吳玉臣,朱先鵬,李有志,侯云峰,聶 婧,尚小雷,鄧旭明,高 豐,呂強華,6*

(1.吉林大學 動物醫(yī)學學院,吉林 長春 130062;2.河南牧業(yè)經(jīng)濟學院,河南 鄭州 450000;3.吉林省柳河縣農(nóng)業(yè)綜合行政執(zhí)法大隊,吉林 柳河135300;4.山東省飼料獸藥質(zhì)量檢驗中心,山東 濟南 250022;5.山東金鑄基藥業(yè)有限公司,山東 濟南 271100;6.山東省農(nóng)業(yè)科學院 畜牧獸醫(yī)研究所,山東 濟南 250100)

產(chǎn)氣莢膜梭菌(C.perfringens)是1892年由WELCH等[1]在約翰霍普金斯醫(yī)院的一起致命性主動脈瘤病例中首次分離得到的,也被稱為魏氏梭菌。它是一種厭氧革蘭陽性、產(chǎn)芽孢、大型桿狀菌,廣泛分布于人類和動物的胃腸道、食品和自然環(huán)境中[2]。目前,已知該菌產(chǎn)生的外毒素有12種(α、β、ε、ι、γ、δ、η、θ、κ、λ、μ和ν),根據(jù)外毒素不同可將其分為A～E 5種血清型[3]。產(chǎn)氣莢膜梭菌屬于典型的條件致病菌,既可導致地區(qū)性流行,又可引起散發(fā)性病例,每年都會造成大量人或動物感染和死亡。產(chǎn)氣莢膜梭菌感染可引起人類和動物的多種疾病,如氣性壞疽(人和動物)、壞死性腸炎(人和動物)、腸毒素血癥(動物)、人類食物中毒、抗生素相關(guān)性腹瀉和散發(fā)性非食源性疾病等[4]。在世界范圍內(nèi),產(chǎn)氣莢膜梭菌是引起食源性疾病暴發(fā)的重要病原之一,食源性傳播是產(chǎn)氣莢膜梭菌的主要傳播途徑,在英國和法國食源性疾病常見病因中位列第三,是美國食源性疾病的第二大常見致病菌[5]。

產(chǎn)氣莢膜梭菌可引起雞的壞死性腸炎,多見于2～6周齡的肉雞,發(fā)病率和病死率都很高,病死率甚至可達50%,嚴重危害全球養(yǎng)雞業(yè)的發(fā)展[6-7]。抗菌藥的不合理使用和濫用,引發(fā)致病菌對多種抗菌藥耐藥[8-9],導致臨床療效下降甚至治療失敗。我國農(nóng)業(yè)部于2017和2018年分別制定了《全國遏制動物源細菌耐藥行動計劃(2017—2020年)》[10]和《獸用抗菌藥使用減量化行動試點工作方案(2018—2021年)》[11],禁止在飼料端使用抗菌促生長劑,雞壞死性腸炎的發(fā)病率呈明顯上升趨勢[12]。隨著“減抗和限抗”政策的實施必然對臨床雞壞死性腸炎為代表的產(chǎn)氣莢膜梭菌感染造成巨大困擾,尋求新型抗菌藥物或抗菌策略對抗耐藥菌的感染迫在眉睫。研究表明,產(chǎn)氣莢膜梭菌在宿主腸道黏附過程主要依賴于菌體表面的Ⅳ型菌毛系統(tǒng)(type Ⅳ pili,TFP)[13],通過依賴于TFP促進細菌在宿主腸道內(nèi)的定植、存活和復制增殖[14]。TFP在多種血清型產(chǎn)氣莢膜梭菌中保守存在,相比常規(guī)抗生素直接殺菌或抑菌的作用機制,以此為靶標的藥物研發(fā)成為一種理想策略。

在前期研究中,通過以TFP作為藥物篩選靶標,建立了產(chǎn)氣莢膜梭菌TFP抑制劑的篩選平臺,在中藥來源的天然化合物中進行大量篩選,最終獲得了活性良好的穗花衫雙黃酮。結(jié)合危害養(yǎng)雞業(yè)的產(chǎn)氣莢膜梭菌現(xiàn)狀,開發(fā)一種安全有效、療效確切、機制明確和無藥殘的新型中獸藥制劑。查閱大量文獻可知,側(cè)柏葉中穗花衫雙黃酮含量較高,可作為中藥制劑的候選中藥材。側(cè)柏葉,為柏科植物側(cè)柏Platycladusorientalis(L.)Franco的干燥枝梢和葉,一般采收于夏、秋兩季。側(cè)柏葉顆粒劑作為一種新型中獸藥制劑,目前未見抗產(chǎn)氣莢膜梭菌感染的報道。接下來,擬在前期基礎(chǔ)之上研究側(cè)柏葉顆粒劑對產(chǎn)氣莢膜梭菌TFP功能的抑制作用及機制,為臨床產(chǎn)氣莢膜梭菌感染的防控提供候選“減抗”中獸藥制劑和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株、細胞及主要試劑側(cè)柏葉顆粒劑(批號:202012001),由保定冀中生物科技有限公司中試生產(chǎn);產(chǎn)氣莢膜梭菌ATCC13124菌株,購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(ATCC);BHI培養(yǎng)基、TSB培養(yǎng)基、厭氧產(chǎn)氣包、血紅素、維生素K1,購自青島海博生物技術(shù)有限公司;結(jié)晶紫試劑,購自Sigma;結(jié)腸癌細胞系Caco-2細胞,購自中國科學院上海生命科學院細胞資源中心;RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶,購自Gibco;Triton X-100,購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司。

A.側(cè)柏葉顆粒對產(chǎn)氣莢膜梭菌在半固體培養(yǎng)基上滑動運動的影響;B.滑動運動率統(tǒng)計。NS.P>0.05;*.P<0.05;**.P<0.01。下同

1.2 主要儀器超凈工作臺(SW-CJ-IF)、恒溫培養(yǎng)箱(HPS250)和生物安全柜(HDL2600),購自哈爾濱東聯(lián)有限公司;恒溫振蕩器(THZ-82),購自上海躍進醫(yī)療器械廠;電子天平(BSA124S/224S-CW),購自德國賽多利斯;全自動樣品快速研磨儀(JXFSTPRP-24),購自上海凈信生物科技有限公司;免疫熒光顯微鏡(IX-83),購自日本奧林巴斯;電泳儀(PowerPacBasic)、小型垂直電泳槽(Mini Gel Tank)、半干轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜儀(170-3940)和熒光定量PCR儀(CFX96),購自美國Bio-Rad;化學發(fā)光成像系統(tǒng)(Tanon 4200),購自上海天能科技有限公司;透射電鏡(HT8700),購自日本日立。

1.3 側(cè)柏葉顆粒對產(chǎn)氣莢膜梭菌TFP表型功能的影響

1.3.1滑動運動試驗 產(chǎn)氣莢膜梭菌ATCC13124接種至BHI液體培養(yǎng)基,置于2.5 L厭氧培養(yǎng)箱中37℃過夜培養(yǎng)。取1 mL過夜培養(yǎng)菌液,10 000 r/min離心5 min,重懸于100 μL BHI培養(yǎng)基中,將10 μL菌懸液滴至0.7% BHI瓊脂平板中央,分別設(shè)置為陽性對照組(不含側(cè)柏葉顆粒劑)、側(cè)柏葉顆粒劑組(0.7% BHI瓊脂平板中含側(cè)柏葉顆粒,質(zhì)量濃度為1.3 g/L)和DMSO對照組(0.7% BHI瓊脂平板中含等體積的DMSO溶劑),置于2.5 L厭氧培養(yǎng)箱中37℃靜置培養(yǎng)72 h后,測定滑動運動數(shù)據(jù),并采集圖像。

1.3.2生物被膜試驗 取1 mL過夜培養(yǎng)菌液6 000 r/min離心10 min,PBS洗滌3次,重懸于TSB培養(yǎng)基中,調(diào)至D600 nm=0.1,加入24孔板內(nèi),每孔400 μL。分別加入不同體積的側(cè)柏葉顆粒貯存液,使其終質(zhì)量濃度分別為0,0.65和1.30 g/L,設(shè)陽性對照組(不含側(cè)柏葉顆粒)和陰性對照組(不含菌液和側(cè)柏葉顆粒),置于2.5 L厭氧培養(yǎng)箱中30℃靜置培養(yǎng)120 h。棄掉培養(yǎng)過后24孔板內(nèi)上清,PBS洗滌3次,置于37℃電熱恒溫干燥箱烘干1 h,加入400 μL 結(jié)晶紫(0.1%),室溫染色1 h,PBS洗滌3次,加入33%乙酸400 μL溶解混勻后取100 μL 置于新96孔板中,測定D570 nm值,根據(jù)下列公式計算生物被膜形成率。生物被膜形成率=(D570 nm 樣品組-D570 nm 陰性組)/(D570 nm 陽性組-D570 nm 陰性組)×100%,以陽性對照組為100%計算。

1.4 側(cè)柏葉顆粒對產(chǎn)氣莢膜梭菌黏附至Caco-2細胞的影響

1.4.1細胞培養(yǎng) 將Caco-2細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清及100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的1640培養(yǎng)基中,于37℃和5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)16 h。

1.4.2菌懸液的制備 產(chǎn)氣莢膜梭菌ATCC13124接種至BHI液體培養(yǎng)基中,置于2.5 L厭氧培養(yǎng)箱中37℃過夜培養(yǎng)。次日,用BHI調(diào)至D600 nm=0.4備用。

1.4.3LDH法檢測側(cè)柏葉顆粒對Caco-2細胞的毒性 將Caco-2細胞接種于96孔培養(yǎng)板中,密度為2×104cells /孔,置于37℃和 5% CO2培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。棄掉培養(yǎng)基,加入1640培養(yǎng)基,加藥,設(shè)陽性對照組(0.2% TritonX-100)、陰性對照組(僅含1640培養(yǎng)基)、藥物組(側(cè)柏葉顆粒終質(zhì)量濃度分別為0,0.65,1.30,2.60和5.20 g/L),每組3個重復,置于37℃和5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h。1 000 r/min離心10 min,取100 μL上清液至新96孔板,向各孔內(nèi)加入LDH工作液100 μL,避光孵育30 min。用酶標儀測定各孔D492 nm值,計算樣品的LDH釋放率。LDH釋放率=(D492 nm 處理組-D492 nm 陰性組)/(D492 nm 陽性組-D492 nm 陰性組)×100%,以陽性對照組LDH釋放率為100%計算。

1.4.4側(cè)柏葉顆粒對產(chǎn)氣莢膜梭菌黏附至Caco-2細胞的影響 Caco-2細胞接種于24孔培養(yǎng)板中,密度為3×105cells/mL,置于37℃和 5% CO2培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng);每孔加入10 μL菌懸液,分為陽性對照組、陰性對照組和藥物組。1 000 r/min離心10 min后37℃靜置培養(yǎng)2 h;用滅菌PBS洗去未黏附細菌,每孔洗3次,加入1 mL高壓滅菌的蒸餾水,震蕩5 min充分釋放和裂解細胞,倍比稀釋涂布于BHI平板,37℃厭氧過夜培養(yǎng),計數(shù)菌落形成單位(CFU)。黏附率=處理組CFU/陽性對照組CFU×100%。

1.5 側(cè)柏葉顆粒對產(chǎn)氣莢膜梭菌TFP基因轉(zhuǎn)錄和菌毛形態(tài)的影響

1.5.1qRT-PCR檢測產(chǎn)氣莢膜梭菌TFP基因轉(zhuǎn)錄 產(chǎn)氣莢膜梭菌ATCC13124置于BHI培養(yǎng)基過夜培養(yǎng),第2天20倍稀釋擴培,加入終質(zhì)量濃度為0和1.30 g/L的側(cè)柏葉顆粒,37℃厭氧培養(yǎng)4 h。使用TRIzol法提取細菌總RNA,使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA,配制RT-PCR反應體系見表1,使用Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀進行檢測,qRT-PCR反應條件見表2。引物由上海生工生物科技有限公司合成,序列信息見表3。試驗完畢,按照2-△△Ct法對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

表1 qRT-PCR反應體系

表2 qRT-PCR反應條件

表3 引物序列信息

1.5.2側(cè)柏葉顆粒對產(chǎn)氣莢膜梭菌TFP形態(tài)的影響 使用BHI培養(yǎng)基將產(chǎn)氣莢膜梭菌過夜培養(yǎng)物的D600 nm調(diào)整至0.1,取6 mL調(diào)后的菌液,分裝至2個試管,每管2 mL,向其中分別加入側(cè)柏葉顆粒貯存液,使其終質(zhì)量濃度為1.3 g/L,同時等量DMSO的對照組,37℃靜置厭氧培養(yǎng)8 h。在4℃和10 000 r/min條件下離心10 min,棄上清,收集菌體,PBS洗滌3次,棄上清。使用負染色法處理樣品,在透射電鏡(TEM)下觀察產(chǎn)氣莢膜梭菌菌體TFP的形態(tài)。

2 結(jié)果

2.1 側(cè)柏葉顆粒對產(chǎn)氣莢膜梭菌TFP表型功能的影響

2.1.1側(cè)柏葉顆粒抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌的滑動運動 如圖1所示,經(jīng)37℃厭氧培養(yǎng)72 h后,產(chǎn)氣莢膜梭菌ATCC13124在0.7% BHI瓊脂平板呈現(xiàn)滑動運動趨勢。相比于陽性對照組,側(cè)柏葉顆粒處理組滑動運動半徑明顯減小,差異顯著;DMSO組滑動運動趨勢與陽性對照組無統(tǒng)計學差異。結(jié)果表明,側(cè)柏葉顆粒顯著抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌的滑動運動。

2.1.2側(cè)柏葉顆粒抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌生物被膜的形成 如圖2所示,與陽性對照組相比,在側(cè)柏葉顆粒的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)(0.65～2.60 g/L),產(chǎn)氣莢膜梭菌生物被膜的形成率呈劑量性降低,表明側(cè)柏葉顆粒顯著抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌生物被膜形成。

圖2 側(cè)柏葉顆粒抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌生物被膜形成

2.2 側(cè)柏葉顆粒對產(chǎn)氣莢膜梭菌黏附至Caco-2細胞的影響

2.2.1側(cè)柏葉顆粒對Caco-2細胞無明顯檢測毒性 如圖3所示,與陰性對照組相比,不同質(zhì)量濃度的側(cè)柏葉顆粒處理Caco-2細胞后,培養(yǎng)體系中LDH釋放率差異并不顯著,表明在受試質(zhì)量濃度范圍內(nèi)(0.65～5.20 g/L),側(cè)柏葉顆粒對Caco-2細胞無可檢測細胞毒性。

圖3 側(cè)柏葉顆粒對Caco-2細胞的細胞毒性

2.2.2側(cè)柏葉顆粒劑抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌黏附至Caco-2細胞 如圖4所示,陽性對照組黏附率為(71.05±3.70)%,不同質(zhì)量濃度側(cè)柏葉顆粒組的黏附率分別為(51.15±2.23)%和(39.73±2.03)%,相比陽性對照組黏附率顯著降低。結(jié)果表明,側(cè)柏葉顆粒顯著抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌黏附至Caco-2細胞。

圖4 側(cè)柏葉顆粒對產(chǎn)氣莢膜梭菌黏附至Caco-2細胞的抑制作用

2.3 側(cè)柏葉顆粒對產(chǎn)氣莢膜梭菌TFP基因轉(zhuǎn)錄和菌毛形態(tài)的影響

2.3.1側(cè)柏葉顆粒對產(chǎn)氣莢膜梭菌TFP基因轉(zhuǎn)錄的影響 由圖5可知,質(zhì)量濃度為1.3 g/L的側(cè)柏葉顆粒顯著降低產(chǎn)氣莢膜梭菌TFP相關(guān)基因virR、virS、pilA、pilD、pilT、pilC和pilM的mRNA轉(zhuǎn)錄。

圖5 側(cè)柏葉顆粒對產(chǎn)氣莢膜梭菌TFP相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的影響

2.3.2側(cè)柏葉顆粒對產(chǎn)氣莢膜梭菌TFP形態(tài)的影響 由圖6可知,在10 000倍視野中,陽性對照組菌體邊緣可見纖維狀菌毛存在,菌體周身呈絨毛狀;經(jīng)側(cè)柏葉顆粒(1.3 g/L)處理后,菌體邊緣幾乎無纖維狀菌毛存在,菌體周身光滑。結(jié)果表明側(cè)柏葉顆?？梢砸种飘a(chǎn)氣莢膜梭菌TFP菌毛的形態(tài),導致TFP結(jié)構(gòu)缺失。

注:左側(cè)圖(×5 000);右側(cè)圖(×10 000)

3 討論

“減抗和限抗”的政策法令實施之前,畜牧生產(chǎn)中主要通過在飼料中添加抗生素來預防和控制病原微生物的感染,同時作為促生長劑,提升動物的生產(chǎn)性能,如桿菌肽和維吉尼亞霉素的應用等。隨著飼料端禁抗措施的實施,無疑給抗生素的研發(fā)、使用和銷售及臨床畜禽細菌性疾病的防控提出了新的挑戰(zhàn)。產(chǎn)氣莢膜梭菌導致的雞壞死性腸炎持續(xù)困擾養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展,抗生素的研發(fā)周期漫長和投資逐年增加的特點,導致新型抗生素的研發(fā)進入困境。開發(fā)新型治療策略或研制抗生素替代藥物進行畜禽疾病防控成為公認的思路。相比于傳統(tǒng)抗生素直接抑菌/抗菌的作用機制,通過抑制細菌生命過程非必需成分(如溶血素、菌毛、鞭毛和產(chǎn)氣莢膜梭菌TFP)為靶標的抗毒力藥物研發(fā)成為研究熱點。近年來,已有許多以細菌毒力因子為靶標的天然化合物和小分子抑制劑陸續(xù)被報道出來[15-17],也為新型藥物研發(fā)提供了科學范例。我國中藥資源和應用歷史悠久,尤其清熱解毒或補中益氣等藥性的中藥及方劑為抗感染藥物研發(fā)和臨床應用奠定了基礎(chǔ)。中藥具備來源廣、活性豐富、成本低、無藥物殘留和綠色環(huán)保等優(yōu)勢,為抗細菌感染新藥研發(fā)提供了良好的資源寶庫。隨著如今人們生活水平的提高和環(huán)保意識的增強,對綠色健康養(yǎng)殖和動物性產(chǎn)品的安全性要求提出了新的要求,開發(fā)新型獸用中藥制劑成為抗生素替代藥物研發(fā)的突破點。本研究正是基于前期研究基礎(chǔ),通過建立靶向產(chǎn)氣莢膜梭菌TFP的小分子抑制劑篩選平臺,在中藥來源的天然化合物中進行篩選,獲得了活性良好的穗花衫雙黃酮。通過選擇成藥性良好的側(cè)柏葉作為理想中藥材,經(jīng)過提取工藝、處方工藝和制劑工藝研究制備出適合規(guī)?；B(yǎng)雞場群體給藥的側(cè)柏葉顆粒制劑,旨在研發(fā)含量較高、活性良好和含量穩(wěn)定的防治雞壞死性腸炎的新型獸用制劑。

為了闡明側(cè)柏葉顆粒劑的藥理活性和作用機制,在前期研究基礎(chǔ)之上進行了后續(xù)研究。首先,通過滑動運動和生物被膜測試2種表型驗證側(cè)柏葉顆粒對產(chǎn)氣莢膜梭菌TFP功能的抑制作用;隨后,通過細胞黏附試驗測定側(cè)柏葉顆粒抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌黏附至Caco-2細胞的作用;最后,借助qRT-PCR測定側(cè)柏葉顆粒對TFP相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的影響,結(jié)合透射電子顯微鏡(TEM)觀察側(cè)柏葉顆粒處理對產(chǎn)氣莢膜梭菌TFP形態(tài)的影響,通過以上研究確證了側(cè)柏葉顆粒對產(chǎn)氣莢膜梭菌TFP功能的抑制作用,闡明抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌TFP介導功能的作用機制。綜上所述,該研究為產(chǎn)氣莢膜梭菌感染的雞壞死性腸炎防治提供了新型中獸藥制劑,也為側(cè)柏葉顆粒劑的臨床開發(fā)和應用提供了科學依據(jù)。