李 想,崔煥忠*,李乾學(xué)

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,吉林 長春 130118;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 長春獸醫(yī)研究所,吉林 長春 130112)

自H5N1亞型禽流感病毒暴發(fā)以來,全國乃至全球養(yǎng)殖業(yè)深受影響,尤其我國作為禽類養(yǎng)殖大國,H5N1亞型禽流感病毒不僅給禽類養(yǎng)殖造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失,更嚴(yán)重的是同樣對人類存在高致病性,它能使禽類的病死率高達(dá)100%,人類則達(dá)到60%以上。隨著候鳥的遷徙和人類的大規(guī)?；顒覽1],全球已有60多個國家發(fā)現(xiàn)H5N1亞型禽流感病毒,但現(xiàn)存的對于H5N1亞型禽流感病毒檢測的方法大部分都耗時過長,操作復(fù)雜,不能達(dá)到現(xiàn)場快速診斷的目的[2],所以建立一種能夠在現(xiàn)場快速檢測的方法至關(guān)重要。

近些年來,拉曼光譜逐漸被認(rèn)知,作為新型病原檢測的一種方式,它具有快速、無需培養(yǎng)、自動化、高靈敏度的優(yōu)勢。拉曼光譜檢測儀會對與入射光頻率不同的散射光譜進(jìn)行分析,得到分子振動、轉(zhuǎn)動方面的信息,并應(yīng)用于分子結(jié)構(gòu)研究的一種分析方法。其不但可以處理各種性狀的樣品,包括液體和固體,還可以滿足實時、活體、微量與宏觀的檢測[3]。

表面增強(qiáng)拉曼散射(surface enhanced Raman scattering,SERS)是一種特殊表面吸附分子將拉曼散射信號增強(qiáng)的現(xiàn)象,SERS是在拉曼光譜檢測的基礎(chǔ)上增強(qiáng)待檢物的拉曼信號的方法,作為一種新興的分子光譜檢測技術(shù),通過金屬納米結(jié)構(gòu)的局域表面等離激元共振(localized surface plasmon resonance,LSPR)所造成的局部電磁場來增強(qiáng)目標(biāo)信號,能夠?qū)⒛繕?biāo)信號放大百萬甚至千萬倍,并且可以無視水的影響,檢測水樣樣本[4]。因其能實現(xiàn)對分析物分子的極低濃度檢測,被廣泛應(yīng)用于痕量分析領(lǐng)域[5]和病毒檢測[6]。SERS光譜具有高敏、高分辨率、增強(qiáng)信號、譜帶窄的優(yōu)勢,并且還可以提供分子結(jié)構(gòu)振動的指紋圖譜信息,在亞微米尺度上獲得細(xì)胞成像等眾多特點,能夠快速準(zhǔn)確的鑒別待檢物。在樣品處理好的情況下最快可30 s檢測出結(jié)果。

核酸適配體是指通過指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)體外篩選的能與靶標(biāo)高親和性和高特異性結(jié)合的核糖核酸(RNA)和單鏈脫氧核糖核酸(ssDNA)。適配體對目標(biāo)物有良好的特異性和靈敏性。篩選快、成本低、有良好的穩(wěn)定性使其超過抗體成為更多人的選擇[7]。適配體可應(yīng)用于臨床診斷、傳染病監(jiān)測與抑制、癌癥治療、新藥研發(fā)、微生物檢測、腫瘤影像學(xué)等諸多領(lǐng)域[8]。

因H5N1亞型禽流感病毒生物病原體本身拉曼信號較弱,故應(yīng)用免疫磁球偶聯(lián)特異性適配體捕獲H5N1亞型禽流感病毒,在空間位置效應(yīng)的作用下,適當(dāng)?shù)目臻g距離適合納米銀的增強(qiáng),但是經(jīng)拉曼檢測后發(fā)現(xiàn)該方法在被納米銀還原后的拉曼信號還是較弱,于是在前序試驗不變的基礎(chǔ)上引入第2個特異性適配體,通過比較被納米銀還原后的拉曼信號發(fā)現(xiàn)在引入第2個特異性適配體后拉曼信號顯著增強(qiáng),因此通過比較建立雙適配體夾心技術(shù)檢測H5N1亞型禽流感病毒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1毒株及雞胚 毒株H5N1亞型禽流感病毒,由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院長春獸醫(yī)研究所實驗室提供;9日齡雞胚,購自長春市嘉禧牧業(yè)有限公司。

1.1.2主要試劑及儀器 鏈霉親和素磁珠(直徑1 μm)(海貍生物);PBS緩沖液(北京索萊寶);去離子水(北京索萊寶);AgNO3(Sigma);NaBH4(上海宏瑞化工);磁力架(賽默飛);高溫金屬浴(南京舜瑪);低溫離心機(jī)(賽默飛);LabRAM HR Evolution顯微拉曼儀(HORIBA Scientific);石英載玻片(沭陽晶通石英);生化培養(yǎng)箱(上海一恒);-80℃超低溫冰箱(青島海爾);超凈臺(蘇州凈化);智能壓力蒸汽滅菌鍋(上海嘉措);電子分析天平(梅特勒)。

1.1.3適配體序列 H5N1適配體序列2198(GCAGAGGTCCGCTGACGGATGGATGGAAC-AGGGGTTTAGCAGCAGGACCACTCTTGAGC-G),H5N1適配體序列3498(ACCTGGTTACTGGGTGGCTACAGGGGACACCACTCCGCTTC-CTCCGGCCCGGGGAGTGGC)由自上海生工合成。

1.2 方法

1.2.1病毒培養(yǎng) 取保存于-80℃冰箱內(nèi)的H5N1流感病毒接種至9日齡的雞胚中,每個雞胚接種100 μL,接種后對雞胚進(jìn)行封蠟處理,將雞胚放置于37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h,將24 h內(nèi)死亡的雞胚舍棄。培養(yǎng)72 h后將雞胚放入4℃處理,冷胚12 h,在超凈臺內(nèi)收集雞胚尿囊液,收毒后用2%雞紅細(xì)胞懸液測定其血凝效價,病毒分裝好置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2H5N1亞型禽流感病毒捕獲體系的建立 將存于-20℃的適配體3498和2198取出,8 000 r/min離心2 min,加適當(dāng)?shù)娜ルx子水稀釋至100 mmol/L,混勻后放95℃金屬浴15 min,然后迅速冰浴15 min,冰浴過后室溫放置15 min,此時2個適配體已被折疊好。取0.2 mg鏈霉親和素磁珠于內(nèi)壁光滑的離心管中,用500 μL PBS溶液洗滌,離心管置于磁力架上1 min,重復(fù)洗滌3次,加入20 μL折疊好的適配體3498室溫孵育30 min。經(jīng)磁性分離后用500 μL PBS溶液洗滌3次,洗去未結(jié)合的游離的適配體3498,制備成捕獲磁珠IMBs。

1.2.3IMBs-H5N1@AgNPs的制備 在IMBs中加入200 μL H5N1禽流感病毒,充分混勻后4℃孵育1 h,每間隔20 min重懸1次保證磁珠處于懸浮狀態(tài),孵育結(jié)束后用PBS溶液洗滌3次,洗去未結(jié)合的H5N1禽流感病毒,制備成IMBs-H5N1保存于4℃冰箱備用。

M.Marker 1.H5N1病毒培養(yǎng)原液中提取的RNA反轉(zhuǎn)錄所得的cDNA;2～4.3管培養(yǎng)的流感病毒待驗證尿囊液RNA

采用Shameli K 方法通過NaBH4做還原劑對AgNO3還原合成AgNPs,通過在室溫條件下調(diào)節(jié)兩者的濃度比例與孵育時間合成最佳的AgNPs[9]。據(jù)試驗數(shù)據(jù)顯示,AgNO3最佳孵育時間為10 min,最佳濃度為10 mmol/L;NaBH4最佳孵育時間為1 min,最佳濃度為10 mmol/L。2種溶液均為現(xiàn)用現(xiàn)配。向制備好的IMBs-H5N1中加入現(xiàn)配制的10 mmol/L 50 μL AgNO3溶液,充分混勻,避光4℃孵育10 min,孵育期間令溶液始終處于懸浮狀態(tài),之后勻速加入50 μL現(xiàn)配制的10 mmol/L NaBH4溶液,混勻反應(yīng)1 min,立即于1 000 r/min離心1 min,棄掉上清,用50 μL無菌去離子水重懸,命名為IMBs-H5N1@AgNPs。取10 μL樣品滴至清洗干凈的石英載玻片表面上,待樣品干燥,進(jìn)行SERS檢測。

1.2.4建立雙適配體夾心 在IMBs-H5N1的基礎(chǔ)上,加入20 μL特異性適配體2198,充分混勻后4℃孵育,期間保證磁珠處于懸浮狀態(tài)。經(jīng)磁性分離將未偶聯(lián)的適配體洗脫。命名為IMBs-H5N1-Apt。

為了確定適配體2198和IMBs-H5N1的最適孵育時間,在加入20 μL適配體2198后,4℃孵育0.25,0.50,0.75,1.00,1.25,1.50,1.75,2.00 h,期間輕搖離心管保持溶液內(nèi)混合物懸浮。磁性分離吸棄上清,還原后每個樣品重復(fù)SERS檢測3次。

1.2.5SERS檢測方法的建立 檢測前使用硅片進(jìn)行儀器校正,以 520.7 cm-1處的拉曼峰作為基準(zhǔn)峰[10]。取 10 μL 待測樣品滴至酸液浸泡洗滌并沖洗干凈的石英載玻片中央,使用 532 nm的He-Ne激光進(jìn)行激發(fā),激光功率為 13.5 mW,激光功率密度為 0.214 mW·μm-2,物鏡選擇50倍,激光衰減參數(shù)選擇1%,分辨率設(shè)置為1 cm-1,曝光時間為30 s,積分次數(shù)為2次,進(jìn)行拉曼信號采集。數(shù)據(jù)分析采用 Origin software 8.5 軟件。

2 結(jié)果

2.1 血凝效價血凝效價結(jié)果如表1所示,取效價為27以上的病毒液混勻后分裝,-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 H5N1禽流感病毒血凝效價結(jié)果

2.2 培養(yǎng)病毒中存在H5N1的驗證為了驗證培養(yǎng)的病毒尿囊液中存在H5N1流感病毒,提取培養(yǎng)原液中H5N1流感病毒和3管培養(yǎng)的流感病毒待驗證尿囊液的RNA,以病毒原液中提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄所得的cDNA為模板,用引物Forward-H5N1/Reverse-H5N1在退火溫度65℃進(jìn)行擴(kuò)增,經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,可以看到4個泳道在421 bp都有明亮條帶(圖1)。

2.3 H5N1流感病毒的SERS檢測選用10 μL適配體3498偶聯(lián)磁球捕獲流感病毒進(jìn)行試驗,IMBs-H5N1@AgNPs的檢測結(jié)果如圖2黑線所示,信號較弱,所以在前序試驗操作不變的基礎(chǔ)上,在溶液里加入適配體2198,還原后檢測如圖2紅線所示,可以看出后者拉曼信號強(qiáng)于前者,峰更高更容易檢測。原因可能為后者結(jié)構(gòu)更適合產(chǎn)生LSPR,從而增強(qiáng)H5N1流感病毒的拉曼信號。所以我們選擇對后者做進(jìn)一步優(yōu)化,通過對比建立雙適配體夾心檢測H5N1流感病毒[11]。

圖2 IMBs-H5N1@AgNPs和IMBs-H5N1-Apt@AgNPs SERS圖

2.4 適配體2198和IMBs-H5N1最適孵育時間在 IMBs-H5N1的基礎(chǔ)上加入20 μL適配體2198后,4℃孵育0.25,0.50,0.75,1.00,1.25,1.50,1.75,2.00 h,SERS檢測結(jié)果如圖3所示。

圖3 適配體2198與IMBs-H5N1孵育時間的優(yōu)化

2.5 特異性評價為了考察該方法的特異性,采用尿囊液、H9N2、H1N1和H3N2亞型禽流感病毒作為對照樣品進(jìn)行了拉曼光譜檢測,通過對5種樣品的光譜圖經(jīng)過基線校正、歸一化和平滑處理得到的譜圖結(jié)果如圖4所示[12]。僅H5N1亞型禽流感病毒有明顯的拉曼信號,而其他禽流感病毒和尿囊液均無明顯的拉曼信號強(qiáng)度,結(jié)果表明該方法能直接檢測H5N1流感病毒,具有較好的特異性。

圖4 H5N1亞型禽流感病毒SERS檢測方法特異性評價

2.6 靈敏性評價為了評價該方法檢測H5N1亞型禽流感病毒的檢測限,在優(yōu)化條件下,分析了基于免疫磁球捕獲不同濃度H5N1亞型禽流感病毒的拉曼光譜。將病毒按1∶10,1∶100,1∶1 000……稀釋成10個梯度體系為200 μL病毒液,分別與0.2 mg免疫磁珠孵育,制備待檢樣品,對其進(jìn)行拉曼光譜掃描,結(jié)果如圖5所示。從圖中可以看出,1 058 cm-1處 SERS 峰在10-1～10-10病毒濃度范圍內(nèi)呈線性相關(guān),相關(guān)性R2= 0.994 9。 病毒的檢測限達(dá)到了稀釋尿囊液的1010倍。

A.H5N1亞型禽流感病毒SERS檢測方法靈敏度評價;B.1 058 cm-1譜帶強(qiáng)度與H5N1亞型禽流感病毒濃度線性關(guān)系

2.7 不同批次樣品重復(fù)性檢測選擇共制備3個批次待檢樣品,試驗參數(shù)設(shè)置一致,每個樣品重復(fù)掃描3次,結(jié)果見圖6,顯示峰位一致,強(qiáng)度穩(wěn)定,顯示該方法重復(fù)性良好。

圖6 不同批次IMBs-H5N1-Apt@AgNPs

2.8 實樣分析為了研究該方法在真實樣本中的應(yīng)用潛力,通過對已感染/未感染H5N1病毒的雞胚尿囊液進(jìn)行檢測,應(yīng)用該方法和HA方法評價兩者的檢測結(jié)果是否一致。從50個感染和50個未感染的雞胚中隨機(jī)選擇14個樣本,如表2所示,通過HA試驗發(fā)現(xiàn)其中10個為陽性,4個為陰性,如圖7所示,拉曼光譜顯示隨機(jī)樣本中10個有峰4個沒有峰,SERS檢測結(jié)果與HA檢測結(jié)果一致,我們所提出的方法在H5N1實樣分析中顯示出良好的應(yīng)用前景。

圖7 實際樣本中H5N1的SERS檢測

表2 H5N1禽流感病毒樣本分析HA結(jié)果

3 討論

拉曼光譜檢測因其具有快速、無損、原位、指紋特征被廣泛應(yīng)用于生物檢測,通過研究表明SERS光譜可以直接檢測細(xì)菌[13],但是病毒與細(xì)菌的不同之處在于病毒依賴宿主細(xì)胞生存、復(fù)制和繁殖,并且很難獲得沒有雜質(zhì)的純病毒,因此幾乎不可能利用SERS指紋來區(qū)分不同的病毒。

在SERS的基礎(chǔ)上,本研究開發(fā)了1種針對H5N1流感病毒來說直觀的、無標(biāo)簽的拉曼光譜檢測方法,根據(jù)適配體-病毒-適配體相互作用的特點,用適配體3498偶聯(lián)免疫磁珠形成捕獲體系,用該體系去捕獲H5N1流感病毒,并且發(fā)現(xiàn)在加入適配體2198后,信號大大增加。根據(jù)LSPR理論,信號大幅增強(qiáng)是由于在待測物與Ag納米鏈的強(qiáng)耦合等離子體納米結(jié)構(gòu)之間產(chǎn)生了高強(qiáng)度的電磁場,兩者表面等離激元(SP)可以在金屬-電介質(zhì)界面處激發(fā)并傳播增強(qiáng)其拉曼信號[14],故推測可能是Ag納米鏈到IMBs-H5N1-Apt復(fù)合物結(jié)構(gòu)的距離比到IMBs-H5N1復(fù)合物結(jié)構(gòu)的距離更近,導(dǎo)致IMBs-H5N1-Apt@AgNPs信號遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于IMBs-H5N1@AgNPs。

H5N1流感病毒的SERS結(jié)果在1 058 cm-1處顯示出狹窄的、對稱性良好的峰形,重復(fù)性較好,同時用H1N1、H3N2或H9N2替代H5N1后,在1 058 cm-1處未見特征峰,并且原病毒液稀釋到1010倍時仍能檢測到拉曼信號,此方法也在真實臨床樣本中驗證了SERS檢測H5N1流感病毒的實際適用性。該方法具有特異性、高增強(qiáng)能力、穩(wěn)定性和靈敏性,可用于H5N1亞型禽流感病毒的檢測。