中發(fā)揮重要作用。

目前國內(nèi)PPV的防控和凈化工作形勢嚴(yán)峻,迫切需要PPV疫苗等防控技術(shù)與產(chǎn)品?，F(xiàn)國內(nèi)市場上PPV疫苗都為全病毒滅活苗,其優(yōu)點是安全、產(chǎn)生的抗體持續(xù)時間長且儲存方便,不需要低溫保存,但也存在抗體產(chǎn)生較慢、副作用較大、不能誘導(dǎo)細胞免疫以及免疫效果不穩(wěn)定,使用劑量大和成本較高的問題[8-9]。與此同時,多項研究已經(jīng)表明基因工程亞單位疫苗不含病毒感染組分,安全無致病性,其為病毒表面的特定蛋白,經(jīng)純化后免疫針對性強,配合理想佐劑使用可產(chǎn)生高效特異性抗體,適合規(guī)?；a(chǎn)等特點[10],如今重組亞單位疫苗被認(rèn)為是開發(fā)多種病毒疫苗的候選者。目前國內(nèi)已批準(zhǔn)上市的獸藥亞單位疫苗有豬圓環(huán)病毒2型亞單位疫苗,王世旗等[9]研究表明亞單位疫苗的應(yīng)激率和死淘率都低于全病毒滅活苗組。因此研發(fā)一款安全高效的新型PPV疫苗至關(guān)重要。VP2蛋白與PPV的抗原性密切相關(guān),其含有大部分B細胞活性蛋白,被認(rèn)為是PPV疫苗的主要免疫保護性抗原[11]。本研究通過原核表達系統(tǒng)構(gòu)建了與伴侶蛋白共表達,促進VP2蛋白以正確構(gòu)象折疊;同時,構(gòu)建了另一個冷休克表達載體,使VP2蛋白在低溫條件下被特異性誘導(dǎo)表達,提高蛋白的溶解性和穩(wěn)定性,避免以包涵體形式表達。2個重組載體都成功獲得了可溶性VP2蛋白,使用MontanideTMISA 206 VG佐劑混合乳化(簡稱206佐劑)制備PPV VP2亞單位疫苗,將PPV VP2亞單位疫苗免疫豚鼠,分析其血凝抑制抗體效價,為研發(fā)PPV亞單位疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病毒、質(zhì)粒與菌株pET28a質(zhì)粒和PPV毒株由本實驗室保存;pTF16分子伴侶質(zhì)粒和pCold Ⅰ質(zhì)粒購自武漢淼靈生物科技有限公司;感受態(tài)細胞DH5α、BL21(DE3)購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.2 酶、試劑與實驗動物蛋白Marker、DNA Ligation Kit、限制性內(nèi)切酶購自寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司;辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗豚鼠IgG購于碧云天生物技術(shù)有限公司;鎳親和層析柱購于Cytiva公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。體質(zhì)量為300～400 g雌性健康豚鼠,購自南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

1.3 PPV VP2基因的擴增基于GenBank(登錄號:QII89074.1)已發(fā)表的PPV VP2基因序列,應(yīng)用引物軟件設(shè)計1對PCR擴增引物,上游引物P1:(BamHⅠ)5′-ACGCGTCGACATGGGTGGCGGA-AGTGGAATGTCAGAAAATGTAGA-3′;下游引物P2:(Sal I)5′-CGCGGATCCATAGAGCTTT-CTCGGGATCAATT-3′。以PPV毒株DNA為模板,P1、P2為上、下游引物,反應(yīng)程序為:預(yù)熱94℃ 5 min;變性 94℃ 30 s,退火 56℃ 30 s,延伸 72℃ 1.5 min,30個循環(huán);72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖電泳鑒定后,回收目的片段。

1.4 原核表達載體的構(gòu)建與鑒定將VP2 PCR產(chǎn)物與原核表達載體pET28a和pColdⅠ,分別用BamHⅠ、SalⅠ進行雙酶切,回收酶切產(chǎn)物后,用DNA 連接酶于4℃下連接過夜,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞DH5α,涂布于含有對應(yīng)抗性的LA平板上,將PCR鑒定為陽性的單克隆菌液進一步提取質(zhì)粒,經(jīng)雙酶切和測序驗證。將構(gòu)建成功的表達載體pET28a-VP2轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞BL21(DE3)中,挑取陽性單克隆菌株制成感受態(tài)細胞,并將分子伴侶質(zhì)粒pTF16轉(zhuǎn)化至上述感受態(tài)細胞中,37℃恒溫箱培養(yǎng)16 h,挑取單克隆菌落搖菌培養(yǎng),篩選陽性共表達重組菌。

1.5 重組蛋白的表達及鑒定

1.5.1重組蛋白表達及條件優(yōu)化 將重組菌pET28a-VP2-tf16、pCold Ⅰ-VP2接種至含對應(yīng)抗性的LB培養(yǎng)基中,以37℃、220 r/min震蕩培養(yǎng)至D600≈0.5,進行誘導(dǎo)表達,添加濃度為1.0 mmol/L IPTG,另外pET28a-VP2-tf16還需添加質(zhì)量濃度為2 g/LL-阿拉伯糖,15℃誘導(dǎo)表達24 h。離心收集菌體,用懸浮緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl,150 mmol/L NaCl,pH=8.0)洗滌菌體,置于冰上超聲破碎,離心收集上清液和沉淀SDS-PAGE驗證表達形式。選擇高效表達的重組菌株進行最佳誘導(dǎo)條件優(yōu)化,固定誘導(dǎo)劑IPTG濃度1.0 mmol/L,時間為24 h,誘導(dǎo)溫度設(shè)置為30,25,15℃;固定誘導(dǎo)劑IPTG濃度為1.0 mmol/L,重組蛋白pET28a-VP2-tf16誘導(dǎo)溫度設(shè)定為15℃,誘導(dǎo)時間設(shè)置為12,16,20,24 h;固定誘導(dǎo)時間為24 h,重組蛋白pET28a-VP2-tf16誘導(dǎo)溫度設(shè)定為15℃,重組蛋白pCold Ⅰ-VP2誘導(dǎo)溫度設(shè)定為25℃,IPTG濃度設(shè)置為1.0,0.7,0.3,0.1 mmol/L。將上述蛋白樣品超聲破碎后SDS-PAGE,以目的條帶表達量確定最優(yōu)誘導(dǎo)條件。確定表達條件后利用鎳親和層析柱純化重組蛋白。

1.5.2重組蛋白Western blot鑒定 將重組蛋白進行SDS-PAGE電泳,利用蛋白濕轉(zhuǎn)儀將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上,5%脫脂奶粉4℃封閉過夜,PBST洗滌2次,用PPV特異性血清為一抗,室溫?fù)u床孵育1 h,PBST洗滌4次,再加入相對應(yīng)的HRP標(biāo)記二抗,室溫?fù)u床孵育1 h,PBS洗滌4次后,用DAB法顯色。

1.5.3重組蛋白VLP電鏡鑒定 為確定pCold Ⅰ-VP2重組蛋白能否在體外組裝成VLPs,取透析后重組蛋白照透射電鏡。

1.5.4重組蛋白血凝活性鑒定 取96孔V型板,每孔加入25 μL PBS,從第2列開始等體積2倍稀釋重組蛋白,最后加入25 μL 0.6% 豚鼠紅細胞懸液,置室溫30～45 min判定結(jié)果,以100%凝集紅細胞時的最高稀釋倍數(shù)為血凝效價。

1.6 免疫原性評估將30只豚鼠隨機均分為3組。1組每只豚鼠免疫pCold Ⅰ-VP2蛋白和206佐劑乳化制備的VP2亞單位疫苗0.5 mL(含重組蛋白100 μg),2組免疫PPV商品化滅活苗0.5 mL,3組免疫PBS 0.5 mL。兩側(cè)腿部肌肉多點注射,間隔28 d后二次免疫。免疫前和一免后14,28,42 d心臟采血,收集血清。利用HI試驗進行抗體水平的測定。

2 結(jié)果

2.1 VP2 PCR擴增以PPV病毒培養(yǎng)液為模板,P1、P2為引物,擴增獲得條帶為1 740 bp的目的片段,如圖1所示,與預(yù)期結(jié)果相符。

M.DL2000 DNA Marker;1.VP2基因PCR產(chǎn)物

2.2 重組質(zhì)粒的鑒定重組質(zhì)粒pET28a-VP2-tf1和pCold Ⅰ-VP2分別經(jīng)BamHⅠ和SalⅠ雙酶切鑒定,分別獲得1 740,5 369和4 407 bp的條帶,如圖2所示,表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

M.DL5000 DNA Marker;1.pET28a-VP2質(zhì)粒對照;2.pET28a-VP2質(zhì)粒雙酶切;3.pCold Ⅰ-VP2質(zhì)粒對照;4.pCold Ⅰ-VP2質(zhì)粒雙酶切

2.3 重組蛋白的表達重組質(zhì)粒pET28a-VP2-tf16和pCold Ⅰ-VP2在D600≈0.5時,添加濃度為1.0 mmol/L IPTG,15℃誘導(dǎo)表達24 h。表達產(chǎn)物通過SDS-PAGE鑒定,都獲得了相對分子質(zhì)量大小約為66.4 kDa的目的蛋白,與預(yù)期大小一致,未誘導(dǎo)菌無特異性條帶。超聲破碎后結(jié)果顯示,重組蛋白上清中有可溶性目的蛋白,部分以包涵體形式表達,如圖3所示。

A.pET28a-VP2-tf16表達的SDS-PAGE結(jié)果(M.蛋白Marker;1.15℃加IPTG/L-阿拉伯糖誘導(dǎo)24 h全菌;2.15℃不加誘導(dǎo)劑24 h全菌;3.菌體破碎上清;4.菌體破碎沉淀);B.pCold Ⅰ-VP2表達的SDS-PAGE結(jié)果(M.蛋白Marker;1.15℃加IPTG誘導(dǎo)24 h全菌;2.15℃不加誘導(dǎo)劑24 h全菌;3.菌體破碎沉淀;4.菌體破碎上清)

2.4 重組蛋白表達及條件優(yōu)化為篩選高效表達的重組菌株進行最佳誘導(dǎo)條件優(yōu)化,結(jié)果顯示,誘導(dǎo)溫度分別設(shè)定為30,25,15℃時,誘導(dǎo)溫度為25℃的重組蛋白pET28a-VP2-tf16的上清表達量最高,誘導(dǎo)溫度為15℃的重組蛋白pCold Ⅰ-VP2的上清表達量最高(圖4A);誘導(dǎo)時間分別設(shè)定為12,16,20,24 h時,當(dāng)誘導(dǎo)時間為24 h,2個重組蛋白上清表達量均為最高(圖4B);設(shè)定IPTG的濃度分別1.0,0.7,0.3,0.1 mmol/L,當(dāng)IPTG濃度為1.0 mmol/L時,2個蛋白上清表達量均為最高(圖4C)。由此得出重組蛋白pET28a-VP2-tf16可溶性目的蛋白最佳誘導(dǎo)表達條件為添加濃度1.0 mmol/L IPTG,25℃誘導(dǎo)表達24 h;重組蛋白pCold Ⅰ-VP2可溶性目的蛋白最佳誘導(dǎo)表達條件為添加濃度1.0 mmol/L IPTG,15℃誘導(dǎo)表達24 h。通過比較分析2個重組蛋白的表達效率,pCold Ⅰ-VP2重組蛋白在誘導(dǎo)表達時不需要額外添加L-阿拉伯糖,經(jīng)SDS-PAGE灰度分析其可溶性目的蛋白表達量和純度更高,在大批量表達過程中工藝相對簡單,因此后續(xù)試驗選擇其進行鑒定及免疫效果評估。

A．蛋白表達的最佳誘導(dǎo)溫度SDS-PAGE結(jié)果(M.蛋白 Marker;1,3,5.分別為pET28a-VP2-tf16在30,25,15℃誘導(dǎo)表達后的超聲破碎上清;2,4,6.分別為pCold Ⅰ-VP2在30,25,15℃誘導(dǎo)表達后的超聲破碎上清);B.蛋白表達的最佳誘導(dǎo)時間SDS-PAGE結(jié)果(M.蛋白 Marker;1,3,5,7.分別為pCold Ⅰ-VP2誘導(dǎo)12,16,20,24 h誘導(dǎo)后的破碎上清;2,4,6,8.分別為pET28a-VP2-tf16誘導(dǎo)12,16,20,24 h誘導(dǎo)后的破碎上清);C.蛋白表達的最佳誘導(dǎo)劑濃度SDS-PAGE結(jié)果(M.蛋白 Marker;1～4.分別為pCold Ⅰ-VP2在IPTG終濃度為1.0,0.7,0.3,0.1 mmol/L誘導(dǎo)表達后的超聲破碎上清;5～8.分別為pET28a-VP2-tf16在IPTG終濃度為1.0,0.7,0.3,0.1 mmol/L誘導(dǎo)表達后的超聲破碎上清)

2.5 重組蛋白純化及Western blot鑒定重組蛋白pCold Ⅰ-VP2誘導(dǎo)表達后經(jīng)鎳親和層析柱純化,SDS-PAGE結(jié)果表明(圖5 A),洗脫重組蛋白條帶清晰,無雜蛋白條帶,純化效果好。將重組蛋白電轉(zhuǎn)印至PVDF膜上,用PPV特異性血清(圖5B)進行蛋白免疫印跡鑒定,在約66.4 kDa處出現(xiàn)特異性的顯色目的條帶,空載體處無特異性條帶。因此pCold Ⅰ-VP2重組蛋白能PPV特異性血清發(fā)生特異性反應(yīng),具有一定的免疫反應(yīng)性。

A.重組蛋白純化SDS-PAGE結(jié)果(M.蛋白Marker;1.pCold Ⅰ-VP2蛋白上樣液;2.pCold Ⅰ-VP2蛋白洗脫液);B.Western blot鑒定結(jié)果(M.預(yù)染蛋白Marker;1.空載體;2.pCold Ⅰ-VP2表達蛋白)

2.6 重組蛋白電鏡及血凝活性鑒定透射電鏡結(jié)果顯示pCold Ⅰ-VP2重組蛋白能自組裝成VLPs,如圖6 A所示。血凝試驗顯示重組蛋白與豚鼠紅細胞反應(yīng)具有血凝活性,血凝效價為1∶32,與PPV滅活病毒液效價相當(dāng),如圖6 B所示。

A.透射電鏡結(jié)果;B.血凝試驗結(jié)果

2.7 豚鼠免疫效果評估采用豚鼠紅細胞血凝抑制試驗檢測其HI抗體水平,如圖7所示,一免14 d時VP2亞單位疫苗組和商品化滅活苗組HI抗體均有上升,VP2亞單位疫苗組HI抗體效價為1∶256,商品化滅活苗組HI抗體效價為1∶256,符合PPV疫苗免疫合格標(biāo)準(zhǔn)。二免14 d時,2個疫苗免疫組的HI抗體效價整體上升,VP2亞單位疫苗組HI抗體效價達到1∶1 024,商品化滅活苗組HI抗體效價達到1∶1 024,空白組HI抗體檢測為陰性(<1∶8),證明VP2亞單位疫苗組免疫豚鼠能產(chǎn)生高滴度的血凝抑制抗體,且與商品化滅活苗免疫效果相當(dāng)。

圖7 豚鼠免疫血清HI抗體效價

3 討論

國內(nèi)從1983年首次發(fā)現(xiàn)PPV時起,各地區(qū)的豬群中都有PPI的發(fā)生,同時在散養(yǎng)戶中長期廣泛傳播。PPV在外界環(huán)境中極其穩(wěn)定,能夠生存長達幾個月之久,對大部分消毒劑都具有一定的抵抗力,生物安全風(fēng)險較高[3]。目前國內(nèi)外研究PPV疫苗種類有很多,基于基因工程亞單位疫苗有以下研究,1992年MARNITEZ等[7]利用重組桿狀病毒表達載體pJVP10在sf9細胞中成功表達PPV主要衣殼蛋白VP2蛋白,通過硫酸銨沉淀細胞裂解物獲得高純度且能自組裝成VLPs的重組蛋白,血凝滴度與PPV病毒相同甚至更高,同商品化滅活苗免疫豬所獲得的抗體滴度相當(dāng)。桿狀病毒表達系統(tǒng)是真核蛋白表達最常用的系統(tǒng)之一,特別是需要翻譯后修飾和以真核細胞環(huán)境進行適當(dāng)折疊的蛋白質(zhì)[12]。但由于生產(chǎn)重組蛋白基于桿狀病毒系統(tǒng)在技術(shù)上要求很高,且需要使用無菌生物反應(yīng)器,導(dǎo)致生產(chǎn)費用成本可能過高。司艷紅等[13]2006年首次報道了VP2重組蛋白在大腸桿菌中的表達,利用PCR方法擴增出VP2完整的編碼區(qū)并克隆至載體pET-32a中,誘導(dǎo)表達得到約為84 kDa的VP2蛋白,蛋白以包涵體形式表達,用His標(biāo)簽抗體和純化后包涵體免疫家兔血清進行Western blot檢測到特異性條帶,證實表達蛋白具有一定的免疫原性。在2009年QI等[14]測序出VP2基因中含有大量稀有密碼子,這增加了VP2表達的難度,研究選用大腸桿菌Rosetta作為表達菌株,能夠提高外源基因的表達。結(jié)果也得出VP2重組蛋白能夠以上清形式表達,且用PPV陽性血清對上清重組蛋白進行Western blot鑒定,具有一定的抗原性?？芍庠椿蛟诖竽c桿菌中的表達因素也受到表達載體和宿主菌的影響。后JI等[15]、宋品等[16]使用分子伴侶質(zhì)粒和小分子泛素相關(guān)修飾物標(biāo)簽與VP2蛋白共表達,獲得了可自組裝成VLPs的VP2重組蛋白。由此也證明基因融合標(biāo)簽和伴侶蛋白可被用來避免表達蛋白時的錯誤折疊,減少其降解和包涵體的形成,同時VLPs的組裝效率與溫度、pH值、離子強度等關(guān)系密切。

有研究報道,當(dāng)大腸桿菌培養(yǎng)溫度降到低溫時會暫時停止生長,大部分的大腸桿菌蛋白質(zhì)表達會下降,但是CpsA是一種冷休克基因,可以將蛋白質(zhì)在低溫時被特異性誘導(dǎo)表達,并且提高蛋白的溶解性和穩(wěn)定性[17]。因此本研究利用原核表達載體pET28a、分子伴侶質(zhì)粒pTF16與PPV VP2基因構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-VP2-tf16;冷休克表達載體pCold Ⅰ與PPV VP2基因重組構(gòu)建重組質(zhì)粒pCold Ⅰ-VP2,2個重組表達載體分別轉(zhuǎn)至BL21(DE3)進行誘導(dǎo)表達,蛋白超聲破碎后上清中獲得可溶性目的蛋白。通過設(shè)置不同誘導(dǎo)時間、溫度和誘導(dǎo)劑濃度,確定了重組蛋白pET28a-VP2-tf16在添加濃度1.0 mmol/L IPTG,25℃誘導(dǎo)表達24 h可獲得較高可溶性目的蛋白;重組蛋白pCold Ⅰ-VP2在添加濃度1.0 mmol/L IPTG,15℃誘導(dǎo)表達24 h可獲得較高可溶性目的蛋白。通過比較分析2個重組蛋白的表達效率,pCold Ⅰ-VP2重組蛋白在誘導(dǎo)表達時不需要額外添加L-阿拉伯糖,經(jīng)SDS-PAGE灰度分析其可溶性目的蛋白表達量更高且雜蛋白較少,在大批量表達過程中工藝相對簡單。最終確定使用冷休克表達系統(tǒng)用于后續(xù)研究。將pCold Ⅰ-VP2重組蛋白進行鎳親和層析柱純化得到高純度目的蛋白,用Western blot鑒定蛋白能顯示出特異性目的條帶,具有一定的免疫反應(yīng)性,其在電鏡下觀察能自組裝成VLPs,能特異性凝集豚鼠紅細胞,具有血凝活性。使用206 VG佐劑與重組蛋白液等體積混合乳化30～50 min,形成穩(wěn)定的水包油包水劑型。把制備好的VP2亞單位疫苗(含重組蛋白100 μg)接種豚鼠,在一免14 d時測得血凝抑制效價達到1∶256,二免14 d時效價達到1∶1 024,與商品化滅活苗組的效價相當(dāng)。證明本實驗室研制的VP2亞單位疫苗免疫豚鼠后能產(chǎn)生高滴度的血凝抑制抗體效價,為下一步研究新型安全高效的PPV VP2亞單位疫苗奠定了基礎(chǔ)。