張暖暖,寧夏青,艾麗平,孫 晨,張士霞

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院,河北 保定 071000)

自1987年法國首次在電視腹腔鏡下成功完成了世界首例膽囊切除術(shù)以來[1],隨著實驗設(shè)備的迅速發(fā)展以及腹腔鏡手術(shù)具有對機體損傷小、術(shù)后恢復(fù)快和傷口美觀的優(yōu)點,其在獸醫(yī)臨床上的應(yīng)用逐步普及起來。腹腔鏡手術(shù)中常用到的氣體為CO2,CO2氣體充入腹腔使腹內(nèi)壓升高,保持一定壓力在封閉的腹腔內(nèi)造成一種類似腹腔室隔綜合征的現(xiàn)象,其對臟器的影響不容忽視。小腸微循環(huán)是末梢循環(huán),對神經(jīng)-體液調(diào)節(jié)極其敏感,CO2氣腹引起腹內(nèi)壓的升高可使小腸黏膜的血流量減少,而氣腹解除后小腸黏膜的灌注及供氧增加,引起小腸黏膜缺血再灌注。研究發(fā)現(xiàn),CO2氣腹引起的腸道損傷可能與炎癥反應(yīng)[2]和氧化應(yīng)激引起的腸黏膜屏障功能損傷有關(guān)[3]。右美托咪定(dexmedetomidine,DEX)是臨床麻醉中常用的一種藥物,近年來研究顯示,DEX在一定程度上可以減少各臟器的缺血再灌注損傷,對各臟器有顯著的保護作用[4]。大量試驗表明DEX可從緩解氧化應(yīng)激、抑制炎性反應(yīng)、減少細(xì)胞凋亡等多方面減少臟器損傷,但其對腹腔鏡氣腹所致腸損傷的預(yù)防保護機制還不是很清楚。因此,本研究旨在探討DEX預(yù)處理對腹腔鏡所致腸損傷的保護作用,并從氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)探討其作用機制,為減輕獸醫(yī)臨床上腹腔鏡手術(shù)引發(fā)的機體損傷提供新的干預(yù)方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑Sprang-Dawley(SD)大鼠購自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司;鹽酸右美托咪定由上海源葉生物技術(shù)有限公司提供;總蛋白定量測定試劑盒、丙二醛(MDA)、髓過氧化物酶(MPO)、谷胱甘肽(GSH)檢測試劑盒由南京建成生物工程研究所提供;大鼠白細(xì)胞介素-6(IL-6)、大鼠白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA試劑盒由北京冬歌博業(yè)生物技術(shù)有限公司提供;TransZol Up Plus RNA Kit由北京全式金生物技術(shù)股份有限公司提供;PrieScript RT Master Mix試劑盒、TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒由寶生物工程(大連)有限公司提供;β-actin一抗、HO-1一抗、Nrf2一抗、IKBα一抗、NF-κB一抗由沈陽萬類生物科技有限公司提供,辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供;其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 分組與處理8周齡250～300 g SD大鼠,飼喂標(biāo)準(zhǔn)化大鼠鼠糧,飲水不限,飼養(yǎng)環(huán)境溫度、濕度穩(wěn)定。18只大鼠隨機平均分為3組:假手術(shù)組(Sham)、CO2氣腹組(CO2)、DEX預(yù)處理組(DEX)。CO2和DEX組氣腹前30 min大鼠腹腔分別注射生理鹽水(1 mL/kg)和DEX(50 μg/kg),氣腹時對大鼠進行呼吸麻醉,待大鼠完全麻醉后將氣腹針刺入大鼠腹腔后在2 kPa(15 mmHg)壓力下維持90 min;Sham組除不給予腹腔壓力外,其余操作同CO2組。氣腹結(jié)束后6 h將大鼠在玻璃罩中呼吸麻醉后,處死大鼠并取回盲瓣以上2 cm處的回腸組織,一部分放入10%甲醛固定液中,用于病理切片制作;其余部分置于-80℃超低溫冰箱用于后續(xù)試驗的檢測。

1.3 小腸組織病理形態(tài)學(xué)觀察小腸組織于10%甲醛固定液中固定48 h后取出修剪成合適大小,流水沖洗24 h后,依次放入70%,80%,90%,95%,100%酒精中適當(dāng)時間進行脫水,依次經(jīng)過二甲苯透明、浸蠟、包埋處理、切片,HE染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察小腸組織形態(tài)并拍照評估損傷程度。

1.4 小腸氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測取-80℃超低溫冰箱凍存的小腸組織0.1 g,按照1∶9的比例加入900 μL生理鹽水后在勻漿機中制備10%的組織勻漿,4℃、2 500 r/min離心10 min,取上清,采用BCA法測定勻漿蛋白濃度,嚴(yán)格按照試劑盒注意事項和步驟測定小腸組織中MDA、GSH的含量變化。

1.5 小腸炎癥水平檢測小腸組織中炎癥因子IL-6、IL-1β和TNF-α水平用ELISA試劑盒雙抗夾心法進行檢測。具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行。同1.4測定大鼠小腸勻漿中蛋白濃度后,按照試劑盒說明檢測MPO的活力。

1.6 小腸緊密連接蛋白相關(guān)基因 mRNA的檢測采用實時熒光定量法測定緊密連接基因ZO-1、Occludin和Claudin-1的mRNA的相對表達。按照TransZol Up Plus RNA Kit試劑盒說明書提取小腸組織總RNA。按照PrieScript RT Master Mix試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照TB GreenRPremix Ex TaqTMⅡ試劑盒說明用LightCyclerR96儀器進行實時熒光定量PCR。擴增條件:95℃ 30 s預(yù)變性;95℃ 5 s變性,60℃ 30 s退火延伸,40個循環(huán)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計并合成(表1)。采用2-△△Ct方法分析相關(guān)mRNA的相對表達量。

表1 基因序列

1.7 小腸組織相關(guān)蛋白表達的檢測采用Western blot檢測小腸組織HO-1、Nrf2、IKBα和NF-κB蛋白的相對表達量。取小腸組織100 mg加入900 μL RIPA裂解液提取組織蛋白,BCA法檢測蛋白濃度并調(diào)節(jié)蛋白濃度為一致后,水浴10 min使蛋白變性。選擇合適濃度的SDS-PAGE膠電泳分離蛋白,電泳結(jié)束電轉(zhuǎn)至NC膜,37℃封閉1 h,β-actin(1∶500)、HO-1(1∶500)、Nrf2(1∶500)、IKBα(1∶500)、NF-κB(1∶500)孵育一抗并4℃過夜,洗膜后按1∶6 000孵育二抗,再次洗膜后用ECL發(fā)光液進行化學(xué)發(fā)光,最后用Image J軟件掃灰度值并數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 大鼠小腸病理學(xué)形態(tài)觀察結(jié)果小腸光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果顯示,Sham組(圖1A)小腸上皮細(xì)胞形態(tài)正常,腸絨毛排列緊密有規(guī)則;CO2組(圖1B)腸黏膜上皮細(xì)胞完整性被破壞,組織結(jié)構(gòu)紊亂,腺體受損,腸絨毛嚴(yán)重變形界限模糊且伴有炎性細(xì)胞浸潤現(xiàn)象; DEX組(圖1C)小腸上皮細(xì)胞少量腺體受損,腸絨毛排列雜亂僅部分脫落,整體損傷程度較CO2組有所緩解。

A.Sham組;B.CO2組;C.DEX組

2.2 小腸氧化應(yīng)激指標(biāo)水平變化小腸氧化應(yīng)激指標(biāo)測定結(jié)果顯示,與Sham組相比,CO2組MDA含量極顯著升高(P<0.01),DEX組MDA含量顯著升高(P<0.05);與CO2組相比,DEX組MDA含量極顯著下降(P<0.01)(圖2A)。與Sham組相比,CO2和DEX組GSH含量極顯著降低(P<0.01);與CO2組相比,DEX組GSH含量極顯著升高(P<0.01)(圖2B)。

A.大鼠小腸組織中MDA含量;B.大鼠小腸組織中GSH含量

2.3 小腸炎癥因子水平變化小腸炎癥水平測定結(jié)果顯示,與Sham組相比,CO2組小腸組織中IL-6、IL-1β、TNF-α水平和MPO活力均極顯著升高(P<0.01),DEX組IL-6水平顯著升高(P<0.05),IL-1β、TNF-α水平和MPO活力均極顯著升高(P<0.01);與CO2組相比,DEX組IL-6、IL-1β、TNF-α水平和MPO活力均極顯著降低(P<0.01)(圖3)。

A.小腸組織IL-6水平;B.小腸組織IL-1β水平;C.小腸組織TNF-α水平;D.小腸組織MPO活力

2.4 小腸緊密連接蛋白相關(guān)基因的變化小腸緊密連接蛋白相關(guān)基因mRNA測定結(jié)果顯示,與Sham組相比,CO2和DEX組小腸組織ZO-1、Occludin、Claudin-1的mRNA相對表達量均極顯著降低(P<0.01);與CO2組相比,DEX組ZO-1、Occludin、Claudin-1的mRNA相對表達量均極顯著升高(P<0.01)(圖4)。

A.小腸組織ZO-1 mRNA的表達;B.小腸組織Claudin-1 mRNA的表達;C.小腸組織Occludin mRNA的表達

2.5 小腸相關(guān)蛋白相對表達量的變化Western blot結(jié)果表明,與Sham組相比,CO2組小腸組織HO-1、Nrf2、IKBα和NF-κB蛋白表達量均極顯著升高(P<0.01),DEX組HO-1、Nrf2蛋白表達量極顯著升高(P<0.01),IKBα蛋白表達量極顯著升高(P<0.01),NF-κB蛋白表達量顯著升高(P<0.05);與CO2組相比,DEX組HO-1、Nrf2蛋白表達量進一步極顯著升高(P<0.01),IKBα蛋白表達量極顯著降低(P<0.01),NF-κB蛋白表達量顯著降低(P<0.05)(圖5)。

3 討論

腸黏膜屏障由機械屏障、生物屏障、化學(xué)屏障和免疫屏障組成,是一個極其復(fù)雜的體系,能夠保護機體免受外來細(xì)菌毒素的入侵。其中腸黏膜機械屏障也稱為物理屏障,作為腸道的第一道防線,在維持腸道正常生理功能中發(fā)揮著不可或缺的作用。有研究發(fā)現(xiàn),CO2氣腹可導(dǎo)致腸黏膜屏障受損,發(fā)生細(xì)菌易位,繼而導(dǎo)致其他遠隔器官受損。腸上皮細(xì)胞及其緊密連接是腸黏膜機械屏障的主要組成部分。ZO-1、Claudin-1和Occludin是胃腸道中緊密連接的3個關(guān)鍵蛋白[5],成為了近年來腸黏膜屏障的研究熱點,并發(fā)現(xiàn)其在腸道中很多至關(guān)重要的作用。本試驗顯示CO2氣腹可導(dǎo)致小腸上皮細(xì)胞完整性被破壞,且有炎性細(xì)胞浸潤現(xiàn)象,小腸緊密連接蛋白 ZO-1、Claudin-1和Occludin mRNA的相對表達量極顯著降低,而DEX預(yù)處理后的mRNA的相對表達量均顯著回升,該結(jié)果說明CO2氣腹破環(huán)了小腸機械屏障,且DEX預(yù)處理可有效調(diào)節(jié)小腸上皮柱狀細(xì)胞的規(guī)則排列,使上皮細(xì)胞緊密連接蛋白的正常表達,達到保護小腸發(fā)揮其正常生理功能的效果。

腸黏膜機械屏障功能導(dǎo)致?lián)p傷可引起腸道有害細(xì)菌和內(nèi)毒素入侵并引起機體一系列的病理反應(yīng),如機體氧化應(yīng)激以及其他病理狀態(tài)等。Nrf2作為一種重要的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激調(diào)控因子,可誘導(dǎo)其下游調(diào)控基因血紅素加氧酶-1(HO-1)等抗氧化酶的表達增加[6],此誘導(dǎo)表達近年來被認(rèn)為是細(xì)胞內(nèi)最重要的抗氧應(yīng)激化機制之一[7],Nrf2和HO-1的表達變化可引起其下游氧化應(yīng)激指標(biāo)ROS、SOD、MDA等的表達變化[8]。MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物,常作為衡量組織氧化應(yīng)激損傷程度的指標(biāo)之一[9]。HO-1是Nrf2的靶基因,能夠誘導(dǎo)血紅素以及活性氧(ROS)還原而抑制氧化應(yīng)激。大量試驗表明[10-13],腹腔鏡氣腹過程中會引起機體的氧化應(yīng)激反應(yīng)并產(chǎn)生大量的ROS,激活氧自由基和抗氧化物信號。而谷胱甘肽(GSH)在腸道內(nèi)含量豐富,是小腸抗氧化系統(tǒng)的關(guān)鍵還原劑[14],腸道的抗氧化能力可由其含量變化直接反應(yīng)。與張蕾等[15]、張建濤等[13]研究結(jié)果一致,本試驗結(jié)果顯示,CO2組小腸組織中Nrf2和HO-1蛋白表達極顯著升高,表明腹腔鏡氣腹引起了大鼠小腸的抗氧化應(yīng)激反應(yīng),使MDA含量升高、GSH含量降低,引起大鼠小腸嚴(yán)重的氧化應(yīng)激,DEX預(yù)處理后小腸組織中Nrf2和HO-1蛋白表達進一步升高,MDA含量降低、GSH含量回升,小腸氧化應(yīng)激損傷得到明顯改善,說明CO2氣腹可激活Nrf2/HO-1通路,DEX可通過減輕小腸氧化應(yīng)激從而達到保護機體的作用。

此外,HO-1能夠抑制NF-κB 表達與活化,從而間接抑制機體炎癥反應(yīng)[16]。NF-κB作為重要的基因轉(zhuǎn)錄因子之一,隨著其結(jié)構(gòu)和功能的研究不斷深入,發(fā)現(xiàn)NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活是引發(fā)腸道炎癥的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[17]。氣腹引起的缺血再灌注過程可導(dǎo)致組織內(nèi)皮細(xì)胞損傷[18],并會誘發(fā)一系列的炎癥級聯(lián)反應(yīng),進一步刺激趨化因子和炎癥介質(zhì)的分泌[19]。NF-κB通路中的3個關(guān)鍵因子為IKKβ、IKBα和NF-κB。NF-κB未被激活時與IkB相結(jié)合形成三聚體位于細(xì)胞質(zhì)中,在某些刺激因素作用下NF-κB與IkB解離,導(dǎo)致NF-κB的過度激活,被激活后可調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄,進而促進各種炎癥因子的產(chǎn)生,如TNF-α、白細(xì)胞介素(interleukin,IL)系列、急性期反應(yīng)蛋白等[20]。王杏等[21]的研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)細(xì)胞受到刺激時可激活I(lǐng)KKβ,經(jīng)一系列反應(yīng)導(dǎo)致IKBα泛素化,NF-κB游離,細(xì)胞核內(nèi)NF-κB增多,啟動下游炎癥反應(yīng)和下游通路。很多研究表明,NF-κB均參與到缺血再灌注引起的機體損傷中[13,22]。因此,氣腹引起的機體炎性反應(yīng)不可忽視。MPO作為中性粒細(xì)胞的激活標(biāo)志和功能標(biāo)志,其活性變化可反映嗜中性多形核白細(xì)胞(PMN)的功能和活性狀態(tài)。研究顯示,MPO的活性與中性粒細(xì)胞計數(shù)之間存在極顯著相關(guān)性,可間接反應(yīng)組織的局部炎癥和損傷程度[23]。王永東等[24]、陳亞萍等[25]的研究發(fā)現(xiàn)DEX均可通過抑制炎性反應(yīng)達到保護腸黏膜的作用。本試驗顯示CO2組腸組織IKBα和NF-κB蛋白表達升高,IL-6、IL-1β、TNF-α水平和MPO活力均升高,DEX預(yù)處理后分別不同程度上減輕以上因子的表達,提示DEX可能通過NF-κB信號通路減緩氣腹導(dǎo)致的腸炎性損傷。

綜上所述,CO2氣腹能引起小腸發(fā)生氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)進而引起小腸黏膜機械屏障損傷,DEX能通過降低機體氧化應(yīng)激、減輕炎癥因子的釋放、改變緊密連接蛋白基因的表達等途徑緩解氣腹對機體的損傷,其減輕損傷的機制可能與NK-κB信號通路及Nrf2/HO-1通路有關(guān)。