郭笑然,韓 穎,劉帥峰,劉小娜,雷白時,張武超,趙 款,2*,袁萬哲,2*

(1.河北農業(yè)大學 動物醫(yī)學院,河北 保定 071001;2.河北省獸醫(yī)生物技術創(chuàng)新中心,河北 保定 071001)

塞內卡病毒A(Senecavirus A,SVA)是一種單股正鏈RNA病毒,該病毒屬于小核糖核酸病毒科、塞內卡病毒屬,其病毒基因組約為7.2 kb[1]。最初SVA在PER.C6的細胞培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)并分離出來,后來發(fā)現(xiàn)豬可以感染SVA,感染后吻端和蹄部冠狀帶出現(xiàn)水泡、并伴有跛行、厭食和嗜睡,與口蹄疫、豬水皰性口炎、豬水皰病等具有相似的臨床癥狀[2-3]。

自2014年以來,在加拿大、美國、巴西和中國等多個國家暴發(fā)了由SVA引起的水皰性相關疾病,造成了巨大的經(jīng)濟損失[4-6]。雖然近年來SVA得到了廣泛研究,但是目前仍然沒有針對SVA的相關疫苗。美國布魯金斯州立大學SHARMA等[7]利用反向遺傳操作系統(tǒng)對SVA進行改造,拯救出1株重組的致弱病毒(rSVA mSacⅡ),通過體內試驗證實該重組病毒感染豬后未表現(xiàn)出任何臨床癥狀,減弱了病毒血癥,口腔、鼻腔分泌物和糞便排毒量明顯減少。雖然該重組病毒被致弱,但是該病毒保留了良好的免疫原性,能夠刺激機體誘導產(chǎn)生針對SVA的中和抗體,對豬起到保護作用。雖然弱毒疫苗可以誘導更長時間的免疫反應,但是弱毒疫苗存在毒力返強等安全性隱患[7]。YANG等[8]對SVA滅活疫苗進行了相關研究和評價,結果表明,SVA滅活疫苗也能夠對豬只起到很好的保護作用。但是傳統(tǒng)滅活苗免疫效果持續(xù)時間短,常需多次免疫才能得到較好保護,費時費力且成本較高,有必要對其進行改造。

粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)基因全長為435 bp,編碼144個氨基酸,通過增殖、活化樹突狀細胞(DC),刺激產(chǎn)生細胞因子,增強抗原遞呈能力,促進T細胞的成熟和分化[9]。目前,GM-CSF已經(jīng)成為公認的疫苗佐劑,在腫瘤、病毒疫苗研究中廣泛應用,并具有良好的免疫應答增強作用。已報道選用GM-CSF可以增強機體對豬繁殖與呼吸綜合征病毒[10]、豬圓環(huán)病毒2型[11]、口蹄疫病毒[12]的免疫應答能力。基于此,本研究利用實驗室構建的SVA反向遺傳操作系統(tǒng),在其基因組插入GM-CSF,獲得嵌合GM-CSF的重組A型塞內卡病毒,為該病的預防和控制提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 病毒、細胞和載體SVA HeB-2019(GenBank:MZ375462)毒株的全長cDNA感染性克隆rSVA由本實驗室構建并保存[13],重組質粒pGM-CSF-T2A、pOK-CMV-Actin載體和幼倉鼠腎細胞(BHK-21)均由實驗室保存。

1.2 主要試劑PrimeSTAR?HS DNA Polymerase購自TaKaRa公司;限制性核酸內切酶和NEB-uilder HiFi DNA同源重組試劑盒購自NEB公司;X-tremeGENE HP DNA轉染試劑購自Roche公司;DH5α感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術有限公司;DMEM細胞培養(yǎng)基購自Gibico公司;抗豬GM-CSF蛋白的多克隆抗體(PAb)購自RD公司;羊抗兔IgG-FITC 和羊抗豬IgG-RBITC均購自索萊寶生物科技有限公司。

1.3 嵌合GM-CSF的重組SVA的構建與拯救

1.3.1rSVA-GM-CSF感染性克隆的構建 以實驗室前期構建的SVA/HeB-2019全長感染性克隆rSVA為基礎,在基因組2A和2B蛋白間插入GM-CSF-T2A基因,構建重組質粒SVA-GM-CSF。其中T2A為明脈扁刺蛾病毒(thosea asigna virus)的2A基因,其編碼的2A蛋白具有高效的體內自我剪切活性[14]。根據(jù)已知SVA 2A、2B位置和序列設計相應同源臂引物,以重組的pGM-CSF-T2A為模板,分別采用GM-CSF-F/R引物,通過PCR擴增得到pGM-CSF-T2A片段;以本實驗室前期構建rSVA cDNA感染性克隆質粒為模板,分別利用B1-F/R、B3-F/R引物擴增得到SVA-B1和SVA-B3片段;以B1-F/B3-R為引物,通過融合PCR方法將GM-CSF-T2A插入到SVA的2A和2B之間獲得融合片段SVA-B-GM-CSF;利用A-F/R和C-F/R引物,以rSVA cDNA感染性克隆質粒為模板,PCR擴增得到SVA-A和SVA-C片段,引物序列見表1。將pOK-CMV-Actin利用EcoR Ⅰ線性化,將線性化片段與SVA基因組的A、B-GM-CSF和C片段通過NEB-uilder HiFi DNA同源重組試劑盒克隆至pOK-CMV-Actin載體,轉化到DH5α感受態(tài)細胞,經(jīng)菌液PCR和測序鑒定陽性即獲得基于真核雙啟動子的重組質粒SVA-GM-CSF(圖1)。

圖1 重組病毒SVA-GM-CSF的構建策略

A.Mock;B.SVA;C.rSVA-GM-CSF

M.DL2000 DNA Marker;1.rSVA-GM-CSF;2.SVA;3.Mock

表1 RT-qPCR引物

1.3.2rSVA-GM-CSF的拯救 當單層BHK-21細胞生長至80%時,取3 μg rSVA-GM-CSF重組質粒在6 μL X-tremeGENE HP DNA的介導下進行轉染,同時用等量的X-tremeGENE HP DNA設空白對照,置于含5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后收獲病毒。反復凍融3次后繼續(xù)在BHK-21細胞上傳代,直到病毒能夠穩(wěn)定產(chǎn)生致細胞病變效應。將拯救出的病毒命名為rSVA-GM-CSF。

1.3.3重組病毒的RT-PCR擴增 提取重組病毒和親本病毒的RNA,以總RNA為模板反轉錄獲得cDNA,以此為模板,利用特異性引物GM-CSF-F/R進行RT-PCR擴增。PCR產(chǎn)物為在1%瓊脂糖凝膠上進行電泳并測序。

1.3.4間接免疫熒光(indirect immunofluorescence assay,IFA) 將F5代重組病毒和親本病毒分別感染BHK-21細胞,24 h后棄培養(yǎng)液,用4%多聚甲醛固定20 min,0.1%Triton X-100通透20 min,5%BSA 37℃封閉1 h。分別用抗SVA VP2 蛋白的多克隆抗體(1∶200)和抗豬GM-CSF蛋白的多克隆抗體(1∶250)作為一抗,熒光標記的羊抗兔IgG-FITC和羊抗豬IgG-RBITC為二抗進行IFA鑒定。

1.3.5重組病毒的生長曲線 為評價重組病毒的生長特性,將F5代重組病毒和親本病毒以0.5 MOI分別感染BHK-21細胞,收取12,24,36,48,60,72 h病毒上清液。將收獲的病毒進行10倍梯度稀釋,每個稀釋度重復8次,觀察細胞病變情況并記錄細胞病變,利用Reed-Muench法測定不同時間點的TCID50,繪制病毒一步生長曲線。

1.3.6遺傳穩(wěn)定性分析 為了評估插入外源片段重組病毒的遺傳穩(wěn)定性,將重組病毒在BHK-21細胞上連續(xù)傳至10代,取F5、F10代細胞培養(yǎng)上清提取病毒RNA,以總RNA為模板反轉錄后得到cDNA,以此為模板,采用引物SVA-F/R對外源基因進行RT-PCR擴增及測序鑒定。

2 結果

2.1 SVA-GM-CSF全長cDNA感染性克隆的構建利用PCR方法分別擴增得到SVA-A、SVA-B-GM-CSF和SVA-C片段,再利用NEB-uilder HiFi DNA同源重組試劑盒將3個片段克隆至pOK-CMV-Actin載體,最終構成重組質粒SVA-GM-CSF(圖2)。

2.2 rSVA-GM-CSF的拯救將測序鑒定正確的重組質粒SVA-GM-CSF轉染BHK-21細胞72 h后收取細胞上清,反復凍融3次后接種到BHK-21細胞盲傳。結果顯示,隨著代次的升高,出現(xiàn)CPE的時間逐漸變短,病變也更加明顯。當傳至F5代時,細胞在36 h出現(xiàn)明顯CPE,細胞圓縮,脫落,與其親本病毒產(chǎn)生的CPE一致(圖3)。

2.3 rSVA-GM-CSF的鑒定

2.3.1重組病毒的RT-PCR擴增與測序鑒定 收取第5代重組病毒的細胞上清液,提取病毒RNA,用引物GM-CSF-F/R擴增重組病毒所含的GM-CSF基因片段,1%瓊脂糖凝膠核酸電泳結果顯示,可得到長約596 bp的目標片段(圖4)。將目的片段正確的PCR產(chǎn)物純化回收后送至公司測序,結果表明插入的外源片段GM-CSF的序列沒有發(fā)生缺失和突變。

2.3.2rSVA-GM-CSF的間接免疫熒光鑒定 重組病毒rSVA-GM-CSF與親本毒分別感染BHK-21細胞,在感染后24 h,采用抗SVA VP2蛋白和GM-CSF的多克隆抗體分別進行IFA檢測,間接免疫熒光結果顯示,重組病毒和親本病毒感染BHK-21細胞均出現(xiàn)SVA特異性綠色熒光;重組病毒感染BHK-21細胞后可檢測到抗GM-CSF的特異性紅色熒光,而親本毒未觀察到熒光,表明重組病毒感染BHK-21細胞后插入的GM-CSF基因能夠正確表達(圖5)。

A,d.rSVA-GM-CSF;b,e.SVA;c,f.Mock

2.4 rSVA-GM-CSF的生長動力學分析為驗證rSVA-GM-CSF重組病毒與親本毒之間生長特性的差異,分別將SVA和rSVA-GM-CSF感染BHK-21細胞,分析病毒生長曲線。試驗結果表明,重組病毒與親本病毒在BHK-21細胞中表現(xiàn)相似的生長曲線。均在感染12 h后病毒滴度逐步上升,在36 h病毒滴度達到最高值,之后趨于平穩(wěn)(圖6)。

圖6 rSVA-GM-CSF病毒及其親本毒株的生長曲線

A.rSVA-GM-CSF的PCR鑒定(M.DL2000 DNA Marker;1.Mock;2.rSVA-GM-CSF F5;3.rSVA-GM-CSF F10;4.SVA);B.rSVA-GM-CSF測序鑒定

2.5 rSVA-GM-CSF的遺傳穩(wěn)定性分析為進一步分析rSVA-GM-CSF重組病毒遺傳穩(wěn)定性,將rSVA-GM-CSF重組病毒連續(xù)在BHK-21細胞傳代10次,分析其插入的外源基因GM-CSF遺傳穩(wěn)定性。對重組病毒rSVA-GM-CSF F5和F10代進行RT-PCR擴增,結果表明rSVA-GM-CSF重組病毒能夠擴增出1 476 bp目的條帶,而不含有GM-CSF基因的親本病毒rSVA只能擴增出990 bp的目的條帶(圖7A)。此外,對重組病毒rSVA-GM-CSF F5和F10代RT-PCR產(chǎn)物進行測序,發(fā)現(xiàn)GM-CSF-T2A基因序列沒有出現(xiàn)突變的現(xiàn)象(圖7B)。

3 討論

SVA自2015年傳入我國廣東,目前己蔓延至廣西、福建、湖北和黑龍江等多個省份,給我國養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展帶來很大的潛在威脅[15]。雖然近年來SVA得到了廣泛研究,但是目前國內外尚無防控該病的疫苗,部分實驗室研制了SVA常規(guī)滅活疫苗可有效防控該病。但是傳統(tǒng)滅活苗免疫時間短,細胞免疫效果比較差,因此,提高滅活疫苗的免疫效果對于該病的防控有重要意義。

隨著病毒反向遺傳操作技術的發(fā)展和應用,通過對病毒基因組的操控可以對毒株進行改造,以此來獲得理想的疫苗株。已有研究報道,利用反向遺傳操作技術,建立SVA感染性克隆并表達外源基因已開展了大量研究。例如,LIU等[16]構建的綠色熒光蛋白標記SVA重組病毒,并以此作為工具用于中和抗體的檢測及篩選抗病毒藥物;宋高媛等[17]構建了一種嵌合FMDV抗原表位的重組SVA毒株,該重組病毒具有與親本病毒相似的增殖特性,并且有較高的遺傳穩(wěn)定性。本實驗室前期利用反向遺傳操作技術構建了一種能夠穩(wěn)定表達NLuc熒光素酶的SVA-Nluc重組報告病毒,它能夠快速檢測SVA的中和抗體效價,高通量篩選SVA特異性抗病毒因子[13]。以上結果表明SVA作為載體具有容納一定外源基因的能力。

GM-CSF細胞因子是一種活躍的免疫效應因子,在體內有著廣泛的免疫活性,作為免疫佐劑,它不僅可以促進APC(antigen presenting cell)的成熟,提高其抗原提呈能力,而且在抗腫瘤免疫中扮演著關鍵性作用[18]。近年來,學者們嘗試將GM-CSF作為外源基因插入病毒疫苗載體序列中,以提高疫苗的免疫效果。ZHOU等[19]構建了表達犬GM-CSF的重組減毒狂犬病疫苗,結果表明,重組病毒可激活外周血中更多的DC和B細胞,并且能產(chǎn)生較高的中和抗體水平。虞凌雪[20]構建了表達豬GM-CSF重組PRRSV弱毒疫苗株,動物試驗表明重組病毒PRRSV抗體水平顯著高于親本疫苗病毒免疫組,且重組病毒免疫組誘導活化的CD8+T淋巴細胞和CD4+T淋巴細胞比例均顯著高于親本疫苗毒免疫組。GUO等[21]構建了表達雞粒細胞-巨噬細胞的重組新城疫(NDV)病毒,研究表明重組病毒可有效提高NDV特異性抗體滴度。以上研究結果表明,嵌合GM-CSF疫苗株可有效提高毒株的特異性和中和抗體水平,提高機體免疫應答能力。

為了更好地提高SVA滅活苗的免疫水平,本研究在SVA反向遺傳操作平臺的基礎上,構建能夠穩(wěn)定表達豬源GM-CSF的重組病毒rSVA-GM-CSF,該病毒具有與親本毒相似的增殖特性,且具有良好遺傳穩(wěn)定性,可作為提高機體免疫水平的新型疫苗備選株,為在機體內對重組病毒rSVA-GM-CSF進行免疫效力評價奠定了基礎。