郭子儀,孫亞威,許夕雅,丁晨夢(mèng),鄧夢(mèng)夢(mèng),韓紫薇,呂晨哲,齊江坤,于林洋,王新衛(wèi),陳 陸

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,河南 鄭州 450046)

豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea,PED)是由豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的一種高傳染性豬腸道疾病,感染仔豬以發(fā)生嘔吐、急性水樣腹瀉和嚴(yán)重脫水為特征[1],7日齡以下仔豬病死率可達(dá)100%[2]。PEDV于1971年首次出現(xiàn)在英國(guó)[3],隨后在歐洲和亞洲的許多生豬養(yǎng)殖國(guó)家也報(bào)道了該疾病[4]。1973年,中國(guó)首次出現(xiàn)豬傳染性胃腸炎(transmissible gastroenteritis,TGE)樣急性腹瀉暴發(fā),但直到1984年才通過(guò)熒光抗體試驗(yàn)和血清中和試驗(yàn)確認(rèn)該病的病原體為PEDV[5]。2010年底,由變異毒株引起的PED在我國(guó)南方再次暴發(fā)流行,給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。2013年4月美國(guó)首次出現(xiàn)由PEDV變異毒株引起的PED病例,1年之內(nèi)造成數(shù)百萬(wàn)仔豬死亡[6]。目前,PED依然是對(duì)世界養(yǎng)豬業(yè)影響最大的豬病之一。因此,分離當(dāng)前PEDV流行變異株以及掌握其進(jìn)化趨勢(shì),對(duì)于后續(xù)的新型疫苗研發(fā)意義重大。

PEDV是α-冠狀病毒屬(α-CoV)的成員,基因組全長(zhǎng)約28 kb,由7個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF)組成。從5′→3′端依次編碼復(fù)制酶多聚蛋白1ab(pplab)、纖突蛋白(S)、ORF3蛋白、小膜蛋白(E)、膜糖蛋白(M)和核衣殼蛋白(N)[7]。S蛋白是一種糖基化蛋白,含有能夠誘導(dǎo)中和抗體的表位,具有高度的遺傳多樣性[8]?；赟基因的遺傳多樣性,PEDV分為GⅠ和GⅡ 2大基因型,每個(gè)基因群可進(jìn)一步分為2個(gè)亞型,分別為GⅠa/b和GⅡa/b[9]。GⅠa/b亞型主要包括早期流行的CV777、DR13等低致病力毒株,GⅡa和GⅡb均屬于高致病力變異毒株,而GⅡb亞型流行更廣泛[10]。最近流調(diào)結(jié)果顯示[11],我國(guó)PEDV流行毒株大多是GⅡ基因型,其中GⅡb亞群占比90%以上。目前我國(guó)流行的GⅡa和GⅡb亞型毒株對(duì)哺乳仔豬具有高致病性,并具有血清的交叉中和活性或交叉免疫保護(hù)[12-14]。經(jīng)典PEDV毒株CV777的PEDV疫苗在我國(guó)被廣泛使用,但免疫失敗現(xiàn)象常見(jiàn)[15]。

因此,基于目前流行的PEDV變異毒株開(kāi)發(fā)新疫苗迫在眉睫,為實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo),本研究在先前分子流調(diào)基礎(chǔ)上[16],成功分離出2株當(dāng)前流行且高毒力的GⅡb變異毒株CH-HNKF-03和CH-HNPDS-01,并對(duì)其進(jìn)行全基因組測(cè)序分析及致病性試驗(yàn),以期為PEDV新型高效疫苗的研發(fā)提供候選毒株。

1 材料與方法

1.1 PEDV陽(yáng)性樣品與細(xì)胞株2020和2021年采集的經(jīng)RT-PCR及測(cè)序鑒定為PEDV GⅡb陽(yáng)性的腹瀉仔豬腸道組織,用含有青霉素(100 mg/L)、鏈霉素(100 IU/mL)和磷酸胰蛋白酶(7.5 mg/L) 的改良DMEM培養(yǎng)基勻漿后,反復(fù)凍融3次,4℃離心取上清液,用0.22 μm濾器除菌,-80℃?zhèn)溆谩７侵蘧G猴腎細(xì)胞系(Vero CCL-81)購(gòu)自ATCC。

1.2 主要試劑M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、Recombinant RNase Inhibitor、2×Taq PCR Mix均購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司(TaKaRa中國(guó));病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司;Oligo dT(18)、Random primer購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司;胰酶購(gòu)自Sigma(美國(guó))公司;兔抗PEDV S蛋白血清由本實(shí)驗(yàn)室制備;Alexa Fluor?488-conjugated goat anti-rabbit IgG購(gòu)自Abcam(英國(guó))公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物9頭1日齡未吃母乳健康仔豬,購(gòu)自河南省某豬場(chǎng),采集直腸拭子,通過(guò)RT-PCR確認(rèn)PEDV、TGEV、豬急性腹瀉綜合征病毒、豬δ冠狀病毒和豬輪狀病毒呈陰性。在適應(yīng)期間,所有仔豬均活躍,糞便稠度正常,無(wú)臨床癥狀。

1.4 引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GenBank公布的PEDV變異株KR809885(CH/HNAY/2015),設(shè)計(jì)18對(duì)全基因組測(cè)序引物。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,引物詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

表1 PEDV全基因組測(cè)序引物信息

1.5 病毒分離處理的組織上清液接種生長(zhǎng)良好的單層Vero細(xì)胞,吸附1 h,PBS(0.01 mol/L,pH=7.2)清洗3次,加入含胰酶(1 mg/L)的維持液,置37℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),48 h后收取培養(yǎng)液盲傳至出現(xiàn)細(xì)胞病變,收獲病毒液并命名,置-80℃保存。

1.6 間接免疫熒光分析(IFA)PEDV感染Vero細(xì)胞(MOI=0.1)18 h后,4%多聚甲醛4℃固定30 min,0.25% Triton X-100室溫下通透10 min,3% BSA洗滌3次后,用3% BSA封閉1 h,分別用兔抗S蛋白抗血清和Alexa Fluor?488-conjugated goat anti-rabbit IgG作為第一抗體和第二抗體,用DAPI對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色5 min,PBS洗滌細(xì)胞后,用熒光顯微鏡觀(guān)察。

1.7 PEDV全基因組克隆和測(cè)序取病毒液用病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒提取樣品RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,反轉(zhuǎn)錄體系:5×M-MLV Buffer 4 μL、dNTP(2.5 mmol/L)4 μL、Oligo dT(18)(20 μmol/L)0.5 μL、Random primer(20 μmol/L)0.5 μL、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(200 U/μL)0.5 μL、Recombinant RNase Inhibitor(40 U/μL)0.5 μL、RNA 200 ng,DEPC(焦碳酸二乙酯)水補(bǔ)足20 μL。反轉(zhuǎn)錄程序:42℃處理1 h,70℃處理15 min。反轉(zhuǎn)錄后獲得的cDNA進(jìn)行PCR檢測(cè),采用50 μL反應(yīng)體系:25 μL 2×Phanta Max Buffer、dNTP Mix 0.5 μL、上、下游引物(25 μmol/L)各1 μL、Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerasec 1 μL,cDNA 4 μL,ddH2O補(bǔ)足。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min;95℃變性30 s,58℃退火30 s,72℃延伸1 min,30個(gè)循環(huán);最后72℃延伸5 min,4℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后,取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。陽(yáng)性產(chǎn)物進(jìn)行膠回收并克隆于pMD18-T載體,挑取陽(yáng)性質(zhì)粒送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

1.8 全基因組同源性比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育分析運(yùn)用DNAStar和MEGA-X軟件對(duì)本研究毒株全基因組及S、ORF3、E、M、N基因與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)已公布的國(guó)內(nèi)外44個(gè)代表性參考毒株進(jìn)行同源性比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育分析,采用鄰接法(neighbor-joining method)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),通過(guò)1 000次重復(fù)計(jì)算引導(dǎo)值。

A.CH-HNKF-03感染Vero細(xì)胞后CPE結(jié)果;B.CH-HNPDS-01感染Vero細(xì)胞后CPE結(jié)果;C.陰性細(xì)胞對(duì)照;D.CH-HNKF-03感染Vero細(xì)胞后IFA結(jié)果;E.CH-HNPDS-01感染Vero細(xì)胞后IFA結(jié)果;F.IFA陰性對(duì)照

A.全基因組系統(tǒng)發(fā)育樹(shù);b～f.S、ORF3、E、M、N基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù);●.本試驗(yàn)分離毒株

A.CH-HNKF-03攻毒組;B.CH-HNPDS-01攻毒組;C.陰性對(duì)照組;D.CH-HNKF-03攻毒組腸道剖檢;E.CH-HNPDS-01攻毒組腸道剖檢;F.陰性對(duì)照組腸道剖檢

A.各組仔豬糞便評(píng)分曲線(xiàn);B.各組仔豬存活率

1.9 致病性試驗(yàn)9頭1日齡未吃初乳健康仔豬,隨機(jī)均分為3組:CH-HNKF-03攻毒組、CH-HNPDS-01攻毒組和陰性對(duì)照組。CH-HNK-F-03攻毒組和CH-HNPDS-01攻毒組仔豬每頭分別灌服PEDV CH-HNKF-03、CH-HNPDS-01株病毒液100 TCID50,陰性對(duì)照組灌服同體積DMEM。攻毒后4 d內(nèi),每天目測(cè)仔豬腹瀉情況,按照以下評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行打分:0分,正常;1分,膏狀大便;2分,半液體腹瀉;3分,液體腹瀉。記錄每組仔豬平均得分,評(píng)估腹瀉嚴(yán)重程度。

1.10 結(jié)果分析將各基因片段重疊部分利用CExpress軟件拼接,得到用CH-HNKF-03、CH-HNPDS-01的全基因組序列,利用DNAStar軟件包中的MegAlign進(jìn)行同源性比較,用MEGA-X進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

2 結(jié)果

2.1 病毒分離及IFA鑒定CH-HNKF-03和CH-HNPDS-01毒株分別在第3和5代出現(xiàn)典型細(xì)胞病變(CPE)。用PEDV S蛋白多克隆抗體進(jìn)行IFA檢測(cè),結(jié)果顯示,在感染的Vero細(xì)胞中有綠色熒光信號(hào),空白細(xì)胞對(duì)照中沒(méi)有(圖1)。

2.2 PEDV全基因組擴(kuò)增、測(cè)序及拼接對(duì)CH-HNKF-03和CH-HNPDS-01基因片段進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序,通過(guò)CExpress軟件拼接,得到2條完整PEDV序列,長(zhǎng)度分別為27 970,28 032 bp(表2)。其序列已上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù),登錄號(hào)為分別為OL446966、OL446967。

表2 PEDV CH-HNKF-03、CH-HNPDS-01株基因組結(jié)構(gòu)

2.3 全基因組同源性比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育分析全基因組同源性比對(duì)顯示CH-HNKF-03和CH-HNPDS-01株與國(guó)內(nèi)流行株CH/HNAY/2015同源性最高,分別為98.3%和98.7%,系統(tǒng)發(fā)育分析顯示這2個(gè)毒株均屬于國(guó)內(nèi)流行的GⅡb群(圖2a);S基因核苷酸序列分析顯示CH-HNKF-03分離毒株S基因全長(zhǎng)與中國(guó)近年流行毒株CH/HNAY/2015、PEDV-WS等一致,大小均為4 161 bp,CH-HNPDS-01分離株S基因全長(zhǎng)4 158 bp,與AJ1102、GD-A等一致。CH-HNKF-03和CH-HNPDS-01株與PEDV-WS株同源性最高分別為98.6%和98.4%,系統(tǒng)發(fā)育分析顯示這2個(gè)毒株均屬于國(guó)內(nèi)流行的GⅡb群,與全基因組系統(tǒng)發(fā)育分析一致(圖2b);2株分離株ORF3基因全長(zhǎng)均為675 bp,其中CH-HNKF-03株與SD2014株同源性最高為95.6%,CH-HNPDS-01株與CHGD-01株同源性最高為98.7%,系統(tǒng)發(fā)育分析顯示CH-HNKF-03毒株形成單獨(dú)分支(圖2c);CH-HNPDS-01和CH-HNKF-03株E基因與參考毒株核苷酸同源性分別為93.9%～99.0%和94.2%～95.1%,系統(tǒng)發(fā)育分析顯示CH-HNPDS-01與早期經(jīng)典毒株CV777、DR13等處于同一個(gè)分支,CH-HNKF-03與SD2014處于同一個(gè)分支(圖2d);M基因同源性比對(duì)顯示CH-HNPDS-01和CH-HNKF-03毒株與參考毒株核苷酸同源性分別為95.5%～98.8%和96.4%～99.4%,系統(tǒng)發(fā)育分析顯示,CH-HNPDS-01與GD-A、AJ1102等毒株處于同一分支,CH-HNKF-03與CH/BJ9/2015處于同一分支(圖2e);N基因同源性比對(duì)顯示,CH-HNPDS-01和CH-HNKF-03毒株與參考毒株核苷酸同源性分別為95.6%～97.7%和94.9%～99%,系統(tǒng)發(fā)育分析顯示CH-HNPDS-01形成一個(gè)單獨(dú)分支,CH-HNKF-03與CH/HNAY/2015、PE-DV-WS等處于同一分支(圖2f)。

2.4 致病性試驗(yàn)試驗(yàn)組仔豬攻毒后出現(xiàn)嘔吐、糞便呈液體伴腥臭味、采食量銳減、精神萎靡、站立不穩(wěn)、被毛粗亂、消瘦等癥狀。2組試驗(yàn)組仔豬在攻毒4 d后均全部死亡,陰性對(duì)照組仔豬正常。對(duì)仔豬進(jìn)行剖檢,發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組仔豬小腸腸壁變薄充血、脹氣,內(nèi)有黃色水樣糞便和未消化凝乳塊。致病性試驗(yàn)表明CH-HNKF-03 和 CH-HNPDS-01 毒株均具有高致病性。

3 討論

由于PEDV基因組的點(diǎn)突變、插入突變和缺失突變頻繁發(fā)生,這導(dǎo)致了我國(guó)PEDV流行株的遺傳具有多樣性[17-18]。同時(shí)PEDV不同流行株之間的毒力及免疫力也有所不同,使得目前使用的商業(yè)化PEDV疫苗無(wú)法對(duì)各種流行變異株提供完全保護(hù)[8,19]。自2010年我國(guó)首次報(bào)道GⅡb亞型毒株引起的PED暴發(fā)以來(lái),該亞型在所有PEDV分離株占比逐年增加,近幾年達(dá)到了90%以上[10-11,20]。同時(shí),PEDV GⅡb毒株研發(fā)的疫苗相比傳統(tǒng)市售疫苗能夠提供更好的同源保護(hù)[21-22]。因此,目前PEDV GⅡb亞型流行毒株研發(fā)新型疫苗對(duì)防控豬流行性腹瀉意義重大。毒株分離是疫苗研發(fā)的重要環(huán)節(jié),但是PEDV體外分離培養(yǎng)非常困難,這一定程度上掣肘了新型疫苗的研發(fā)速度。PEDV體外分離培養(yǎng)困難的原因主要有2點(diǎn):(1) 實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的細(xì)胞環(huán)境無(wú)法完全模擬豬腸道環(huán)境。(2)豬腸道組織內(nèi)含毒素及毒株培養(yǎng)需要一定的胰酶作用,這都會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞狀態(tài)很差甚至死亡,從而影響PEDV的分離培養(yǎng)。本研究從疑似暴發(fā)PED的河南規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)收集病料,將鑒定PEDV為唯一病原體的病料進(jìn)行PEDV分離,根據(jù)HOFMANN等[23]以及KUSANAGI等[24]的方法,應(yīng)用Vero細(xì)胞上成功地分離到PEDV CH-HNKF-03和CH-HNPDS-01毒株,其分別在第3代和第5代出現(xiàn)典型細(xì)胞病變,這與PAN等[25]在同一細(xì)胞中第7代觀(guān)察到CPE,和HOFMANN等[23]第1代就觀(guān)察到了CPE有一定差異,可能是因?yàn)閂ero細(xì)胞對(duì)不同PEDV分離株的敏感性不同。

為了解分離株的基因特征,對(duì)CH-HNKF-03和CH-HNPDS-01株進(jìn)行全基因組測(cè)序,并從全基因組水平和部分基因水平分析PEDV毒株之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。結(jié)果顯示,本研究中分離株全基因組及S基因系統(tǒng)發(fā)育分析顯示均屬于GⅡb亞型,差異最大的基因是S和ORF3基因,E、M、N基因同源性較高,相對(duì)比較保守,與LIU等[26]、DIEP等[27]研究結(jié)果一致。PEDV N基因高度保守,可在感染細(xì)胞中大量表達(dá)N蛋白,并且在感染初期即可產(chǎn)生高水平抗N蛋白抗體,N蛋白的這種特性使其成為診斷PEDV的理想靶抗原[28]。本研究CH-HNPDS-01毒株N基因形成一個(gè)單獨(dú)分支,其影響還有待進(jìn)一步研究。致病性試驗(yàn)結(jié)果顯示1日齡仔豬感染CH-HNKF-03和CH-HNPDS-01毒株后,18 h即可發(fā)病,在24～56 h仔豬均出現(xiàn)典型的液體腹瀉、嘔吐、消瘦、脫水等癥狀,并在96 h內(nèi)全部死亡,說(shuō)明CH-HNKF-03和CH-HNPDS-01株對(duì)仔豬具有高致病性。

綜上,本研究分離出2株可在Vero細(xì)胞上有效增殖并能穩(wěn)定傳代的PEDV GⅡb亞群變異毒株(CH-HNKF-03和CH-HNPDS-01),其與我國(guó)近年流行毒株遺傳關(guān)系最近,同時(shí)對(duì)哺乳仔豬具有高致病性,這為PEDV的遺傳演化提供了參考以及后續(xù)PEDV新型高效疫苗的研發(fā)提供了候選毒株。