何海強(qiáng),陶一墨,南福龍,解長(zhǎng)占,王 鵬,張 赫,金寧一,魯會(huì)軍*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,吉林 長(zhǎng)春130118;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 長(zhǎng)春獸醫(yī)研究所,吉林 長(zhǎng)春 130122;3.廣西大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,廣西 南寧 530004;4.青島大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 特種醫(yī)學(xué)系,山東 青島 266000)

高致病性豬繁殖與呼吸綜合征(highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome,HP-PRRS)是世界范圍內(nèi)養(yǎng)豬業(yè)重要的疾病之一,由高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒(highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)所引起。該病毒隸屬于動(dòng)脈炎病毒科(Arteriviridae),動(dòng)脈炎病毒屬(Arterivirus)。我國(guó)主要流行的是PRRSV-2型,主要分為L(zhǎng)ineage 1,3,5,8,從2006年HP-PRRS流行之后的HP-PRRSV代表毒株有JXA1、HuN4、TJ等。YN-LQ毒株為云南分離的Lineage 8 HP-PRRSV毒株,與JXA1同源性最近。國(guó)內(nèi)針對(duì)HP-PRRSV疫苗主要以減毒活疫苗(MLV)為主,1994年美國(guó)就開(kāi)始對(duì)PRRSV減毒活疫苗安全性和有效性的大量研究[1]。盡管中國(guó)引進(jìn)的MLV展現(xiàn)了良好的保護(hù)效果,但隨著MLV的使用導(dǎo)致中國(guó)2型PRRSV的流行[2],已有報(bào)道證明MLV有出現(xiàn)毒力返強(qiáng),另一方面MLV導(dǎo)致PRRSV與野毒株出現(xiàn)基因重組現(xiàn)象,導(dǎo)致出現(xiàn)新的亞型[3]。因此MLV逐漸減少投入使用。而在研究中發(fā)現(xiàn)HP-PRRSV主要結(jié)構(gòu)基因ORF5編碼的GP5結(jié)構(gòu)蛋白存在由aa37～45和aa27～30組成的線(xiàn)性中和表位,能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生大量中和抗體[4-5],因此GP5蛋白是主要的免疫蛋白之一。

A.PRRSV-GP5 PCR+Flag鑒定結(jié)果(M.DL2000 DNA Marker;1,2.LQ-GP5+Flag);B.Pme Ⅰ單酶切結(jié)果(M.DL19000 DNA Marker;1.陰性對(duì)照;2.RL-GP5);C.NDV檢測(cè)引物PCR(M.DL2000 DNA Marker;1,2.LQ-GP5+Flag)

新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)為不分節(jié)段單股負(fù)鏈RNA病毒,屬副黏病毒科(Paramyxoviridae),禽腮腺炎病毒屬(Avulavirus)。隨著反向遺傳技術(shù)的成熟,使得NDV載體能夠被定向改造,穩(wěn)定表達(dá)大量的外源蛋白,而且NDV僅對(duì)禽易感,作為哺乳動(dòng)物載體疫苗時(shí)安全性好[6]。與常見(jiàn)的滅活疫苗相比,NDV載體疫苗能夠有效誘導(dǎo)機(jī)體的多種免疫應(yīng)答,刺激機(jī)體產(chǎn)生大量干擾素[7]。NDV載體疫苗已應(yīng)用于狂犬病毒[8]和小反芻獸疫[9]的預(yù)防與保護(hù)。本研究將HP-PRRSV的GP5蛋白基因插入NDV載體內(nèi)獲得重組NDV載體疫苗,開(kāi)展相應(yīng)的小鼠免疫試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)0日齡雞胚和6周齡BALB/c雌鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司;自行孵育雞胚獲得1日齡SPF雛雞、6周齡SPF雞。

1.2 試劑、毒株和細(xì)胞大腸桿菌DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司;Q5高保真酶和PmeⅠ內(nèi)切酶購(gòu)自NEB公司One Step Cloning Kit購(gòu)自諾唯贊公司;大量質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司;磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Sigma公司;ECL Western blot substrate購(gòu)自Thermo fisher SCIENTIFIC公司;Flag抗體HRP標(biāo)記兔抗小鼠IgG購(gòu)自CST公司;FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG和IP裂解液購(gòu)自碧云天公司;NDV雞源多抗由南福龍博士制備;FITC兔抗雞IgG購(gòu)自索萊寶公司。HP-PRRSV YN-LQ株由本實(shí)驗(yàn)室分離并保存;BSR細(xì)胞、痘病毒、rLaSota全長(zhǎng)cDNA質(zhì)粒和P、NP、L 3個(gè)輔助質(zhì)粒來(lái)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所步志高團(tuán)隊(duì);Marc-145細(xì)胞由實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 質(zhì)粒構(gòu)建和鑒定通過(guò)提取YN-LQ病毒液RNA,反轉(zhuǎn)錄cDNA,PCR獲得HP-PRRSV-LQ的GP5基因片段,使用PmeⅠ內(nèi)切酶處理全長(zhǎng)質(zhì)粒,通過(guò)同源重組將帶有Flag標(biāo)簽的GP5片段重組插入酶切位點(diǎn),獲得表達(dá)HP-PRRSV的GP5全長(zhǎng)NDV質(zhì)粒RL-GP5,引物設(shè)計(jì)如表1所示。在37℃水浴中用PmeⅠ單酶切鑒定質(zhì)粒,對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定酶切位點(diǎn)內(nèi)是否插入正確序列長(zhǎng)度。

表1 引物設(shè)計(jì)

1.4 病毒拯救向BSR細(xì)胞內(nèi)加入具有T7聚合酶的痘病毒進(jìn)行感作,同時(shí)配置轉(zhuǎn)染液,按照說(shuō)明書(shū)所示配比,加入等體積的HBS液,混勻后加入到BSR細(xì)胞內(nèi),轉(zhuǎn)染3 d后將細(xì)胞液注射入9～11日齡雞胚內(nèi),5 d后收取雞胚上清尿囊液。

1.5 重組病毒鑒定和毒力評(píng)價(jià)用1%雞紅細(xì)胞進(jìn)行血凝試驗(yàn)鑒定。將尿囊液接種雞胚獲得病毒液至第3代,將F3病毒液接種至BSR細(xì)胞感染2 d,收取細(xì)胞制取蛋白樣品,進(jìn)行Western blot鑒定Flag標(biāo)簽是否成功表達(dá)。將F3代病毒液和rLaSota同劑量接種BSR細(xì)胞2 d,用4%多聚甲醛室溫固定后,1∶1 000配置Flag單抗,1∶100配置NDV雞多抗,1∶5 000配置FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG和FITC兔抗雞IgG,做Flag和NDV間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)。分別進(jìn)行平均致死時(shí)間(MDT)、腦內(nèi)接種致病指數(shù)(ICPI)、靜脈接種致病指數(shù)(IVPI)檢測(cè)重組病毒毒力。

1.6 疫苗小鼠免疫效果評(píng)價(jià)隨機(jī)將24只小鼠分為PBS、rLaSota、rL-GP5(LQ)3組,每組8只,后肢肌肉注射100 μL,第3周進(jìn)行加強(qiáng)免疫,共免疫5周,在7,14,21,28,35 d進(jìn)行眼眶采血,具體分組如表2所示。

表2 小鼠免疫分組

1.6.1小鼠血清特異性抗體水平檢測(cè) 將原核表達(dá)GP5蛋白包被到ELISA板內(nèi)過(guò)夜,用5%脫脂乳進(jìn)行封閉2 h,加入稀釋好的小鼠血清,37℃孵育1 h,加入稀釋好的HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG抗體,37℃孵育1 h,加入TMB顯色液,避光15 min后加入終止液,在酶標(biāo)儀上進(jìn)行讀數(shù),最后用GraphPad Prism 7.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.6.2小鼠血清中和抗體水平檢測(cè) 將待檢小鼠血清樣品于56℃水浴中滅活,滅活后的血清在96孔板內(nèi)進(jìn)行2倍倍比稀釋至1∶64,每孔接入HP-PRRSV(200 TCID50),混勻后在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)感作1 h再加入3 000個(gè)Marc-145細(xì)胞,觀察5～7 d后記錄細(xì)胞病變情況。

1.6.3小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖檢測(cè)分析 每組隨機(jī)選取3只小鼠進(jìn)行解剖,取脾臟分離淋巴細(xì)胞,于96孔板內(nèi)每孔加入1×105細(xì)胞,每個(gè)樣本設(shè)置空白對(duì)照組、Con-A刺激組(10 mg/L)、HP-PRRSV病毒液刺激組(MOI=1),在37℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)72 h后每孔內(nèi)加入15 μL cck-8,避光孵育4 h在酶標(biāo)儀內(nèi)記錄吸光度,最后用GraphPad Prism 7.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.6.4統(tǒng)計(jì)方法 通過(guò)GraphPad Prism軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理并利用t檢驗(yàn)或Two-way ANOVA進(jìn)行差異統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。組間比較:*表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001,****表示P<0.000 1。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒構(gòu)建和鑒定用GP5-F/R引物對(duì)PRRSV的cDNA進(jìn)行PCR,得到的條帶大小與預(yù)期704 bp一致,經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證為GP5片段。重組質(zhì)粒RL-GP5經(jīng)單酶切鑒定結(jié)果顯示,RL-GP5質(zhì)粒形成2條大小分別為20 000 bp左右和627 bp的條帶。NDV檢測(cè)引物PCR,結(jié)果顯示RL-GP5質(zhì)粒成功擴(kuò)增出1 404 bp,說(shuō)明質(zhì)粒構(gòu)建成功(圖1)。

2.2 重組病毒鑒定雞紅細(xì)胞血凝試驗(yàn)出現(xiàn)明顯血凝現(xiàn)象,rL-GP5(LQ)血凝效價(jià)為28。Flag標(biāo)簽的Western blot結(jié)果顯示,rL-GP5(LQ)對(duì)比原始毒株rLaSota出現(xiàn)條帶為30 kDa,與預(yù)期相符,說(shuō)明GP5成功表達(dá)。IFA顯示rL-GP5(LQ)和rLaSota與PBS相比出現(xiàn)明顯特異性熒光,說(shuō)明成功拯救NDV;Flag抗體結(jié)果說(shuō)明rL-GP5(LQ)對(duì)比rLaSota和PBS出現(xiàn)特異性熒光,說(shuō)明GP5成功表達(dá)(圖2)。

A．Flag標(biāo)簽Western blot結(jié)果(M.蛋白Marker;1.rL-GP5(LQ);2.rLaSota);B.間接免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果(×40)

2.3 重組病毒毒力檢測(cè)結(jié)果顯示,rL-GP5(LQ)與rLaSota MDT大于120 h,ICPI和IVPI的值均為0,按照OIE標(biāo)準(zhǔn)判定rL-GP5(LQ)與rLaSota均為弱毒株。

2.4 小鼠血清抗體水平GP5特異性抗體檢測(cè)結(jié)果顯示rL-GP5(LQ)組特異性抗體水平隨時(shí)間的增長(zhǎng)而升高,在首次免疫后35 d rL-GP5(LQ)組特異性抗體D值為0.67,是rLaSota組的1.13倍(P<0.01),為PBS組的2.06倍(P<0.01)。中和抗體檢測(cè)結(jié)果顯示rL-GP5(LQ)組中和抗體水平隨時(shí)間的增長(zhǎng)而升高,且遠(yuǎn)高于rLaSota和PBS組,在首次免疫后35 d rL-GP5(LQ)組中和抗體結(jié)果為1∶23,是rLaSota組的2.19倍(P<0.01),為PBS組的2.74倍(P<0.01),說(shuō)明疫苗組能有效刺激機(jī)體分泌特異性抗體和中和抗體(圖3)。

A．中和抗體檢測(cè)結(jié)果;B.特異性抗體檢測(cè)結(jié)果

2.5 小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖檢測(cè)通過(guò)HP-PRRSV的刺激淋巴細(xì)胞活化增殖,與Con-A對(duì)照組相比,所引起的淋巴細(xì)胞增殖更有效,且rL-GP5(LQ)組分別為PBS和rLaSota組的2.60倍和1.29倍,有顯著性差異(P<0.01)(圖4)。

注:與對(duì)照組相比,****.P<0.000 1

3 討論

此次研究選用為云南分離所得YN-LQ的毒株,與JXA1的同源性最高,其同源性為98.7%,通過(guò)序列對(duì)比證實(shí)為JXA1的變異株[10]。JXA1為PRRSV-2、美洲型毒株,并且JXA1為HP-PRRSV的代表毒株,在全國(guó)各地均有分布[11-12],近年來(lái)與野外毒株重組和自身氨基酸缺失產(chǎn)生新的變異株JXA1-like,給防治工作帶來(lái)巨大困難[13]。YN-LQ作為JXA1的變異株,對(duì)于JXA1的防控能提供幫助,YN-LQ毒株雖然國(guó)內(nèi)流行情況較少,但針對(duì)該毒株制備相應(yīng)疫苗能作為潛在病原的一種疫苗技術(shù)儲(chǔ)備。

在GP5序列后加入Flag標(biāo)簽,通過(guò)標(biāo)簽蛋白的鑒定情況來(lái)反應(yīng)GP5蛋白是否成功表達(dá),在計(jì)算后得出GP5蛋白大小應(yīng)為30 kDa左右,通過(guò)PCR、酶切反應(yīng)、Western blot和IFA試驗(yàn)鑒定結(jié)果說(shuō)明,重組病毒已成功拯救,并能有效表達(dá)GP5蛋白,通過(guò)毒力檢測(cè)顯示其毒力與原始毒株相比無(wú)變化,均屬弱毒株,且在小鼠免疫試驗(yàn)中疫苗注射后均未有不良反應(yīng)和體質(zhì)量減輕狀況,因此安全性良好。

在小鼠免疫試驗(yàn)中,特異性抗體檢測(cè)結(jié)果rL-GP5(LQ)組的抗體水平均有增長(zhǎng)且高于rLaSota和PBS組,但是對(duì)比rLaSota組的抗體水平增幅比較小,原因可能為小鼠并非是PRRSV的易感動(dòng)物,因此GP5抗原蛋白對(duì)于小鼠引發(fā)的特異性免疫應(yīng)答不強(qiáng)。在中和抗體試驗(yàn)中,rL-GP5(LQ)組顯示為持續(xù)不斷的呈上升趨勢(shì),rLaSota和PBS組的中和抗體結(jié)果符合預(yù)期結(jié)果,處于較低水平,rL-GP5(LQ)與rLaSota組和PBS組相比較抗體水平呈現(xiàn)顯著增長(zhǎng),進(jìn)而說(shuō)明rL-GP5(LQ)組不僅能成功誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性和中和抗體。在脾臟淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)中,rL-GP5(LQ)組對(duì)比PBS組有顯著增長(zhǎng),而rLaSota組在接種病毒后增殖情況也出現(xiàn)升高,該情況可能與rLaSota載體本身具有很強(qiáng)的免疫刺激功能,也能引起小鼠機(jī)體的免疫應(yīng)答有關(guān)。綜上所述rL-GP5(LQ)疫苗在小鼠體內(nèi)能夠有效產(chǎn)生免疫應(yīng)答,且能刺激產(chǎn)生較強(qiáng)的抗體水平。rL-GP5(LQ)重組NDV載體疫苗可作為疫苗候選,為國(guó)內(nèi)對(duì)防控PRRS提供新的思路。