柳雨竹, 王炳量,陳雨竹,甄 理,王真真,王改麗,李 姿,石俊超,蘭云剛*,宋德光*

(1.吉林大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,吉林 長(zhǎng)春 130062;2.河北省鄉(xiāng)村振興促進(jìn)中心,河北 石家莊 050000; 3.吉林省畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究院,吉林 長(zhǎng)春 130062)

豬血凝性腦脊髓炎(porcine hemagglutinating encephalomyelitis, PHE)是由豬血凝性腦脊髓炎病毒(porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus, PHEV)感染而引起仔豬的一種急性、高度接觸性傳染病[1]。PHEV是冠狀病毒科、β冠狀病毒屬成員[2],主要侵害3周齡以?xún)?nèi)的仔豬,病死率可達(dá)100%;根據(jù)臨床表現(xiàn)分為嘔吐衰減型、腦脊髓炎型、以及流感型。近年來(lái)由于PHEV的不斷變異,其感染引起的仔豬發(fā)病率與病死率逐年增加,然而針對(duì)PHE尚無(wú)有效的防制措施。

最新研究發(fā)現(xiàn),β冠狀病毒通過(guò)富集在晚期內(nèi)體/溶酶體中,利用溶酶體釋放病毒粒子[3]。靶向溶酶體功能的關(guān)鍵功能蛋白可能是抑制冠狀病毒感染和傳播的有效方法。溶酶體蛋白顆粒蛋白前體(progranulin,PGRN)是一種由granulin(GRN)基因編碼,富含半胱氨酸并具有促進(jìn)生長(zhǎng)、營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)、抗炎等多種作用的分泌型糖蛋白[4]。PGRN在腫瘤細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和外周血中性粒細(xì)胞等中均有表達(dá)。研究證實(shí),PGRN表達(dá)或轉(zhuǎn)運(yùn)異常能改變?nèi)苊阁w形態(tài)、水解酶活性,調(diào)控溶酶體膜組分含量等擾亂溶酶體正常功能,繼而干擾細(xì)胞分解代謝、信號(hào)傳導(dǎo)及質(zhì)膜修復(fù)等多種生理過(guò)程,參與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展[5]。PHEV感染宿主后會(huì)導(dǎo)致大腦皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)退行性病變相關(guān)蛋白TDP-43 等的產(chǎn)生和沉積,引發(fā)神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)發(fā)育不良、神經(jīng)元喪失、髓鞘變性等變化,表明PHEV感染誘發(fā)神經(jīng)退行性病變[6],此外,前期研究發(fā)現(xiàn)PHEV感染顯著下調(diào)神經(jīng)細(xì)胞PGRN的表達(dá)[6]。

然而PGRN在PHEV復(fù)制及其致神經(jīng)損傷過(guò)程中的作用并不清楚。據(jù)此,本研究以PHEV腦內(nèi)感染PGRN敲除鼠及其對(duì)照小鼠為研究對(duì)象,探究PGRN缺失對(duì)PHEV腦內(nèi)感染小鼠的影響,研究結(jié)果將不僅有助于揭示PGRN在PHE發(fā)病過(guò)程中的作用,而且為抗PHEV藥物研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和病毒PHEV株P(guān)HEV-CC14 (MF08-3115)[7],小鼠成神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(N2a細(xì)胞)均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物PGRN敲除小鼠由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)流感病毒試驗(yàn)室劉金華教授、寧夏大學(xué)魏凡華教授惠贈(zèng);試驗(yàn)使用4周齡野生型、敲除型小鼠均由本實(shí)驗(yàn)室培育。2組小鼠在腦內(nèi)接種PHEV,在接種后5 d 麻醉處死,冰上取出腦組織通過(guò)液氮速凍后存放于-80℃冰箱用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3 主要試劑DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清均購(gòu)自Gibco公司;胰蛋白酶購(gòu)自Sigma公司;5×SDS-PAGE Loading Buffer、RAPI蛋白裂解液(P0013B),抗熒光淬滅封片液均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司;三色預(yù)染蛋白Marker、無(wú)蛋白快速封閉液(1×)均購(gòu)自于上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司;2×SYBR Green Master Mixture購(gòu)自于Bimake公司;GAPDH抗體、TDP-43抗體、Anti-rabbit IgG(H+L)、Anti-mouse IgG(H+L)、FITC-mouse IgG(H+L) 488熒光二抗均購(gòu)自于Proteintech公司;M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、RRI、10 mmol/L dNTP、RNAiso Plus Total RNA 提取試劑均購(gòu)自于TaKaRa公司;PVDF膜(孔徑為0.45,0.22 μm)購(gòu)自Merck Millipore公司;β-Amyloid抗體購(gòu)于Santa公司;重組Anti-Alpha-synuclein抗體購(gòu)于Abcam公司;10% PAGE高分辨彩色(紅色)凝膠超快速配制試劑盒、12% PAGE高分辨彩色(綠色)凝膠超快速配制試劑盒均購(gòu)于武漢塞維爾生物科技有限公司;ECL化學(xué)發(fā)光底物購(gòu)于Biosharp公司;PHEV多抗由本實(shí)驗(yàn)室制備并保存。

1.4 Western blot檢測(cè)將采集的小鼠腦組織放于離心管中置于冰上,加入適量的含有PMSF的RIPA裂解液,用酒精消毒后,眼科手術(shù)剪碎組織,使用手持均漿器進(jìn)行均漿,裂解30 min。將樣品以12 000 r/min 4℃離心10 min去除組織碎片,最后加入上樣緩沖液,開(kāi)水煮沸10 min。取樣品加入預(yù)制的PAGE凝膠中,200 V恒壓30 min進(jìn)行電泳分離;電轉(zhuǎn)印將蛋白印至PVDF膜上,使用快速封閉液封閉10 min后,加入β-Amyloid、TDP-43、α-SYN、PHEV抗體于4℃孵育過(guò)夜;TBST清洗5 min/次,用HRP標(biāo)記的二抗孵育1 h,充分清洗后ECL顯影并采集圖像,使用Image J 對(duì)條帶的灰度值進(jìn)行分析。

1.5 熒光定量PCR檢測(cè)采集的小鼠腦組織根據(jù)RNAiso Plus Total RNA提取試劑說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA,測(cè)定濃度后反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用Line Gene9600 Plus熒光定量PCR檢測(cè)儀進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系如下:2×SYBR Green Master Mix 10 μL,cDNA模板2 μL,上、下游引物各1 μL,蒸餾水補(bǔ)充至20 μL。所有數(shù)據(jù)均由Gene 9660軟件分析。

1.6 引物合成在GenBank中查找PHEV、GAPDH、IL-1β、TNF-α、CCL4、CCL5、CXCL10、IFN-α、IFN-β、IL-10、IL-12p40等基因序列,使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物,將引物序列發(fā)送至吉林省庫(kù)美生物科技有限公司合成(表1)。

表1 熒光定量PCR反應(yīng)引物信息

1.7 石蠟切片制作小鼠腦組織取出后放在10%中性福爾馬林溶液中固定24 h以上,之后放入不同濃度的酒精中脫水,二甲苯透明后,浸蠟和包埋,最后切片。

1.8 間接免疫熒光將上述切片進(jìn)行脫蠟復(fù)水等步驟后,選用檸檬酸鈉(pH=6.0)溶液進(jìn)行抗原修復(fù),37℃ 10%脫脂奶粉封閉1 h后,孵育一抗過(guò)夜,后用PBS沖洗表面殘余抗體,室溫孵育熒光二抗1 h,PBS沖洗,滴加抗熒光淬滅液(含Hoechst)封片。熒光顯微鏡觀察,選擇不同波段激發(fā)光,采集圖像。

2 結(jié)果

2.1 PHEV腦內(nèi)感染小鼠后的體質(zhì)量和存活時(shí)間變化選取4周齡、眼觀體表健康的野生型小鼠(PGRN+/+)和PGRN敲除小鼠(PGRN-/-),在小鼠兩眼連接線的中點(diǎn)向上2～4 cm的部位,進(jìn)行腦內(nèi)接種PHEV。記錄接毒后1～5 d的體質(zhì)量變化(圖1 A),同時(shí)統(tǒng)計(jì)5 d內(nèi)2組小鼠的存活率(圖1 B),結(jié)果表明,PGRN敲除后體質(zhì)量下降趨勢(shì)緩慢并且延長(zhǎng)了小鼠的存活時(shí)間。

圖1 2組腦內(nèi)接種小鼠的體質(zhì)量變化(A)和生存曲線(B)

2.2 PHEV腦內(nèi)感染小鼠后病毒含量的變化對(duì)4周齡的野生型小鼠(PGRN+/+) 和 PGRN敲除小鼠(PGRN-/-)進(jìn)行腦內(nèi)接種PHEV,收集發(fā)病的小鼠腦組織進(jìn)行Western blot、熒光定量PCR和間接免疫熒光檢測(cè),結(jié)果如圖2所示,與野生型小鼠相比,PGRN敲除小鼠腦內(nèi)的病毒含量顯著降低。

A.腦內(nèi)接種后腦組織內(nèi)蛋白水平檢測(cè)圖;B.腦內(nèi)接種后腦組織熒光定量PCR;C.腦內(nèi)接種后2組小鼠大腦皮層內(nèi)病毒含量熒光圖。***.P<0.001

2.3 PHEV腦內(nèi)感染小鼠后相關(guān)細(xì)胞因子的變化在接毒后4～5 d,2組小鼠出現(xiàn)明顯的神經(jīng)癥狀,采集2組小鼠的腦組織,取全腦應(yīng)用熒光定量PCR方法檢測(cè)細(xì)胞因子的變化,發(fā)現(xiàn)干擾素和抗腫瘤細(xì)胞因子含量明顯升高,趨化因子含量降低,結(jié)果如圖3所示。

注:*.P<0.05;**.P<0.01

2.4 PHEV腦內(nèi)感染小鼠后神經(jīng)退行性病變相關(guān)蛋白的變化收集2組發(fā)病后的小鼠腦組織,應(yīng)用Western blot檢測(cè),發(fā)現(xiàn)PGRN敲除鼠腦內(nèi)TDP-43蛋白的表達(dá)水平顯著升高,而α-SYN、β-Amyloid蛋白的表達(dá)水平無(wú)顯著性差異,結(jié)果如圖4所示。

A.β-Amyloid 蛋白圖;B.TDP-43 蛋白圖;C.α-SYN蛋白圖。ns.P>0.05;*.P<0.05

3 討論

PHE是由PHEV感染引起的一種急性接觸性傳染病,在全世界范圍內(nèi)廣泛流行,主要感染仔豬,臨床上可分為神經(jīng)型和嘔吐型[8]。2015年,美國(guó)密歇根州暴發(fā)了以流感樣癥狀為主的、感染成年豬的新型PHEV病毒株[9],韓國(guó)也報(bào)道了在腹瀉的新生仔豬中發(fā)現(xiàn)了1株新型PHEV[10],表明PHEV是在不斷進(jìn)化的,并且存在變異的風(fēng)險(xiǎn)。因此,深入研究PHEV致病機(jī)制和防控手段刻不容緩。

溶酶體作為機(jī)體內(nèi)一種十分重要的細(xì)胞器,通過(guò)消化細(xì)胞內(nèi)錯(cuò)誤折疊的蛋白維持機(jī)體的穩(wěn)態(tài)。最新研究發(fā)現(xiàn),β-冠狀病毒利用溶酶體進(jìn)行復(fù)制并導(dǎo)致溶酶體功能障礙,但不清楚哪些溶酶體功能相關(guān)蛋白在這個(gè)過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。前期研究發(fā)現(xiàn),β-冠狀病毒屬成員PHEV感染能顯著下調(diào)溶酶體功能蛋白PGRN表達(dá),暗示該蛋白在PHEV復(fù)制過(guò)程中發(fā)揮重要作用[7]。而本研究首先對(duì)PGRN基因缺失小鼠腦內(nèi)接種PHEV,通過(guò)體質(zhì)量變化和生存率的統(tǒng)計(jì),發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組野生型小鼠相比,敲除PGRN后感染PHEV小鼠的存活時(shí)間延長(zhǎng),推斷敲除PGRN后PHEV的感染和復(fù)制受到抑制。隨后利用Western blot、熒光定量PCR、間接免疫熒光方法對(duì)小鼠腦內(nèi)病毒含量進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)敲除PGRN小鼠腦組織內(nèi)的病毒含量顯著降低,暗示PGRN在PHEV體內(nèi)復(fù)制過(guò)程中發(fā)揮重要作用。那么PHEV是否通過(guò)下調(diào)PGRN并影響溶酶體功能,進(jìn)而利于病毒的復(fù)制和傳播,還有待于進(jìn)一步研究。

此外,PGRN在胚胎發(fā)育早期分布于整個(gè)新皮層,在腦部主要由小膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞表達(dá)[11]。PGRN廣泛參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)、損傷修復(fù)、生長(zhǎng)發(fā)育等多項(xiàng)病理及生理活動(dòng)。在炎癥反應(yīng)中,PGRN可以促進(jìn)抗炎細(xì)胞因子IL-10、IL-1β等的分泌[12]。此外,PGRN與TNF呈拮抗關(guān)系,競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合TNF因子受體,拮抗TNF介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[13]。已發(fā)現(xiàn)PGRN缺失增強(qiáng)了神經(jīng)炎癥反應(yīng),在敲除PGRN后,隨著年齡增加,小鼠在18周齡時(shí)會(huì)出現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞被激活的現(xiàn)象[14]。

為了明確PGRN缺失對(duì)感染小鼠炎癥反應(yīng)的影響,本研究利用熒光定量PCR方法對(duì)小鼠的腦細(xì)胞因子進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明,當(dāng)敲除PGRN后,干擾素含量顯著升高,增強(qiáng)了對(duì)病毒的清除作用。當(dāng)PGRN缺失后,TNF-α的含量顯著升高,增強(qiáng)了促炎反應(yīng),加速了病毒的清除,而趨化因子表達(dá)量的降低,暗示敲除PGRN對(duì)免疫細(xì)胞的遷移產(chǎn)生了抑制作用,但是具體的作用機(jī)制尚不明確。

研究表明隨著小鼠年齡的增長(zhǎng),會(huì)引起RNA結(jié)合蛋白TDP-43的泛素化[15],而病理性TDP-43蛋白的沉積會(huì)導(dǎo)致認(rèn)知功能的下降[16]。PGRN缺失后會(huì)導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞變成病理性的狀態(tài),影響溶酶體功能,增強(qiáng)TDP-43蛋白的分泌[17]。在PHEV感染小鼠后,也會(huì)引起神經(jīng)退行性相關(guān)蛋白TDP-43表達(dá)顯著升高[6]。將PHEV感染PGRN缺失鼠,檢測(cè)腦內(nèi)TDP-43蛋白的表達(dá)量,結(jié)果發(fā)現(xiàn)與未缺失的接毒小鼠相比,TDP-43的表達(dá)量顯著升高,因此推測(cè)PHEV與PGRN兩者呈協(xié)同作用,增強(qiáng)TDP-43蛋白的聚集。

總之,本研究初步證實(shí)PGRN缺失能抑制體內(nèi)PHEV的復(fù)制,增強(qiáng)免疫反應(yīng),并影響病毒的致病性,研究結(jié)果為進(jìn)一步揭示PGRN在PHEV復(fù)制過(guò)程中的作用機(jī)制提供研究基礎(chǔ),并為抗β冠狀病毒藥物研究提供參考。