盧 挺,董偉韜,陳 艷,趙曉萱,劉佩雯,賀海健,張全偉,賀鈺烜,趙興緒*,張 勇 *

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,甘肅 蘭州 730070;2.甘肅省動(dòng)物生殖生理及繁殖調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅 蘭州730070;3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,甘肅 蘭州 730070)

奶牛乳腺上皮細(xì)胞(bovine mammary epithelial cells,MAC-T)是奶牛乳腺實(shí)質(zhì)的主要細(xì)胞,在哺乳期間,MAC-T產(chǎn)生酪蛋白、乳轉(zhuǎn)鐵蛋白、乳糖、甘油三酯和富含甘油三酯的脂滴等各種乳成分,然后通過頂膜,將每一種乳成分分泌到乳腺腺泡腔中[1-2]。MAC-T還是高度分化的免疫細(xì)胞,在受到外界刺激時(shí),通過Toll樣受體識(shí)別病原體的相關(guān)分子模式,產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng),被廣泛用于體外奶牛乳房炎模型的建立和體外泌乳研究[3]。奶牛乳腺炎是奶牛場(chǎng)最常見的疾病,由于患病奶牛的乳腺組織發(fā)生炎癥反應(yīng),導(dǎo)致病牛產(chǎn)奶量減少、牛奶質(zhì)量變差,每年都造成巨額的經(jīng)濟(jì)損失。牛奶中的脂類具有多種生物活性,對(duì)人類健康和食品的物理功能都有影響。脂質(zhì)除了基本的能量?jī)?chǔ)存和代謝作用外,還是啟動(dòng)、促進(jìn)和化解炎癥的信號(hào)分子[4]。HAYASHI等[5]通過液相色譜技術(shù),發(fā)現(xiàn)在患有乳房炎的奶牛所產(chǎn)的牛奶中,多不飽和脂肪酸的含量有一定的變化,其中ω-6多不飽和脂肪酸呈現(xiàn)升高趨勢(shì),ω-3多不飽和脂肪酸呈下降趨勢(shì),并且在不同的炎癥發(fā)展時(shí)期,所含的脂質(zhì)含量及種類各不相同。

花生四烯酸(arachidonic acid,AA)是一種20碳鏈的ω-6多不飽和脂肪酸,化學(xué)式為C20H32O2,通常呈發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)。AA在機(jī)體內(nèi)與細(xì)胞膜上的磷脂相結(jié)合,如磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺等,賦予細(xì)胞膜流動(dòng)性和靈活性[6]。炎癥的發(fā)生過程中,在幾種磷脂酶的作用下,AA從細(xì)胞膜上釋放出來。游離狀態(tài)的AA可以通過酶促(脂氧化酶、環(huán)氧化酶和細(xì)胞色素P450途徑)和非酶促(花生四烯酸乙醇胺途徑和自氧化反應(yīng))反應(yīng)途徑,產(chǎn)生前列腺素、白三烯、異前列腺素等一系列類二十烷酸,參與免疫、炎癥、氧化應(yīng)激反應(yīng)和損傷過程[7]。而細(xì)胞膜中的AA通過脫?；h(huán),使細(xì)胞中游離AA的濃度保持在很低的水平,并限制AA的氧化,使體內(nèi)AA保持在一個(gè)很低的水平,防止未酯化的AA不受控制的積累,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而損害細(xì)胞存活[8]。POMPEIA等[9]報(bào)告稱,AA的細(xì)胞毒性是不可否認(rèn)的,但很可能是它在體內(nèi)的基本功能之一。

脂質(zhì)組學(xué)技術(shù)能夠分析和鑒定脂質(zhì)分子及其互相作用的分子,進(jìn)而揭示多樣性脂質(zhì)分子代謝及其代謝調(diào)控,從而深入探索其與細(xì)胞、器官甚至機(jī)體的生理、病理過程之間的關(guān)系[10-11]。因此,本研究基于非靶向脂質(zhì)組學(xué)分析AA處理后MAC-T脂質(zhì)代謝圖譜的變化,識(shí)別AA改變的關(guān)鍵差異代謝物,以期為深入研究AA的生理作用和進(jìn)一步闡明AA影響MAC-T的泌乳及免疫功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器AA(Sigma);DMEM高糖培養(yǎng)基(HyClone);胎牛血清(Invigentech);甲醇、乙腈、甲基叔丁基醚、甲酸銨、二氯甲烷和異丙醇(CNW Technologies)。超凈工作臺(tái)、CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、Q Exactive Focus高分辨質(zhì)譜儀、離心機(jī)(Thermo);超高效液相儀(Agilent);研磨儀(上海凈信科技有限公司)和超聲儀(深圳方奧微電子有限公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及處理MAC-T購(gòu)自青旗(上海)生物技術(shù)發(fā)展有限公司。細(xì)胞在含15%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中,于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細(xì)胞融合到70%～80%時(shí)用于后續(xù)試驗(yàn)。使用0.1 mg/L AA刺激MAC-T細(xì)胞12 h,設(shè)為AA處理組,添加同等體積完全培養(yǎng)基組設(shè)為對(duì)照組。

1.3 樣品制備細(xì)胞脂質(zhì)代謝物的提取要求細(xì)胞量至少達(dá)到 1×107/mL 以上。將按1.2方法處理好的AA處理組和對(duì)照組細(xì)胞消化終止后離心,各收集3份。加入200 μL H2O,液氮中反復(fù)凍融1 min 3次。加入480 μL的甲基叔丁基醚-甲醇混合液(5∶1),-40℃ 靜置1 h后,4℃、6 000 r/min離心15 min。取上清300 μL于EP管中,真空干燥,用100 μL二氯甲烷-甲醇混合液(1∶1)復(fù)溶,4℃、13 000 r/min離心15 min,取上清-80℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩Ｋ袠悠妨砣?0 μL上清混合為質(zhì)控(QC)樣品。

1.4 非靶向脂質(zhì)組學(xué)分析UHPLC條件:采用Phenomen Kinetex C18色譜柱,流動(dòng)相A為乙腈-水(6∶4),10 mmol/L甲酸銨;B相為異丙醇-乙腈(9∶1),0.5 mmol/L甲酸銨水溶液。梯度洗脫程序?yàn)?0～1.0 min,40%B;1.0～12.0 min,40%～100%B;12.0～13.5 min,100%B;13.5～13.7 min,100%～40%B;13.7～18.0 min,40%B。在柱溫55℃、流速0.3 mL/min的條件下進(jìn)樣2 μL。MS條件:正、負(fù)離子模式噴霧電壓分別為5和 -4.5 kV;正、負(fù)離子模式的毛細(xì)管溫度分別為320和300℃;護(hù)套氣體流量為35 Arb;輔助氣體流量為10 Arb;全MS分辨率為 70 000;MS/MS 的分辨率為 17 500;NCE模式碰撞能量為15/30/45 eV。

1.5 數(shù)據(jù)分析用ProteoWizard將原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成.mzXML格式,用XCMS做保留時(shí)間校正、峰識(shí)別、峰提取和峰對(duì)齊等處理,于BiotreeDB(V2.1)自建二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行脂質(zhì)鑒定。使用 SIMCA-V 16.0.2 和SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,包括T檢驗(yàn)、變異倍數(shù)分析、主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)。P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 試驗(yàn)質(zhì)量控制將分析得到的QC樣本基峰色譜圖進(jìn)行譜圖重疊比較,可以看出樣本的色譜峰響應(yīng)強(qiáng)度和保留時(shí)間基本重疊,說明試驗(yàn)重復(fù)性好(圖1)。因此用于本試驗(yàn)儀器的穩(wěn)定性、試驗(yàn)的重復(fù)性、數(shù)據(jù)質(zhì)量的可靠性良好。

圖1 QC樣本在正離子(A)和負(fù)離子(B)模式下總離子流色譜圖

2.2 單變量統(tǒng)計(jì)分析單變量統(tǒng)計(jì)分析可以直觀地展示比較組中脂質(zhì)分子的整體差異表達(dá)倍數(shù)情況。圖2顯示了AA處理組細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞之間脂質(zhì)代謝物差異分析比較火山圖。如圖3所示,本項(xiàng)目在2種離子模式下共鑒定出1 145種脂質(zhì)分子,涉及6大類脂質(zhì),即甘油磷脂類、甘油脂類、鞘脂類、孕烯醇酮脂類、糖脂類和固醇脂類。

圖2 AA處理組、對(duì)照組在正離子(A)、負(fù)離子(B)模式下的差異脂質(zhì)比較分析的火山圖

圖3 脂質(zhì)分類圖

2.3 多元變量統(tǒng)計(jì)分析使用SIMCA軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換加中心化格式化處理,然后對(duì)所得的脂質(zhì)分子進(jìn)行PCA和OPLS-DA建模分析(圖4)。PCA(圖4 A、B)和OPLS-DA(圖4C、D)模型顯示,在正、負(fù)離子2種模式下,AA處理組與對(duì)照組的樣品點(diǎn)均有明顯分離,沒有重疊,并且樣本全部處于95%置信區(qū)間內(nèi),這表明AA處理后,MAC-T細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)代謝物發(fā)生顯著變化。隨后對(duì)OPLS-DA模型進(jìn)行200次置換檢測(cè)(圖4E、F),其中R2Y是相關(guān)系數(shù),表示模型的擬合效果,是1個(gè)定量的測(cè)量(范圍0～1),表示所建立的模型能在多大程度上代表真實(shí)的數(shù)據(jù);Q2表示OPLS-DA模型的預(yù)測(cè)能力,Q2越靠近0.50表示模型預(yù)測(cè)能力較好。由圖4E可見,正離子模式下R2Y和Q2分別為1.01和0.28,負(fù)離子模式下R2Y和Q2分別為0.99和0.49,這些參數(shù)表明OPLS-DA模型不存在過擬合現(xiàn)象,且具有良好的分離性能和可預(yù)測(cè)性,數(shù)據(jù)可靠。

A,C,E.正離子模式; B,D,F.負(fù)離子模式;A、B圖中橫坐標(biāo)PC[1]和縱坐標(biāo)PC[2]分別表示第一和第二主成分得分值;C、D圖中橫坐標(biāo)t[1]P表示預(yù)測(cè)主成分得分值,縱坐標(biāo)t[1]O表示正交主成分得分值;E、F圖中橫坐標(biāo)表示200次置換檢驗(yàn)的置換保留度,縱坐標(biāo)表示R2Y或Q2的取值,Intercepts表示R2Y和Q2回歸直線的截距

2.4 顯著性差異表達(dá)的脂質(zhì)分子篩選在正、負(fù)離子模式下,根據(jù)T檢驗(yàn)的P值小于0.05和OPLS-DA模型第一主成分的變量權(quán)重值(VIP)大于1,這2個(gè)指標(biāo)為卡值標(biāo)準(zhǔn),對(duì)檢測(cè)出的脂質(zhì)分子進(jìn)行進(jìn)一步的篩選,從1 145個(gè)脂質(zhì)中篩選出10個(gè)具有統(tǒng)計(jì)意義的顯著性差異脂質(zhì)分子,歸屬為4個(gè)脂類,7個(gè)亞類。其亞類分別為:酰基葡萄糖醛酸糖脂(acylglucuronosyldiacylglycerol,AcylGlcADG)、葡萄糖醛酸糖脂(glucuronosyldiacylglycerol,GlcADG)、單?；视?monoacylglycerol,MAG)、磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine,PC)、磷脂酰乙醇(phosphatidylethanol,PEtOH)、硫化己糖基神經(jīng)酰胺脂肪酸(sulfurHexosylceramide hydroxyfatty acid,SHexCer)和甘油三酯(triacylglycerol,TG)。由圖5可以看出,AA處理組與對(duì)照組相比較,AcylGlcADG(14:1/14:1/14:1)、GlcADG(18:2/22:2)、MAG(18:1)、PC(22:5/22:5)、PC(4:0/27:0)、PC(7:0/26:1)、PEtOH(16:0/16:1)、PEtOH(16:1/18:1)和TG(16:0/18:0/20:4)的相對(duì)表達(dá)量顯著降低;SHexCer(d35:2)的表達(dá)量顯著升高。

2.5 差異脂質(zhì)分子相關(guān)性分析進(jìn)行差異脂質(zhì)相關(guān)性分析有利于進(jìn)一步了解生物狀態(tài)變化過程中代謝物之間的相互調(diào)節(jié)關(guān)系,代謝物相關(guān)性往往揭示了代謝物之間變化的協(xié)同性:與某類代謝物變化趨勢(shì)相同,則為正相關(guān);與某類代謝物變化趨勢(shì)相反,則為負(fù)相關(guān)。采用pearson方法對(duì)差異脂質(zhì)的定量值進(jìn)行相關(guān)系數(shù)計(jì)算,2個(gè)變量之間的相關(guān)程度通過相關(guān)系數(shù)r來表示。相關(guān)系數(shù)r的值在-1～1之間,但可以是此范圍內(nèi)的任何值。正相關(guān)時(shí),r值在0～1之間;負(fù)相關(guān)時(shí),r值在-1～0之間。r的絕對(duì)值越接近1,兩變量的關(guān)聯(lián)程度越強(qiáng),r的絕對(duì)值越接近0,兩變量的關(guān)聯(lián)程度越弱。相關(guān)系數(shù)在0.6～1.0之間呈強(qiáng)相關(guān),0.4～0.6之間呈中等程度相關(guān),0.2～0.4之間呈弱相關(guān),0.0～0.2之間呈極弱相關(guān)或無相關(guān)。

處于同一代謝通路上的脂質(zhì)分子具有較強(qiáng)的相關(guān)性。在正離子模式下(圖6A),PC(7:0/26:1)和PC(4:0/27:0)、PC(22:5/22:5)、PEtOH(16:0/16:1)、TG(16:0/18:0/20:4)、MAG(18:1)相互之間呈強(qiáng)正相關(guān)性,且PC(7:0/26:1)和PC(22:5/22:5)、TG(16:0/18:0/20:4)、MAG(18:1)之間具有顯著性相關(guān)(P<0.05);PC(4:0/27:0)和PEtOH(16:0/16:1)具有顯著性相關(guān)(P<0.05);PC(22:5/22:5)和TG(16:0/18:0/20:4)、MAG(18:1)之間具有顯著性相關(guān)(P<0.05);TG(16:0/18:0/20:4)和MAG(18:1)之間具有顯著性相關(guān)(P<0.05)。在負(fù)離子模式下(圖6B),SHexCer(d35:2)和PEtOH(16:1/18:1)、GlcADG(18:2/22:2)之間呈強(qiáng)負(fù)相關(guān)性;與AcylGlcADG(14:1/14:1/14:1) 之間呈中等負(fù)相關(guān)性;AcylGlcADG(14:1/14:1/14:1)和PEtOH(16:1/18:1)、GlcADG(18:2/22:2)相互之間呈強(qiáng)正相關(guān)性,且具有顯著性相關(guān)(P<0.05)。

A.正離子模式;B.負(fù)離子模式。圖中橫縱坐標(biāo)代表該組對(duì)比的差異脂質(zhì),不同位置的色塊代表對(duì)應(yīng)位置脂質(zhì)間的相關(guān)系數(shù)大小,紅色表示正相關(guān),藍(lán)色表示負(fù)相關(guān),顏色越深代表相關(guān)性越強(qiáng)

3 討論

奶牛乳房炎是飼養(yǎng)牛的傳統(tǒng)傳染病,對(duì)動(dòng)物福利和經(jīng)濟(jì)問題都會(huì)造成嚴(yán)重的影響。由于預(yù)防和治療措施的高成本、牛奶產(chǎn)量較低以及早期淘汰,奶牛乳房炎是養(yǎng)牛業(yè)遭受經(jīng)濟(jì)損失的主要原因[12]。MAC-T在泌乳和乳腺免疫方面發(fā)揮著重要的作用,被廣泛用于體外奶牛乳房炎的研究[13-14]。

AA作為哺乳動(dòng)物必須脂肪酸之一,具有多種生物學(xué)功能。AA特殊的結(jié)構(gòu),使其天然的與細(xì)胞膜上的磷脂相結(jié)合,賦予膜柔韌性、流動(dòng)性和選擇性滲透性,尤其是神經(jīng)系統(tǒng)、骨骼肌和免疫系統(tǒng)功能所必需的[6,15]。AA可以通過酶促和非酶促反應(yīng)參與機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)和損傷過程,會(huì)產(chǎn)生負(fù)責(zé)解決炎癥和傷口愈合的介質(zhì)。AA還被證實(shí)具有治療曼氏血吸蟲和日本血吸蟲的潛力[16]。AA對(duì)膜流動(dòng)性的控制會(huì)影響參與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的特定膜蛋白的功能,并在維持細(xì)胞和細(xì)胞器完整性以及血管通透性方面發(fā)揮重要作用。AA對(duì)于動(dòng)物體的生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖性能具有一定的促進(jìn)作用,還可以提高動(dòng)物體的免疫力[17]。但是AA在機(jī)體內(nèi)的作用并不總是有益的,有報(bào)道稱,AA氧化產(chǎn)生的代謝物不會(huì)引發(fā)炎癥,但會(huì)促進(jìn)炎癥過程的發(fā)展,攝入過量的AA會(huì)增加心血管疾病的發(fā)生以及動(dòng)脈粥樣硬化的形成,且對(duì)一些細(xì)胞具有毒理作用[18]。AA誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死具有膜完整性迅速喪失、細(xì)胞體積增大、存在松散和凝聚的染色質(zhì)、嗜堿粒細(xì)胞減少和DNA完整性被破壞等特點(diǎn)[9]。本研究采用UHPLC-QE-MS系統(tǒng),對(duì)外源性AA處理的MAC-T進(jìn)行非靶向脂質(zhì)組學(xué)分析,共檢測(cè)出1 145種脂質(zhì)代謝物,發(fā)現(xiàn)外源性AA對(duì)MAC-T細(xì)胞中甘油磷脂類、甘油脂類和鞘脂類影響較大。

本研究中,甘油脂類差異脂質(zhì)MAG(18:1)和TG(16:0/18:0/20:4) 的含量顯著降低。甘油脂通常是指由甘油和脂肪酸(含飽和和不飽和脂肪酸)經(jīng)酯化所生成的脂類。甘油扮演貯存與輸送的角色,大部分存在于乳糜微粒及極低密度脂蛋白內(nèi)。研究表明TG是外源性AA的第1個(gè)受體庫(kù),隨后轉(zhuǎn)移到其他磷脂庫(kù)中。在細(xì)胞活化過程中,AA從磷脂中釋放,然而,其中大量的AA會(huì)被迅速重新整合到TG庫(kù)中儲(chǔ)存,只有少量的AA參與下一步的代謝過程。一旦磷脂庫(kù)在細(xì)胞激活過程中耗盡,TG庫(kù)也會(huì)向磷脂庫(kù)提供AA[19]。細(xì)胞中游離AA水平由2個(gè)競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)控制,一方面,磷脂酶A2介導(dǎo)的磷脂sn-2位置的切割產(chǎn)生游離脂肪酸;另一方面,CoA依賴性?；D(zhuǎn)移酶調(diào)節(jié)的酰化反應(yīng)將游離脂肪酸重新?lián)饺肓字?。在未刺激?xì)胞中,再?；磻?yīng)在磷脂酶A2介導(dǎo)的脫?；襟E中占主導(dǎo)地位,因此游離AA保持在非常低的水平[20]。而當(dāng)游離狀態(tài)的AA增加時(shí),AA的釋放速率明顯小于重新結(jié)合到TG庫(kù)和磷脂庫(kù)中的速率,導(dǎo)致細(xì)胞中TG含量降低,進(jìn)而影響TG代謝為二酰甘油,使得二酰甘油向磷脂代謝轉(zhuǎn)化率降低[21-22]。這或許是本試驗(yàn)中磷脂PC(22:5/22:5)、PC(4:0/27:0)、PC(7:0/26:1)、PEtOH(16:0/16:1)和PEtOH(16:1/18:1)含量顯著降低的原因之一。本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)了糖脂類差異脂質(zhì)AcylGlcADG(14:1/14:1/14:1)和GlcADG(18:2/22:2)的含量顯著降低;鞘脂類差異脂質(zhì)SHexCer(d35:2)的含量顯著升高,鞘脂及其代謝產(chǎn)物如神經(jīng)酰胺和磷酸膽堿,還參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、衰老和細(xì)胞程序性死亡等許多重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[23]。綜上所述,外源性AA可使MAC-T細(xì)胞脂類代謝發(fā)生變化,主要影響甘油脂類和鞘脂類代謝過程,這些差異表達(dá)的脂質(zhì)分子可能成為奶牛乳房炎發(fā)展過程中的相關(guān)脂類干預(yù)靶點(diǎn)。