胡 沛,彭 旭,程 丹,李 甜,王媛媛,高麗旭,袁 祥,彭遠(yuǎn)義,李能章

(西南大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,重慶 北碚 400715)

多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida,Pm)是一種重要的畜禽病原,可感染人和多種動(dòng)物[1-5],嚴(yán)重威脅人和動(dòng)物健康。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì),目前發(fā)現(xiàn)有40余種動(dòng)物可感染多殺性巴氏桿菌,包括所有家禽家畜,給養(yǎng)殖戶(hù)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[6-7]。根據(jù)莢膜和LPS組成差異,多殺性巴氏桿菌可以分為5種莢膜血清型(A、B、D、E和F)和1～16種LPS血清型[8-9],不同血清型間的交叉免疫保護(hù)性弱。多殺性巴氏桿菌現(xiàn)有商品化疫苗種類(lèi)較少,主要針對(duì)豬牛源莢膜B型和兔及家禽源莢膜A型等少數(shù)幾種多殺性巴氏桿菌血清型的防控,由于多殺性巴氏桿菌菌株的宿主特異性差異及出現(xiàn)的部分血清型菌株跨物種感染,致使傳統(tǒng)的多殺性巴氏桿菌滅活疫苗和弱毒疫苗并不能達(dá)到理想的免疫保護(hù)效果,因此,開(kāi)發(fā)新型廣譜性疫苗是多殺性巴氏桿菌感染防控的關(guān)鍵。

前期研究發(fā)現(xiàn),群體感應(yīng)基因qseC的缺失,可致使多殺性巴氏桿菌的毒力顯著降低,并且賦予了菌株較強(qiáng)的交叉免疫保護(hù)特性[10],該研究表明群體感應(yīng)基因缺失賦予了多殺性巴氏桿菌菌株交叉免疫保護(hù)特性。細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)(quorum sensing system)主要有4種:LuxI/LuxR信號(hào)系統(tǒng)[11]、AIP介導(dǎo)的信號(hào)系統(tǒng)[12]、AI-2介導(dǎo)的信號(hào)系統(tǒng)[13]和AI-3介導(dǎo)的信號(hào)系統(tǒng)[14]。qseC基因?qū)儆贏I-3介導(dǎo)的群體感應(yīng)系統(tǒng)[15],分析發(fā)現(xiàn)多殺性巴氏桿菌中還存在AI-2介導(dǎo)的群體感應(yīng)系統(tǒng),luxS基因參與AI-2合成[16],有研究發(fā)現(xiàn),基于大腸桿菌aroA基因缺失株構(gòu)建的aroA及l(fā)uxS雙基因缺失株,其運(yùn)動(dòng)性、黏附性、侵入性和毒力進(jìn)一步得到了降低[17]。那么在多殺性巴氏桿菌中,qseC及l(fā)uxS這2個(gè)來(lái)源不同群體感應(yīng)系統(tǒng)的基因缺失,是否在菌株相關(guān)生物性狀變化量及交叉免疫保護(hù)效果上有疊加效應(yīng),這是本研究想要探討的問(wèn)題,以期為多殺性巴氏桿菌廣譜性疫苗研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

本研究在多殺性巴氏桿菌qseC基因缺失株的基礎(chǔ)上,進(jìn)行了luxS基因的缺失,成功獲得qseC及l(fā)uxS基因雙缺失株(ΔqseCΔluxS),并對(duì)其莢膜、生物膜產(chǎn)生、生長(zhǎng)繁殖情況及抗逆性等生物學(xué)特性以及致病力變化、交叉免疫保護(hù)特性等,與ΔqseC及野生株P(guān)mCQ2進(jìn)行了比較分析。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物牛源A型多殺性巴氏桿菌qseC基因缺失株(ΔqseC：LD50=5.28×107CFU,來(lái)源于PmCQ2)、牛源A型多殺性巴氏桿菌(PmCQ1:LD50=3.80×102CFU,PmCQ2:LD50=3.40×103CFU)、牛源F型多殺性巴氏桿菌(PmF:LD50=1.00×108CFU)、禽源A型多殺性巴氏桿菌(PmQ:LD50≈1.00 CFU)和兔源A型多殺性巴氏桿菌(PmR:LD50=1.00×104CFU)均由西南大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建及分離暫存。牛源B型多殺性巴氏桿菌(PmB,CVCC470:LD50=5.00×103CFU)和豬源A型多殺性巴氏桿菌(PmP,CVCC1662:LD50≈1.00 CFU)購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所獸醫(yī)微生物菌種保藏中心,以上LD50均為肌肉途徑感染小鼠模型測(cè)定。用于多殺性巴氏桿菌溫敏型基因缺失載體pUC19oriKanR由實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建保藏。昆明小鼠(雌性,18～20 g)購(gòu)自恩斯維爾實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,其飼養(yǎng)及試驗(yàn)方法由西南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審查委員會(huì)監(jiān)督。

1.2 主要試劑馬丁肉湯、LB等培養(yǎng)基購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司;卡那霉素、Stains all粉末(7423-31-6)、結(jié)晶紫(548-62-9)及吐溫-20均購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司;限制性核酸內(nèi)切酶購(gòu)自TaKaRa;In-Fusion?HD Cloning Kit (PT5-162-1)購(gòu)自Clontech;羊抗鼠IgG-HRP購(gòu)自Thermo Scientific公司;15 A VG礦物油乳化劑為重慶澳龍生物制品有限公司贈(zèng)送;TMB顯色液(3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺)購(gòu)自Beyotime公司。

1.3 雙基因缺失株的構(gòu)建本研究選擇對(duì)ΔqseC中的luxS基因進(jìn)行缺失。缺失株構(gòu)建方法參見(jiàn)前期研究[18],所用引物見(jiàn)表1。取-80℃保藏的ΔqseC劃線(xiàn)接種在馬丁固體培養(yǎng)基上,37℃培養(yǎng)24 h,提取基因組DNA備用。以基因組DNA為模板,利用luxS5′ARM-F/R和luxS3′ARM -F/R引物對(duì),擴(kuò)增luxS基因上、下游同源臂,純化上、下游同源臂,以此為模板,采用luxS5′ ARM -F/luxS3′ ARM-R進(jìn)行擴(kuò)展,獲得上、下游同源臂融合DNA片段,純化片段克隆進(jìn)多殺性巴氏桿菌溫敏型基因缺失載體pUC19oriKanR中,重組載體通過(guò)電轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)入ΔqseC細(xì)胞中,PCR初步篩選獲得luxS基因缺失株,其后通過(guò)PCR方法確認(rèn)luxS基因的缺失情況,驗(yàn)證luxS缺失株的準(zhǔn)確性,對(duì)驗(yàn)證正確的缺失株,在無(wú)抗培養(yǎng)基上37℃條件下連續(xù)傳代培養(yǎng),保證缺失株的抗性消除和遺傳穩(wěn)定性。

表1 基因缺失株構(gòu)建所需引物

1.4 生長(zhǎng)曲線(xiàn)測(cè)定取-80℃保存的PmCQ2、ΔqseC及ΔqseCΔluxS分別劃線(xiàn)接種于馬丁固體平板,37℃倒置培養(yǎng)24.0 h,各挑取3～4個(gè)菌落分別接種于5 mL 馬丁液體培養(yǎng)基中,37℃、220 r/min震蕩培養(yǎng)12.0 h,平板計(jì)數(shù),其后接種等量菌體于相同體積馬丁液體培養(yǎng)基中,37℃、220 r/min震蕩培養(yǎng),每隔1.5 h取樣測(cè)定D600值,共取11個(gè)時(shí)間點(diǎn),繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)。試驗(yàn)每次設(shè)3個(gè)生物重復(fù),重復(fù)2次。

1.5 莢膜多糖含量測(cè)定分別取PmCQ2、ΔqseC及ΔqseCΔluxS對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌液各1 mL,12 000 r/min離心15 min,棄上清,無(wú)菌PBS洗滌菌體3次,用1 mL PBS重懸菌體,其后取10 μL稀釋進(jìn)行平板計(jì)數(shù),剩余菌懸液放置42℃金屬浴中處理1 h后,12 000 r/min離心15 min,取100 μL上清液加入900 μL莢膜染色液(由0.2 g/L 的Stains all固體粉末、0.06%的冰醋酸和50%的甲酰胺配制而成)中,測(cè)定D640值。分別取濃度為0,0.5,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0 μg/100 μL的透明質(zhì)酸溶液100 μL,加入到900 μL莢膜染液中,測(cè)定D640值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算各菌株的莢膜多糖含量(多殺性巴氏桿菌莢膜主要成分為透明質(zhì)酸)。試驗(yàn)每次設(shè)5個(gè)生物重復(fù),重復(fù)2次。

1.6 生物膜形成量測(cè)定分別取PmCQ2、ΔqseC及ΔqseCΔluxS對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌液,平板計(jì)數(shù)后,用BHI肉湯液體培養(yǎng)基稀釋(108CFU/mL),分別加入 48孔板中(400 μL/孔),陰性對(duì)照組加入BHI肉湯,37℃靜置培養(yǎng)48 h,吸凈菌液,于培養(yǎng)孔中加入甲醇固定(200 μL/孔),30 min后,吸出甲醇液,PBS洗滌3次,室溫干燥1 h,其后,每孔加入1%結(jié)晶紫200 μL ,靜置處理30 min后,棄染色液, PBS洗滌3次,室溫干燥,每孔加入33%冰乙酸200 μL,37℃恒溫處理30 min,測(cè)定D630值。試驗(yàn)每次設(shè)5個(gè)生物重復(fù),重復(fù)2次。

1.7 血清敏感性試驗(yàn)分別取PmCQ2、ΔqseC及ΔqseCΔluxS對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌液,平板計(jì)數(shù),稀釋至1×105CFU/mL,各取10 μL菌液,分別加入900 μL滅活牛血清(56℃處理30 min)和未滅活牛血清中,37℃處理1 h后進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。血清處理細(xì)菌存活率=(未滅活牛血清中細(xì)菌數(shù)/滅活牛血清中細(xì)菌數(shù))×100%。試驗(yàn)每次設(shè)3個(gè)生物重復(fù),重復(fù)2次。

1.8 半數(shù)致死量(LD50)測(cè)定取ΔqseCΔluxS對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌液,平板計(jì)數(shù),分別以2.2×106,2.2×107,2.2×108,2.2×109CFU劑量腹腔途徑感染小鼠(8只/組),對(duì)感染小鼠進(jìn)行1周監(jiān)測(cè),對(duì)瀕死小鼠實(shí)施安樂(lè)死并記入死亡數(shù)。采用Reed-Muench計(jì)算ΔqseCΔluxS的LD50。

1.9 雙缺失株滅活疫苗的制備取ΔqseCΔluxS進(jìn)行劃線(xiàn)培養(yǎng),挑取3～4個(gè)菌落接種于5 mL馬丁液體培養(yǎng)基,37℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)12 h,按1∶100接種入200 mL馬丁培養(yǎng)基中,37℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)8 h后取出,取菌液進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)的同時(shí)進(jìn)行濃縮,加入終濃度為0.15%的甲醛溶液,37℃靜置處理24 h,靜置期間每隔6 h搖1次,使菌體充分滅活,其后取滅活菌100 μL,涂于馬丁固體平板,37℃培養(yǎng)24 h,檢驗(yàn)滅活效果。滅活合格菌液及PBS液分別與15A VG礦物油佐劑按4∶1的體積比混合,充分振蕩乳化直至靜置不分層為止,制備出ΔqseCΔluxS滅活疫苗(5×109CFU/mL)和PBS乳化劑。取100 μL滅活疫苗涂布于馬丁固體平板上,37℃培養(yǎng)24 h,進(jìn)行活菌檢測(cè),另取6只小鼠,分別在背部皮下接種100 μL滅活疫苗,評(píng)價(jià)疫苗的安全性。合格疫苗4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.10 雙缺失株疫苗免疫保護(hù)性測(cè)定選用18～20 g雌性昆明小鼠分組(6只/組),按照表2～3分別接種滅活疫苗和弱毒疫苗(對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期培養(yǎng)菌的PBS重懸液),免疫劑量與文獻(xiàn)YANG等[10]中的ΔqseC疫苗一致。滅活疫苗免疫途徑采用背部皮下多點(diǎn)注射,加強(qiáng)免疫1次,在首免后14 d進(jìn)行,弱毒疫苗免疫采用腿部肌肉注射,僅免疫1次。2種疫苗菌在首免后21 d分別采用3.6×107CFU PmCQ1 (LD50=3.8×102CFU),1.8×107CFU PmCQ2 (LD50=3.4×103CFU),1.1×107CFU PmB (LD50=5.0×103CFU),1.2×108CFU PmF (LD50=1.0×108CFU),1.2×105CFU PmR (LD50=1.0×104CFU),10 CFU PmP (LD50≈1.0 CFU),10 CFU PmQ (LD50≈1.0 CFU)進(jìn)行肌肉攻毒。攻毒后每天觀察小鼠,持續(xù)1周,對(duì)瀕死小鼠實(shí)施安樂(lè)死并記入死亡數(shù)。疫苗保護(hù)率按以下公式計(jì)算:保護(hù)率=(對(duì)照組死亡率-免疫組死亡率)/對(duì)照組死亡率×100%。

表2 滅活苗免疫分組和攻毒

表3 弱毒苗免疫分組和攻毒

1.11 抗體消長(zhǎng)規(guī)律分析雌性昆明小鼠分為2組(6只/組),組1肌肉途徑免疫ΔqseCΔluxS弱毒苗(3.3×108CFU/只),組2對(duì)照注射等體積無(wú)菌PBS液,免疫后每隔7 d,尾靜脈采血分離血清保存,連續(xù)采集12周,采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)小鼠血清抗體水平。

1.12 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用軟件Graphpad Prism 9.0對(duì)相關(guān)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。ns.P>0.05 為無(wú)顯著性差異,*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001及****.P<0.000 1為顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1qseC及l(fā)uxS雙基因缺失株的構(gòu)建qseC及l(fā)uxS基因?yàn)槎鄽⑿园褪蠗U菌群體感應(yīng)系統(tǒng)相關(guān)基因。前期發(fā)現(xiàn)qseC基因缺失使菌株毒力顯著降低,并賦予菌株很強(qiáng)的交叉保護(hù)性,而野生株卻無(wú)相關(guān)表現(xiàn)[10]。為此思考同為群體感應(yīng)的luxS基因缺失是否能夠加強(qiáng)qseC基因缺失株的相關(guān)特性。因此,本研究在ΔqseC基礎(chǔ)上,通過(guò)同源重組進(jìn)行了luxS基因的缺失。在基因缺失設(shè)計(jì)方面,考慮到luxS基因上、下游其他基因的距離,設(shè)計(jì)了僅缺失luxS基因的前部分(圖1A),缺失該部分片段后,使該基因不能翻譯出原有蛋白,其相關(guān)功能失活。在進(jìn)行l(wèi)uxS基因缺失前,對(duì)qseC基因缺失株進(jìn)行了再次驗(yàn)證(圖1B),確保了菌株的準(zhǔn)確性。所構(gòu)建的雙基因缺失株也分別進(jìn)行qseC基因和luxS基因的PCR驗(yàn)證,其缺失部分大小均正確(圖1C),通過(guò)測(cè)序,也驗(yàn)證了所缺失部分準(zhǔn)確無(wú)誤,確定了構(gòu)建菌株為qseC和luxS雙基因缺失株。因基因缺失是采用的同源重組方法,在片段發(fā)生交換后,含有交換基因片段的載體要快速清除,不然會(huì)發(fā)生回復(fù)交換。本研究中所采用的缺失載體為溫敏型載體,37℃?zhèn)鞔囵B(yǎng)消除了質(zhì)粒,其后再進(jìn)行體外連續(xù)傳代和體內(nèi)感染后分離細(xì)菌檢測(cè),確保了缺失株的遺傳穩(wěn)定(圖1D,E)。

2.2 缺失株的生物學(xué)特征分析對(duì)野生型PmCQ2、ΔqseC及ΔqseCΔluxS的部分生物學(xué)特性進(jìn)行了比較分析。3種菌分別涂布培養(yǎng)在馬丁固體平板上,37℃培養(yǎng)24.0 h后,ΔqseCΔluxS的菌落形態(tài)略微小于ΔqseC,明顯小于PmCQ2(圖2A),接種于馬丁肉湯培養(yǎng)基中,前7.5 h ΔqseCΔluxS與ΔqseC生長(zhǎng)一致,慢于PmCQ2,其后,ΔqseCΔluxS生長(zhǎng)稍微快于PmCQ2及ΔqseC(圖2B)。ΔqseCΔluxS菌落雖小,但后期生長(zhǎng)速度并未低于野生株P(guān)mCQ2及ΔqseC,其原因可能與莢膜含量的多少相關(guān),測(cè)定其莢膜發(fā)現(xiàn),ΔqseCΔluxS莢膜量顯著低于ΔqseC,ΔqseC又顯著低于PmCQ2(圖2D),液體培養(yǎng)后4℃靜置1周,ΔqseCΔluxS和ΔqseC更易于沉降(圖2C),ΔqseCΔluxS和ΔqseC雖莢膜量降低了,但菌體也沒(méi)有像有的細(xì)菌靜置后很快沉降到管底,表明其存在的莢膜多糖的水合特性仍能使其細(xì)胞維持懸浮狀。有研究表明,多殺性巴氏桿菌中莢膜多糖的生成與生物膜的生產(chǎn)成反比[19],測(cè)定ΔqseCΔluxS生物膜產(chǎn)生情況,發(fā)現(xiàn)顯著高于PmCQ2及ΔqseC(圖2E),其莢膜多糖的產(chǎn)生與生物膜也成反比。血清敏感性測(cè)定發(fā)現(xiàn),與野生型相比PmCQ2、ΔqseCΔluxS對(duì)血清處理更為敏感性,細(xì)菌細(xì)胞存活數(shù)顯著降低,與ΔqseC的血清敏感性無(wú)顯著性差異(圖2F)。進(jìn)一步分析qseC和luxS雙基因缺失對(duì)菌株毒力的影響,以Reed-Muench法計(jì)算ΔqseCΔluxS的LD50為5.50×107CFU(圖2G),其毒力顯著低于野生株P(guān)mCQ2(腹腔途徑感染LD50=1.00 CFU)[20],毒力比qseC基因缺失株(LD50=5.28×107CFU)[10]有所降低。

2.3 交叉免疫保護(hù)性測(cè)定及比較分析前期研究發(fā)現(xiàn),ΔqseC具有較強(qiáng)的交叉免疫保護(hù)作用[10],那么在此基礎(chǔ)上繼續(xù)進(jìn)行l(wèi)uxS基因缺失后,菌株是否在其交叉免疫保護(hù)方面有所不同,為此,在此對(duì)ΔqseCΔluxS的交叉免疫保護(hù)性進(jìn)行相關(guān)測(cè)定,考慮到與ΔqseC制備疫苗進(jìn)行比較分析,ΔqseCΔluxS的疫苗制備及免疫劑量與途徑也與前期研究的ΔqseC一致。以ΔqseCΔluxS制備的滅活疫苗和弱毒苗分別免疫小鼠,首免后21 d,取1組采集尾靜脈血分離血清,采用不同攻毒株細(xì)胞蛋白為抗原進(jìn)行包被,ELISA測(cè)定疫苗產(chǎn)生的針對(duì)各攻毒株的抗體水平,發(fā)現(xiàn)其滅活疫苗針對(duì)各攻毒株均有較高的抗體水平,免疫個(gè)體間差異小(圖3A),而弱毒疫苗針對(duì)各攻毒株的抗體水平顯著低于滅活疫苗,免疫個(gè)體間的抗體水平差異大(圖3A,圖4A),這也表明弱毒苗導(dǎo)致各個(gè)體小鼠感染程度的不同,疫苗免疫效果差異度大。攻毒保護(hù)性測(cè)定發(fā)現(xiàn),ΔqseCΔluxS滅活疫苗對(duì)2株牛源A型多殺性巴氏桿菌(PmCQ1和PmCQ2)的保護(hù)率分別為67%和83%(圖3B,C),對(duì)牛源B型多殺性巴氏桿菌(PmB)的保護(hù)率為83%(圖3D),對(duì)兔源A型多殺性巴氏桿菌(PmR)的保護(hù)率僅為33%(圖3F),對(duì)牛源F型、豬源A型及禽源A型多殺性巴氏桿菌(PmF、PmP和PmQ)沒(méi)有保護(hù)作用(圖3E,G～H)。而ΔqseCΔluxS的弱毒苗對(duì)PmCQ1、PmCQ2、PmB及PmR感染的保護(hù)率均為100%(圖4B～D,F),對(duì)PmF的保護(hù)率為90%(圖4E),對(duì)PmP和PmQ沒(méi)有保護(hù)性(圖4G,H)。即便ΔqseCΔluxS的弱毒苗疫苗的抗體水平低于滅活疫苗,但其交叉免疫保護(hù)效果仍顯著優(yōu)于滅活疫苗,而前期研究發(fā)現(xiàn),以野毒株P(guān)mCQ2制備的滅活苗交叉免疫保護(hù)性很弱,qseC基因缺失株的交叉免疫保護(hù)效果較好[10]。

A.ΔqseCΔluxS滅活苗免疫后21 d 血清抗體水平;B～H.各菌株感染小鼠存活曲線(xiàn) (PmCQ1、PmCQ2、PmB、PmF、PmR、PmP、PmQ)

A.ΔqseCΔluxS弱毒苗免疫后21 d 血清抗體水平;B～H.各菌株感染小鼠的存活曲線(xiàn)(PmCQ1、PmCQ2、PmB、PmF、PmR、PmP、PmQ)

本研究中ΔqseCΔluxS的交叉免疫保護(hù)性效果與以前研究中做的ΔqseC的交叉免疫保護(hù)性比較發(fā)現(xiàn)(表4),luxS基因的缺失并未整體增強(qiáng)原qseC缺失株的交叉免疫保護(hù)效果,但卻增強(qiáng)了菌株對(duì)于牛源F型多殺性巴氏桿菌感染的交叉保護(hù)性。如僅從滅活疫苗的角度來(lái)看,luxS基因缺失是顯著減弱了原qseC缺失株的交叉免疫保護(hù)效果。由此可以看出,在多殺性巴氏桿菌交叉免疫保護(hù)性方面,基因缺失的多少與保護(hù)性間無(wú)明顯相關(guān)性,但可能與缺失基因本身所調(diào)控的交叉免疫保護(hù)性抗原產(chǎn)生量有關(guān)。

表4 ΔqseC和ΔqseCΔluxS相關(guān)疫苗的保護(hù)性 %

2.4 抗體消長(zhǎng)規(guī)律為進(jìn)一步了解ΔqseCΔluxS弱毒疫苗免疫后抗體產(chǎn)生的動(dòng)態(tài)變化,免疫后每周采血分離血清測(cè)定其針對(duì)PmCQ2和PmB的抗體水平。首免14 d,就能檢測(cè)到較高的針對(duì)PmCQ2抗體水平,并持續(xù)超9周(圖5A)。抗PmB抗體在21 d時(shí)也達(dá)到較高的水平,56 d時(shí)達(dá)到最高,抗體高水平維持超過(guò)8周(圖5B)。由于僅監(jiān)測(cè)了11周,但從其動(dòng)態(tài)趨勢(shì)來(lái)看,其高抗體水平應(yīng)可維持更長(zhǎng)時(shí)間。

A．弱毒苗免疫后抗PmCQ2的抗體水平變化;B.弱毒苗免疫后抗PmB的抗體水平變化

3 討論

多殺性巴氏桿菌是一種人畜共患性細(xì)菌病原,可感染人及多種動(dòng)物,目前發(fā)現(xiàn)一些水生動(dòng)物如海獅[21]也可感染多殺性巴氏桿菌,但其危害最大的仍是家畜家禽,給養(yǎng)殖業(yè)帶了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。多殺性巴氏桿菌對(duì)人的感染主要因?qū)櫸镓?、犬抓?可導(dǎo)致局部和全身系統(tǒng)性感染[1],隨著寵物飼養(yǎng)量增大,相關(guān)感染案例呈現(xiàn)上升趨勢(shì),現(xiàn)還未發(fā)現(xiàn)多殺性巴氏桿菌在人群中傳播的案例,但多殺性巴氏桿菌感染還是存在潛在的公共安全風(fēng)險(xiǎn)。目前,多殺性巴氏桿菌疫苗種類(lèi)偏少,僅有少數(shù)幾種,又由于多殺性巴氏桿菌血清型多,還有部分血清型菌株間的基因水平轉(zhuǎn)移交換更增加了菌株多樣性,而各莢膜血清型間的交叉保護(hù)性弱,并存在部分動(dòng)物源血清型的跨種間感染情況,導(dǎo)致了傳統(tǒng)疫苗防控的效果并不好,防控仍依靠抗生素,但伴隨而來(lái)的問(wèn)題是其相關(guān)耐藥性增加,這無(wú)形中又增大了該病原感染的防控難度。因此,疫苗防控仍應(yīng)是多殺性巴氏桿菌疫病防控的最有利手段,基于當(dāng)前多殺性巴氏桿菌疫苗現(xiàn)狀,研發(fā)通用型疫苗是當(dāng)前多殺性巴氏桿菌防控最緊迫的任務(wù)和關(guān)鍵。

前期研究發(fā)現(xiàn),群體感應(yīng)qseC基因缺失賦予了多殺性巴氏桿菌具有很強(qiáng)的交叉免疫保護(hù)作用[10],具有作為多殺性巴氏桿菌通用型疫苗候選菌株的潛力,但該缺失株的滅活疫苗還存在一定不足,其針對(duì)其他血清型多殺性巴氏桿菌感染的保護(hù)性未達(dá)到理想效果,同時(shí)作為滅活疫苗來(lái)看,其毒力稍微偏大了些,因此思考,如果繼續(xù)缺失相關(guān)群體感應(yīng)基因,是否能夠使其毒力下降得更多,作為疫苗得保護(hù)性效果更好。因此,本研究中在qseC基因缺失株的基礎(chǔ)上繼續(xù)進(jìn)行群體感應(yīng)luxS基因的缺失,但從本研究的結(jié)果來(lái)看,qseC與luxS雙基因的缺失,對(duì)菌株的交叉免疫保護(hù)性并沒(méi)有疊加效應(yīng),反而導(dǎo)致缺失株對(duì)部分多殺性巴氏桿菌血清型菌株感染的保護(hù)性顯著降低,從這個(gè)角度來(lái)看,缺失的基因數(shù)量多少可能與菌株的交叉免疫保護(hù)性效果沒(méi)有線(xiàn)性正相關(guān),但與缺失哪些基因有關(guān),本研究也發(fā)現(xiàn)有些基因的缺失并未賦予菌株交叉免疫保護(hù)特性。

從適應(yīng)性的角度來(lái)看,大多數(shù)臨床分離病原株均具有一定的宿主偏好性,這是適應(yīng)進(jìn)化的結(jié)果,這也就導(dǎo)致了病原疫苗株的選擇難度增大,同一病原疫苗菌株差異,其保護(hù)性效果差異很大。從理論的角度來(lái)看,基因突變可能會(huì)在一定程度上改變菌株原有的宿主偏好性,打破菌株宿主偏好性壁壘,其代表種群共性的相關(guān)基因表達(dá)更高,這樣就導(dǎo)致菌株具有通用性疫苗的可能。多殺性巴氏桿菌野毒株P(guān)mCQ2交叉免疫保護(hù)性很弱,而其部分基因的缺失如qseC及hyaD基因的缺失,都賦予了菌株較強(qiáng)的交叉免疫保護(hù)作用[10,22],這也證明了以上觀點(diǎn)。多殺性巴氏桿菌中,這種基因缺失而導(dǎo)致菌株的交叉免疫保護(hù)特性,其內(nèi)在原因可能主要還是其相關(guān)交叉保護(hù)性抗原表達(dá)的上調(diào),對(duì)實(shí)驗(yàn)室多株具有交叉免疫保護(hù)作用的多殺性巴氏桿菌基因缺失株滅活苗進(jìn)行了細(xì)胞免疫差異進(jìn)行了比較分析,其結(jié)果是這些缺失株與野生株疫苗的細(xì)胞免疫無(wú)顯著性差異。同時(shí),對(duì)這些菌株可能的交叉保護(hù)性抗原進(jìn)行比較分析,并進(jìn)行了大量克隆表達(dá)及保護(hù)性測(cè)定,但結(jié)果并未令人滿(mǎn)意,多數(shù)蛋白抗原的保護(hù)性都不高(相關(guān)數(shù)據(jù)未發(fā)表),由此得出,這種基因缺失導(dǎo)致的交叉保護(hù)特性應(yīng)是多抗原共同體現(xiàn)的結(jié)果。本研究也發(fā)現(xiàn),即便是同一基因缺失,對(duì)不同多殺性巴氏桿菌菌株交叉保護(hù)特性的影響差異顯著,這也與本研究要進(jìn)行疫苗株選擇的道理是一樣,菌株本身就表現(xiàn)出不同差異。

本研究中,qseC及l(fā)uxS雙基因缺失株從整體上來(lái)看,其菌株毒力、莢膜產(chǎn)生及抗逆性顯著下調(diào),表明群體感應(yīng)系統(tǒng)相關(guān)基因與其環(huán)境生存能力密切相關(guān),不同群體感應(yīng)系統(tǒng)都起到一定的作用,效果具有疊加效應(yīng)。但從交叉免疫保護(hù)性方面來(lái)看,沒(méi)有疊加效應(yīng)。這可能與其莢膜產(chǎn)生量有一定關(guān)系,qseC單基因缺失和qseC及l(fā)uxS雙基因缺失均可導(dǎo)致菌株莢膜生成量的顯著下調(diào),但雙基因缺失明顯下調(diào)更多,莢膜是多殺性巴氏桿菌一個(gè)非常重要的毒力因子,作為疫苗菌株,莢膜缺失導(dǎo)致無(wú)相關(guān)針對(duì)莢膜的相關(guān)抗體產(chǎn)生,但同時(shí),如果疫苗株中莢膜含量過(guò)多,可能也會(huì)影響到其他交叉保護(hù)性抗原的暴露,從而影響到交叉免疫保護(hù)性抗體的產(chǎn)生量,因此,從這個(gè)方面來(lái)看,作為多殺性巴氏桿菌,含適度莢膜可能更有利于菌株產(chǎn)生交叉免疫保護(hù)作用。PETRUZZI等[19]研究發(fā)現(xiàn)A型多殺性巴氏桿菌中生物膜的形成與其莢膜的產(chǎn)生呈負(fù)相關(guān),本研究結(jié)果也與之一致,生物膜生成能力與莢膜含量通常與細(xì)菌致病性密切相關(guān),ΔqseCΔluxS的莢膜生成量降低,生物膜表達(dá)量升高,但其致病性顯著降低,表明在A型多殺性巴氏桿菌中莢膜對(duì)于毒力的貢獻(xiàn)度更大一些,即便有生物膜表達(dá)量升高對(duì)致病力增強(qiáng)為補(bǔ)充,莢膜減低仍會(huì)導(dǎo)致菌株毒力的顯著下調(diào)。生物膜表達(dá)量的增加,可能更易于A型多殺性巴氏桿菌在呼吸道黏膜上定殖及組織中的慢性感染,A型多殺性巴氏桿菌中莢膜與生物膜表達(dá)量的比率可能與其導(dǎo)致的疾病類(lèi)型密切相關(guān)。關(guān)于這種莢膜產(chǎn)生降低,而生物膜生成量升高的情況,在多殺性巴氏桿菌的其他血清型菌株中,是否也同樣存在還不得而知。

綜上來(lái)看,多殺性巴氏桿菌群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控菌株毒力,不同群體感應(yīng)系統(tǒng)間相互協(xié)調(diào)補(bǔ)充,其相關(guān)基因的缺失可能會(huì)賦予菌株較強(qiáng)的交叉免疫保護(hù)性,可作為多殺性巴氏桿菌通用型疫苗研發(fā)的參考。