馬 瑤,汪宏才,唐 晟,姚 倫,曾 哲,羅青平,5,曾 馳,商 雨*,溫國元,5*

(1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所,湖北 武漢 430064;2.武漢輕工業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,湖北 武漢 430023;3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜禽細(xì)菌病防治制劑創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北 武漢 430064;4.畜禽病原微生物學(xué)湖北重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北 武漢 430064;5.湖北洪山實(shí)驗(yàn)室,湖北 武漢 430070)

新型鵝細(xì)小病毒(novel goose parvovirus,NGPV)是鵝細(xì)小病毒(goose parvovirus,GPV)的變種,屬于細(xì)小病毒科(Parvoviridae)依賴病毒屬(Dependoparvovirus)的雁屬依賴細(xì)小病毒1群的成員[1]。NGPV主要感染30日齡以內(nèi)的雛鴨,感染鴨典型的臨床癥狀為生長緩慢、喙短舌頭突出、體質(zhì)量降低[2]。其發(fā)病具有明顯季節(jié)性,在每年10月至次年5月多發(fā),呈現(xiàn)地區(qū)散發(fā),并且養(yǎng)殖場發(fā)病后再次飼養(yǎng)時發(fā)病率會明顯增加[3]。NGPV既能水平傳播,也能垂直傳播[4-5],嚴(yán)重影響鴨出欄率,給養(yǎng)鴨行業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。1971年法國西南部的騾鴨中出現(xiàn)喙短、生長遲緩以及舌突出的癥狀,此后在波蘭和匈牙利均有報(bào)道[6],2008年我國首次報(bào)道了該病例。研究表明引起短喙侏儒綜合征(short beak dwarf syndrome,SBDS)的病原為GPV西歐株[7],是GPV的變種,因此被稱為NGPV。2015年后,NGPV在我國鴨群中大暴發(fā),致使大批鴨子出現(xiàn)SBDS癥狀,嚴(yán)重影響鴨的出欄率,其中影響最大的為櫻桃谷鴨群[8]。

NGPV無囊膜,由32個衣殼粒組裝而成的直徑為20～22 nm的二十面體結(jié)構(gòu);其基因組是一條單鏈線性DNA,長度約為5.1 kb,兩端具有U型發(fā)夾結(jié)構(gòu),可調(diào)控病毒的DNA復(fù)制。全基因組含有2個開放閱讀框(open reading frames,ORFs),分別編碼非結(jié)構(gòu)蛋白(non-structural protein,NS)和結(jié)構(gòu)蛋白(viral structural protein,VP)。非結(jié)構(gòu)蛋白(non-structural protein,NS)是一種多效性調(diào)節(jié)蛋白包括NS1、NS2,主要參與調(diào)節(jié)病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄,并對宿主細(xì)胞具有一定的毒性。結(jié)構(gòu)蛋白(viral structural protein,VP)主要有VP1、VP2、VP3共3種,是細(xì)小病毒組織嗜性、致病性和宿主范圍的重要決定因素。它們在3′端區(qū)具有相同的基因序列和相同的終止密碼子,但是它們的翻譯起始密碼子位于不同的位置。其中VP3占整個衣殼蛋白的80%,是主要的衣殼蛋白,包含了細(xì)小病毒主要的抗原決定簇,常以多肽的形式暴露在病毒表面,能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體,是主要的免疫保護(hù)性抗原[9]。

目前,針對NGPV診斷常用的方法包括分子生物學(xué)檢測和血清學(xué)診斷。分子生物學(xué)檢測方法有熒光探針法[10]、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法[11]、雙重半巢式PCR檢測法[12]、核酸探針法[13]等。血清學(xué)診斷方法有病毒中和試驗(yàn)、瓊脂擴(kuò)散抑制試驗(yàn)、間接免疫熒光試驗(yàn)、免疫印跡試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等。其中病毒中和試驗(yàn)重復(fù)性好、靈敏度高,還可以定性定量,但是試驗(yàn)周期較長不利于用于基層大批量樣品的檢測[14]。瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)不需要昂貴的儀器,試驗(yàn)結(jié)果肉眼可以觀察到,并且操作簡單便于在基層推廣使用,但是靈敏度不高,需要消耗高效價(jià)抗血清和濃縮的病毒液[15]。免疫熒光技術(shù)[16]、免疫印跡試驗(yàn)[17]具有重復(fù)性好、靈敏度高的特點(diǎn),但是成本較高,操作繁瑣而且需要昂貴的儀器設(shè)備,不利于基層推廣以及現(xiàn)場的檢測,并且還會出現(xiàn)非特異性反應(yīng)不利于結(jié)果的判斷。相比這幾種血清學(xué)檢測方法,酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)具有較高的靈敏度、特異性,并且可以排除交叉感染的干擾,且成本不高可用于大批量樣品檢測,還可用于檢測區(qū)分病毒感染還是疫苗免疫抗體[18-19]。本研究利用原核表達(dá)純化的NGPV VP3截短蛋白作為包被抗原建立間接ELISA抗體檢測方法,對該方法進(jìn)行一系列的優(yōu)化后,評估該方法的特異性、敏感性、重復(fù)性以及在臨床樣品檢測中的應(yīng)用效果,旨在為NGPV的感染情況監(jiān)測以及疫苗免疫評估提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 菌毒種及血清感受態(tài)細(xì)胞E.coilDH5α和原核表達(dá)宿主菌E.coilBL21-Codon-Plus(DE3)購于TaKaRa公司;NGPV YICH株由本實(shí)驗(yàn)室分離并保存;NGPV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清由實(shí)驗(yàn)室利用保存的毒株免疫GPV感染陰性鴨制備獲得;鴨坦布蘇病毒、新城疫病毒、禽流感病毒、鴨疫里默桿菌、E.coil陽性血清均由本實(shí)驗(yàn)室保存;臨床血清來自哈爾濱、青島和湖北等地。

1.2 工具酶及試劑表達(dá)質(zhì)粒pET-28a為實(shí)驗(yàn)室保存;2×Phanta Max Master Mix購于南京諾維贊生物科技公司;DL2000 DNA Marker、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ、T4DNA連接酶購于TaKaRa公司;病毒RNA提取試劑盒購于美國Axygen公司;膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購于美國Omega公司;IPTG購于索萊寶公司;NTA His Bind樹脂購于Millipore公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒、HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG多克隆抗體購于上海碧云天生物科技有限公司;鼠抗His tag 單克隆抗體購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司;HRP標(biāo)記的羊抗鴨IgG(H+L)多克隆抗體購于美國SeraCare(KPL)公司;TMB顯色液、HRP穩(wěn)定劑均購于科前生物公司。

1.3 VP3基因分析及截短片段克隆利用DNAStar軟件對NGPV VP3蛋白二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,選擇VP3蛋白抗原表位富集區(qū)(aa250～525),且該區(qū)域可塑性較高,形成表位的可能性較大,容易與抗體結(jié)合(圖1),將該區(qū)段命名為VP3-tr。通過SnapGene5.3軟件設(shè)計(jì)1對特異性擴(kuò)增引物,VP3-tr-F:5′-TTGGATCCAATGAGGTAGACAGCA-ACAGAAATGCTC-3′(下劃線處為BamHⅠ酶切位點(diǎn)),VP3-tr-R:5′-TTCTCGAGCAGATTTTGA-GTTAGATATCTGGTTCCAATC-3′ (下劃線處為Xho Ⅰ酶切位點(diǎn)),引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

圖1 蛋白親水性、可塑性以及抗原表位分析

A.VP3截短基因PCR擴(kuò)增(M1.DL2000 DNA Marker;1.VP3截短基因);B.重組質(zhì)粒pET-VP3-tr的酶切鑒定(M2.DL5000 DNA Marker;2.重組質(zhì)粒pET-VP3-tr)

1.4 重組質(zhì)粒pET-VP3-tr的構(gòu)建及鑒定提取NGPV YICH株的DNA,并以其作為模板,用引物VP3-tr-F和VP3-tr-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增VP3-tr片段。將純化的VP3-tr片段和原核表達(dá)載體pET-28a用Xho Ⅰ和BamHⅠ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切,純化酶切后的pET-28a和VP3-tr片段,利用T4DNA連接酶將2個片段連接成質(zhì)粒。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coilDH5a感受態(tài)細(xì)胞后涂布Luria-Bertani(LB)平板并于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。通過PCR、雙酶切以及測序鑒定篩選出構(gòu)建正確質(zhì)粒,并命名為pET-VP3-tr。

1.5 重組蛋白的表達(dá)與鑒定將重組質(zhì)粒pET-VP3-tr轉(zhuǎn)化至E.coilBL21(DE3),挑取單菌落至LB液體培養(yǎng)基中,37℃搖床培養(yǎng)至對數(shù)期,再加入1 mmol/L IPTG,16℃低溫誘導(dǎo)表達(dá)12 h。誘導(dǎo)表達(dá)后,離心收集菌體,并用平衡緩沖溶液(PBS,pH=7.5)重懸,進(jìn)行低溫高壓破碎。離心取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE和Western blot檢測分析。一抗為1∶2 000稀釋的鼠抗His-tag單克隆抗體,二抗為HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG多克隆抗體。

1.6 重組蛋白的純化及鑒定收集破碎后的沉淀并置于8 mol/L尿素中進(jìn)行變性,再用His-鎳親和層析柱對變性的蛋白進(jìn)行純化,純化后的蛋白通過透析進(jìn)行復(fù)性。將純化的蛋白經(jīng)SDS-PAGE后,電轉(zhuǎn)至NC膜上,用5%脫脂乳室溫封閉3 h,TBST洗滌3次,加入鴨源GPV陽性血清(稀釋比例為1∶500)4℃過夜孵育;TBST洗滌3次,加入HRP標(biāo)記的羊抗鴨IgG多克隆抗體(稀釋比例為1∶2 000),室溫孵育1 h;TBST洗滌3次,ECL化學(xué)發(fā)光顯色。對鑒定正確的蛋白采用BCA法測定對其進(jìn)行定量,并置于-80℃冰箱中保存。

1.7 間接ELISA方法反應(yīng)條件的優(yōu)化

1.7.1最佳抗原包被濃度和血清稀釋度的確定 用方陣滴定法進(jìn)行最佳抗原包被濃度和血清稀釋度的確定。用包被液將純化的VP3-tr蛋白按1∶100,1∶200,1∶400,1∶800,1∶1 600,1∶3 200,1∶6 400的比例稀釋后,以100 μL/孔包被于酶標(biāo)板中,4℃孵育過夜。用稀釋液將陽性血清和陰性血清分別按1∶100,1∶200,1∶400,1∶800,1∶1 600,1∶3 200稀釋,然后按100 μL/孔加入到酶標(biāo)板中,進(jìn)行間接ELISA檢測,測定每孔的D630 nm值。計(jì)算相同稀釋度的陰、陽血清的D630 nm的比值(P/N值),選擇P/N值最大對應(yīng)的稀釋倍數(shù)作為抗原最佳包被濃度和血清最佳稀釋度。

1.7.2最佳包被條件的確定 將加入包被蛋白的酶標(biāo)板置于4種不同的條件中進(jìn)行包被:① 37℃孵育2 h;② 4℃孵育過夜;③ 37℃孵育2 h,再于4℃孵育過夜;④ 4℃孵育過夜,再于37℃孵育2 h。孵育結(jié)束后加入最佳稀釋度的陰、陽性血清進(jìn)行ELISA檢測,測定每孔的D630 nm值,計(jì)算P/N值,選擇P/N值最大對應(yīng)的包被條件作為最佳包被條件。

1.7.3封閉液的確定 根據(jù)前面確定的最佳抗原包被濃度、血清稀釋度和最佳包被條件包被酶標(biāo)板,分別用含有2% BSA、2%明膠、5%脫脂乳的磷酸鹽緩沖液封閉包被的酶標(biāo)板,加入最佳稀釋度的陰、陽性血清進(jìn)行間接ELISA檢測,測定每孔的D630 nm值。計(jì)算相同稀釋度的陰、陽血清的D630 nm的比值(P/N值),選擇P/N值最大對應(yīng)的封閉液作為最佳的封閉液。

1.7.4樣品稀釋液的確定 用最佳抗原包被濃度、最佳包被條件和最佳封閉液包被和封閉酶標(biāo)板。然后分別以1×PBST、1%脫脂乳、1% BSA、2%脫脂乳、2%BSA、5%脫脂乳、5%BSA的磷酸鹽緩沖溶液作為血清樣品稀釋液,將陰、陽性血清稀釋至最佳濃度,進(jìn)行間接ELISA檢測,比較P/N值,確定最佳樣品稀釋液。

1.7.5血清最佳結(jié)合時間的確定 將稀釋后的陰、陽性血清加入到包被并封閉好的酶標(biāo)板中,置于37℃分別作用30,45,60,90 min,繼續(xù)進(jìn)行間接ELISA檢測,測定D630 nm值,選擇P/N值最大對應(yīng)的作用時間作為血清最佳結(jié)合時間。

1.7.6二抗最佳稀釋度及孵育時間的確定 根據(jù)已經(jīng)優(yōu)化好的條件,利用方陣滴定法對陰、陽性血清進(jìn)行ELISA檢測,并將HRP標(biāo)記的羊抗鴨IgG多克隆抗體用HRP穩(wěn)定劑分別按1∶2 500,1∶5 000,1∶7 500,1∶10 000的比例進(jìn)行稀釋,分別置于37℃孵育30,45,60 min,測定D630 nm值,選擇P/N值最大對應(yīng)的條件作為二抗最佳稀釋度及孵育時間。

1.7.7底物最佳顯色時間的確定 按照上面確定的條件對陰、陽性血清進(jìn)行ELISA檢測,加入TMB顯色液后,分別置于37℃避光孵育5,10,15,20 min,測定D630 nm值,選擇P/N值最大對應(yīng)的時間作為底物最佳顯色時間。

1.9 特異性試驗(yàn)用建立的ELISA抗體檢測方法分別對鴨坦布蘇病毒、新城疫病毒、禽流感病毒、鴨疫里默桿菌、E.coil陽性血清進(jìn)行檢測,來檢驗(yàn)建立的方法是否與其他陽性血清存在交叉反應(yīng)。

1.10 敏感性試驗(yàn)將實(shí)驗(yàn)室制備的標(biāo)準(zhǔn)陽性血清以2倍梯度稀釋(按1∶200稀釋至1∶102 400)后進(jìn)行ELISA檢測,根據(jù)確定的陰、陽臨界值對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行判定,確定其敏感性。

1.11 重復(fù)性試驗(yàn)同一批制備的抗原包被的酶標(biāo)板隨機(jī)檢測6份NGPV陽性血清,重復(fù)4次,進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn),計(jì)算變異系數(shù)(CV)。再用3個不同時間包被的酶標(biāo)板檢測6份NGPV陽性血清進(jìn)行批間重復(fù)性試驗(yàn)。

1.12 間接ELISA方法的臨床應(yīng)用使用建立的ELISA抗體檢測方法對147份來自哈爾濱、青島和湖北等地區(qū)臨床血清樣品進(jìn)行抗體檢測,同時用Western blot方法對這些樣品進(jìn)行平行檢測,計(jì)算符合率并計(jì)算Kappa系數(shù)分析這2種方法檢測結(jié)果的一致性。

2 結(jié)果

2.1 目的片段擴(kuò)增以及重組質(zhì)粒pET-VP3-tr的鑒定以實(shí)驗(yàn)室保存的毒株提取DNA為模板,擴(kuò)增VP3截短基因,擴(kuò)增的條帶在750～1 000 bp之間,與預(yù)期大小(876 bp)相符(圖2A)。利用BamHⅠ和XhoⅠ這2個限制性內(nèi)切酶對擴(kuò)增的片段以及載體pET-28a分別進(jìn)行酶切,然后連接轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5α中,篩選出陽性質(zhì)粒后,再通過酶切鑒定,結(jié)果與預(yù)期相符(圖2B)。將酶切結(jié)果正確的質(zhì)粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序,測序結(jié)果完全正確表明重組質(zhì)粒pET-VP3-tr構(gòu)建成功。

2.2 重組蛋白的表達(dá)鑒定將鑒定正確的重組質(zhì)粒pET-VP3-tr轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)中,培養(yǎng)至對數(shù)期加入IPTG,16℃誘導(dǎo)表達(dá)。用SDS-PAGE和Western blot檢測蛋白表達(dá)情況,結(jié)果表明在35 kDa附近有明顯條帶,大小與重組蛋白VP3-tr預(yù)期(36 kDa)相符,在破碎上清和沉淀均有表達(dá),但是沉淀中表達(dá)量較高(圖3)。

M.蛋白Marker;1.誘導(dǎo)后空載pET-28a全菌;2.誘導(dǎo)前pET-VP3-tr全菌;3.誘導(dǎo)后pET-VP3-tr全菌;4.誘導(dǎo)后空載pET-28a破碎上清;5.誘導(dǎo)前pET-VP3-tr破碎上清;6.誘導(dǎo)后pET-VP3-tr破碎上清;7.誘導(dǎo)后空載pET-28a破碎沉淀;8.誘導(dǎo)前pET-VP3-tr破碎沉淀;9.誘導(dǎo)后pET-VP3-tr破碎沉淀

2.3 重組蛋白的純化及鑒定將鑒定正確的重組質(zhì)粒pET-VP3-tr轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)中,擴(kuò)大培養(yǎng)并加入IPTG進(jìn)行低溫誘導(dǎo)表達(dá),12 h后收集菌體破碎沉淀。將包涵體進(jìn)行變性、親和層析純化、復(fù)性后,進(jìn)行SDS-PAGE檢測,結(jié)果顯示在35 kDa附近出現(xiàn)1條單一的蛋白條帶與預(yù)期VP3-tr蛋白大小相符(圖4A)。進(jìn)一步進(jìn)行Western blot檢測,以實(shí)驗(yàn)室制備的GPV陽性血清作為一抗,結(jié)果顯示在36 kDa處出現(xiàn)單一的反應(yīng)條帶,表明成功獲得了純度較高的VP3-tr蛋白(圖4B),并用BCA法測得VP3-tr蛋白的質(zhì)量濃度為0.8 g/L。

M.蛋白Marker;1.純化的VP3-tr蛋白

2.4 間接ELISA方法最佳反應(yīng)條件的確定經(jīng)過系列條件優(yōu)化,建立了鴨源GPV抗體間接ELISA方法,各步驟最佳條件: 重組VP3-tr蛋白包被質(zhì)量濃度為0.5 mg/L,包被條件為37℃孵育2 h,封閉液為含5%脫脂乳的磷酸鹽緩沖液,樣品稀釋液為1×PBST,檢測血清的稀釋度為1∶200,血清最佳的結(jié)合條件為37℃孵育30 min,二抗稀釋度為1∶12 500,二抗孵育條件為37℃孵育30 min,顯色條件為37℃孵育5 min。

圖5 NGPV抗體陰性的鴨血清的間接ELISA檢測

2.6 間接ELISA方法的特異性試驗(yàn)用建立的ELISA抗體檢測方法分別對鴨坦布蘇病毒、新城疫病毒、禽流感病毒、鴨疫里默桿菌、E.coil陽性血清進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示建立的ELISA方法與5種病原陽性血清不發(fā)生交叉反應(yīng),表明建立的方法具有良好的特異性(表1)。

表1 間接ELISA方法的特異性試驗(yàn)

2.7 間接ELISA方法的敏感性試驗(yàn)用建立的間接ELISA抗體檢測方法對2倍梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)陽性血清進(jìn)行抗體檢測,檢測結(jié)果表明為當(dāng)血清稀釋到1∶25 600時,檢測結(jié)果仍為陽性(圖6),表明該方法具有較好的靈敏度。

圖6 間接ELISA方法的靈敏度檢測結(jié)果

2.8 間接ELISA方法的重復(fù)性試驗(yàn)批內(nèi)重復(fù)檢測結(jié)果的批內(nèi)CV為4.07%～5.67%,批間重復(fù)檢測結(jié)果的批間CV為4.32%～5.28%(表2),結(jié)果表明該檢測方法具有良好的重復(fù)性。

表2 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.9 間接ELISA方法的臨床樣品檢測對147份來自哈爾濱、青島和湖北等地臨床鴨血清樣品分別進(jìn)行間接ELISA抗體檢測和Western blot檢測。結(jié)果顯示,間接ELISA方法檢測出陽性125份,陰性22份;Western blot檢測出陽性102份,陰性45份;其中有102和22份樣品分別被這2種方法檢測后確定為陽性和陰性(表3)。這2種方法的符合率為84.4%,Kappa統(tǒng)計(jì)分析表明這2種方法的顯著性一致性為0.57,表明這2種方法之間具有中等的一致性。ELISA和Western blot方法檢測的陽性率分別為85%和69%,表明間接ELISA方法的靈敏度要高于Western blot檢測方法。

表3 間接ELISA方法和Western blot檢測方法的比較 份

3 討論

水禽是一種重要的經(jīng)濟(jì)動物,在中國有著悠久的商業(yè)歷史。我國是水禽養(yǎng)殖大國,然而傳染病一直威脅著水禽養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。近些年,由NGPV感染引起的SBDS在江蘇、安徽、山東等省的鴨群中流行,產(chǎn)生大批量的殘次鴨,給鴨養(yǎng)殖行業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前對這一疾病的主要防控手段就是疫苗免疫種鴨、雛鴨,但是可能由于免疫覆蓋率不足以及母源抗體產(chǎn)生的水平不一致等原因?qū)е翹GPV時常在一定范圍內(nèi)流行。因此,開發(fā)快速可靠的檢測方法在臨床上對免疫效果以及雛鴨母源抗體水平的檢測顯得尤為重要[17]。有研究報(bào)道,大多數(shù)細(xì)小病毒屬成員對哺乳動物的紅細(xì)胞具有凝集作用,可以用血凝試驗(yàn)(hemagglutination assay,HA)作為病毒鑒定或血凝抑制試驗(yàn)(hemagglutination Inhibition assay,HI)作為血清抗體測定的常用手段。而GPV不具有使哺乳動物紅細(xì)胞凝集作用,根據(jù)這一特征可以用于區(qū)分GPV與其他細(xì)小病毒屬成員[20]。GPV只有一種血清型,有學(xué)者表明,GPV能使黃牛的精子凝集,為GPV的鑒定提供檢測方法,但是該方法不易操作以及黃牛精子不易獲得[21]。NGPV血清學(xué)檢測方法主要有病毒中和試驗(yàn),瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、間接免疫熒光試驗(yàn)、免疫印跡試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等。而酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)相比其他的幾種方法操作簡單、快速、靈敏度高、特異性強(qiáng),適合用于基層大批量樣品的檢測、成本低廉,因此在臨床上被廣泛的應(yīng)用。目前臨床上暫時還沒有關(guān)于檢測鴨血清中NGPV抗體的試劑盒出售,因此本研究擬建立鴨源NGPV抗體間接ELISA檢測方法。

利用方陣滴定法優(yōu)化ELISA方法的反應(yīng)條件,確立了最佳的檢測條件。用確定的最佳反應(yīng)條件對30份陰性血清檢測,計(jì)算得到陰、陽性臨界值為0.219。對此方法的靈敏性、特異性、重復(fù)性進(jìn)行分析,該方法表現(xiàn)出較高的靈敏性、特異性和重復(fù)性。用該方法與Western blot檢測方法進(jìn)行符合,符合率為84.4%,且陽性率比Western blot方法要高,表明該方法靈敏度更高。將本試驗(yàn)建立的間接ELISA方法與已有的以VP3全長作為包被抗原建立的間接ELISA方法相比,已建立的方法當(dāng)陽性血清稀釋至1∶10 240時,仍檢測為陽性,而本試驗(yàn)建立的方法當(dāng)陽性血清稀釋至1∶25 600時,仍檢測為陽性,表明我們建立的方法靈敏度更高[20]。與以往建立的NGPV間接ELISA方法相比,本試驗(yàn)建立的方法陽性檢出率更高[20,22]。且本試驗(yàn)建立的間接ELISA方法與傳統(tǒng)的血清學(xué)檢測方法瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)以及病毒中和試驗(yàn)相比,更容易方便操作,并且耗時短,便于大批量樣品的檢測。

綜上所述本研究成功建立了鴨源NGPV抗體的間接ELISA檢測方法,可用于鴨感染NGPV后的感染情況監(jiān)測以及免疫后的抗體水平監(jiān)測,為鴨感染新型鵝細(xì)小病毒的監(jiān)測預(yù)防提供了一種檢測手段,具有廣泛的應(yīng)用前景。