羅怡茜,李亞均,何凱鋒,張芝金,郭靈君,張德志,,李前勇,*

(1.西南大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,重慶 榮昌 402460;2.重慶市獸醫(yī)科學(xué)工程研究中心,重慶 榮昌 402460)

酒糟是玉米、小麥、高粱等谷物釀造后的殘?jiān)?是乙醇工業(yè)的一種副產(chǎn)物,營養(yǎng)價(jià)值十分豐富,蛋白質(zhì)、能量、磷和脂肪等物質(zhì)含量高[1-2],且因其產(chǎn)量巨大和價(jià)格低廉,無論在國內(nèi)還是國外,都廣泛被應(yīng)用于各種動(dòng)物養(yǎng)殖中[2-5]。用酒糟作為飼料添加物,常見添加量在10%～80%不等。研究表明,飼喂羔羊時(shí),在日糧中添加DM 60%的干酒糟可溶物而不會(huì)影響干物質(zhì)采食量,且20%為最佳添加量[6]。MANTHEY等[7]的試驗(yàn)表明,在限量飼喂日糧中加入50%的干酒糟代替草料可以保持小母牛的生長性能。多項(xiàng)研究表明,在飼草中加入適量的酒糟不影響甚至提高動(dòng)物的生長性能[8-11]。一些養(yǎng)殖者飼喂牛、羊時(shí),其酒糟在飼料中的比例經(jīng)常達(dá)到50%～70%,個(gè)別甚至超過80%,加之飼喂時(shí)間過長,牛、羊容易發(fā)生酒糟中毒。目前關(guān)于動(dòng)物酒糟中毒的報(bào)道只有關(guān)于其病因、癥狀、病理變化、防治方法等方面,其酒糟中毒的機(jī)理尚不清楚。

腎臟是機(jī)體重要的代謝器官,研究表明,動(dòng)物發(fā)生酒糟中毒時(shí),其腎臟會(huì)腫脹變性、質(zhì)地變脆[12-13],因此,腎臟是鑒定動(dòng)物酒糟中毒相關(guān)候選基因的重要器官。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序是確定關(guān)鍵基因功能的重要手段。近期,轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)發(fā)展迅速而且被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物研究。本研究用榮昌本地山羊?yàn)槟Ｐ蛣?dòng)物,對(duì)照組按照《肉羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T816-2004)推薦的山羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)飼喂,試驗(yàn)組用酒糟代替日糧中75%蛋白質(zhì)和能量成分,試驗(yàn)期為90 d。分別用生化法、ELISA法、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序檢測(cè)山羊腎臟氧化指標(biāo)、炎性指標(biāo)、轉(zhuǎn)錄譜的變化,以探討高劑量酒糟飼喂對(duì)山羊腎損傷的機(jī)制,以期為動(dòng)物酒糟中毒的預(yù)防和治療提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)試劑RNAiso PlusAL61152A、TB Green?Premix Ex TaqTMⅠ IIAL92617A 、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA EraserAL21113A、RNAfreed-H2OAKG1198A 購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司;Goat 白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)試劑盒BPE93040、Goat 白細(xì)胞介素-6(IL-6)試劑盒BPE93046、Goat 腫瘤壞死因子α(TNF-α)試劑盒BPE93092購自上海朗頓生物科技有限公司;谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)測(cè)試盒A005、過氧化氫酶(CAT)測(cè)定試劑盒A007-1、黃嘌呤氧化酶(XOD)測(cè)定試劑盒A002、總超氧化物歧化酶(T-SOD)測(cè)試盒A001-1、總抗氧化能力(T-AOC)檢測(cè)試劑盒A015-2、總蛋白(TP)測(cè)定試劑盒A045-2-2購自南京建成生物工程研究所。

1.2 試驗(yàn)儀器Real-Time PCR擴(kuò)增儀,購自美國Thermo SCIENTFIC公司;全自動(dòng)雪花制冰機(jī)IMS-20,購自常熟市雪科電器有限公司;冷凍離心機(jī),購自賽默飛世爾科技公司;Bio-RAD S1000TM96 PCR,購自美國Bio-RAD公司;恒溫培養(yǎng)箱 HPX-9082MBE,購自上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;Elixir/Rios純水儀,購自上海攬寶儀器設(shè)備有限公司;Infinite 200 Pro酶標(biāo)儀,購自德國Tecan公司;分析天平AB104-N,購自梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及樣品采集在重慶榮昌某山羊養(yǎng)殖場(chǎng)選取體質(zhì)量相近(14.16±1.30) kg、健康的本地山羊。隨機(jī)分為2組,每組3只。對(duì)照組按《肉羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T816-2004)推薦的山羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)飼喂;試驗(yàn)組用酒糟代替日糧中75%蛋白質(zhì)和能量成分,試驗(yàn)日糧組成見表1。90 d后,將羊頸動(dòng)脈放血致死后取下腎臟,一部分用生理鹽水沖洗,另一部分用無水乙醇沖洗,分裝后放入液氮1 h后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 試驗(yàn)日糧組成及營養(yǎng)水平 %

1.4 腎臟組織炎性因子的檢測(cè)將腎臟組織從冰箱取出后,按ELISA試劑盒說明書進(jìn)行IL-6、IL-1β、TNF-α含量的檢測(cè)。

1.5 腎臟組織氧化指標(biāo)的檢測(cè)將腎臟組織從冰箱取出后,按試劑盒說明書進(jìn)行T-SOD、CAT、GSH-Px、XOD、T-AOC含量的檢測(cè)。

1.6 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

1.6.1測(cè)序 將腎臟組織放入預(yù)冷的研缽中研磨成粉末,總RNA采用TRIzol(北京天根生化有限公司)方法提取。在1%瓊脂糖凝膠上檢測(cè)RNA降解和污染。RNA用Agilent 2100 Bioanalyzer(美國安捷倫技術(shù)公司,CA,美國)定量,用NanoDrop分光光度計(jì)(美國IMPLEN公司,CA,美國)評(píng)估質(zhì)量和完整性。樣品檢測(cè)合格后,各取1.5 μg的 RNA用于建庫測(cè)序。測(cè)序庫的構(gòu)建采用Illumina公司(Illumina,San Diego,USA)配套試劑盒。利用Oligo(dT)磁珠富集mRNA,加入裂解緩沖液將mRNA裂解成短片段。利用隨機(jī)六聚體合成第一鏈cDNA,利用緩沖液、dNTPs和DNA聚合酶I合成第二鏈cDNA。為了優(yōu)選200～250 bp長度的cDNA片段,用AMPure XP系統(tǒng)純化文庫片段。純化后,對(duì)雙鏈cDNA進(jìn)行末端修復(fù),加入A,加入連接器。采用PCR擴(kuò)增技術(shù)構(gòu)建cDNA文庫。利用Agilent Bioanalyzer 2100系統(tǒng)對(duì)文庫質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)。由北京Allwegene科技有限公司(北京,中國)在Illumina Hiseq 4000平臺(tái)上對(duì)文庫進(jìn)行測(cè)序,生成配對(duì)端150 bp的reads。

1.6.2測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控 測(cè)序后,用內(nèi)部perl腳本和Trimmomatic(v0.33)處理原始數(shù)據(jù)。去除有測(cè)序接頭(adapter)的reads、不確定堿基含量比例大于10%的reads和低質(zhì)量堿基(Q≤20)含量大于50%的reads。將質(zhì)控后的clean reads用STAR映射到山羊(capra-hircus)的參考基因組,“mismatch”參數(shù)通常設(shè)置為2,其他參數(shù)默認(rèn)設(shè)置。

1.6.3差異表達(dá)基因分析 使用DESeq對(duì)讀計(jì)數(shù)的深度進(jìn)行了修改,用負(fù)二項(xiàng)分布法計(jì)算P值,采用Benjamini和Hochberg法控制FDR(錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率)。當(dāng)1個(gè)基因P<0.05時(shí)為差異基因。在差異基因中,如果基因的log2 Foldchange>0,則認(rèn)為該差異基因是上調(diào),反之,若log2 Foldchange<0,認(rèn)為該差異基因是下調(diào)。

1.6.4差異表達(dá)基因富集分析 用GOseq R包分析DEGS的基因本體富集分析,使用KOBAS (v2.0)軟件檢測(cè)差異表達(dá)基因在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的富集KEGG通路。

1.6.5熒光PCR驗(yàn)證 為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果,以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參基因,隨機(jī)選取了ATP6、ND4、ND6、COX2、CYTB這5個(gè)基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量 PCR反應(yīng),采用2-ΔΔCT方法計(jì)算基因mRNA在組織中的表達(dá)量。在NCBI網(wǎng)站上查找相關(guān)基因序列送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計(jì)并合成引物(表2)。

表2 RT-qPCR引物序列信息

2 結(jié)果

2.1 高劑量酒糟飼喂對(duì)山羊腎臟組織氧化指標(biāo)的影響試驗(yàn)組與對(duì)照組各氧化指標(biāo)結(jié)果見圖1。與對(duì)照組相比,試驗(yàn)組XOD水平顯著低于對(duì)照組(P<0.05),CAT和GSH-Px水平差異不顯著,T-SOD和T-AOC水平極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)。

2.2 75%酒糟飼喂對(duì)山羊腎臟組織炎癥因子的影響試驗(yàn)組與對(duì)照組各炎癥因子結(jié)果見圖2。與對(duì)照組相比,試驗(yàn)組各炎癥因子均表現(xiàn)出顯著性差異(P<0.05),其中試驗(yàn)組IL-1β水平極顯著高于對(duì)照組(P<0.01),IL-6、TNF-α水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

A.GSH-Px、T-SOD表達(dá)水平;B.XOD、CAT表達(dá)水平;C.T-AOC表達(dá)水平。*.P<0.05;**.P<0.01。下同

A.IL-1β表達(dá)水平;B.IL-6、TNF-α表達(dá)水平

2.3 測(cè)序數(shù)據(jù)結(jié)果分析測(cè)序結(jié)果如表3所示,在對(duì)山羊腎臟的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)測(cè)序和質(zhì)控后,得到了227 811 050條原始序列和215 653 142條有效序列。堿基平均錯(cuò)誤率是0.03%,Q20、Q30分別超過97.00%,93.00%,GC含量所占比例為42.78%～48.14%。超過95.00%的有效序列被映射到山羊參考基因上,表明測(cè)序數(shù)據(jù)適合后續(xù)分析。

表3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量檢測(cè)分析

2.4 差異表達(dá)基因(DEGs)篩選得到的差異基因結(jié)果如圖3所示,本次試驗(yàn)中,共得到了546個(gè)差異基因,與對(duì)照組相比,試驗(yàn)組共獲得385個(gè)上調(diào)基因和161個(gè)下調(diào)基因。圖4為差異基因聚類分析結(jié)果,表明試驗(yàn)組(Shen-gjl)的整體基因表達(dá)譜與對(duì)照組(Shen-dz)相比差異較大。

圖3 差異表達(dá)基因分布趨勢(shì)的火山圖

圖4 差異基因的層次聚類的熱圖

2.5 GO 和 KEGG 通路富集GO數(shù)據(jù)庫總共有3大類,分別是生物學(xué)過程(biological process,BP)、細(xì)胞成分(cellular component,CC)和分子功能(molecular function,MF),本試驗(yàn)差異表達(dá)基因在3大類中的GO類別上均出現(xiàn)富集。前30條顯著富集到的GO條目如圖5所示,在生物過程中,富集的主要類別是電子傳遞鏈(electron transport chain)和呼吸電子傳遞鏈(respiratory electron transport chain);在分子功能中,主要類別是轉(zhuǎn)運(yùn)活性(transporter activity)和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性(transmembrane transporter activity);在細(xì)胞成分中,主要類別是膜的整體組成(integral component of membrane)和膜的固有成分(intrinsic component of membrane)。

圖5 差異表達(dá)基因富集分析中前30個(gè)GO條目

根據(jù)KEGG功能注釋,共確定了19條顯著富集的通路(P<0.05)(圖6),在試驗(yàn)組和對(duì)照組的比較中,鑒定出的差異表達(dá)基因主要富集在生熱作用(thermogenesis)、帕金森病 (Parkinson disease)、氧化磷酸化(oxidative phosphorylation)等通路中。

圖6 差異表達(dá)基因的KEGG富集分析

2.6 使用 qRT-PCR 驗(yàn)證 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果準(zhǔn)確性,挑選5個(gè)顯著表達(dá)的差異基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證,結(jié)果如圖7所示,與對(duì)照組相比,試驗(yàn)組所有基因表達(dá)均極顯著上調(diào)(P<0.01),這與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的趨勢(shì)一致,說明測(cè)序結(jié)果可靠。

A.ND6 mRNA相對(duì)表達(dá)量;B.ND4 mRNA相對(duì)表達(dá)量;C.ATP6、COX2、CYTB mRNA相對(duì)表達(dá)量

3 討論

作為一種常用的飼料添加物,酒糟在牛、羊養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用,據(jù)報(bào)道,2019年我國約生產(chǎn)各類酒糟總計(jì)2 518.85 t[14],酒糟中粗蛋白、粗脂肪、粗纖維和磷含量分別為27.9%,10.8%,7.4%和0.8%,其粗蛋白含量是玉米的2.68倍;粗脂肪是玉米的3.00倍,是豆粕的5.68倍,是菜粕的7.70倍;粗纖維是玉米的3.20倍,是豆粕的1.20倍[15]。但過量添加可以造成牛羊發(fā)生中毒,其致病和損傷的機(jī)制還不清楚。本研究為探索高劑量酒糟飼喂對(duì)山羊腎損傷的機(jī)制,用ELISA法、生化法檢測(cè)山羊腎臟氧化指標(biāo)、炎性因子的變化,然后用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序篩選與其相關(guān)的差異表達(dá)基因與通路,進(jìn)而研究高劑量酒糟飼喂對(duì)山羊腎損傷的機(jī)制。

氧化應(yīng)激是由于氧化劑生成異常增加導(dǎo)致內(nèi)源性抗氧化劑相對(duì)不足而引起的消耗性代謝失調(diào),最終導(dǎo)致重要細(xì)胞成分發(fā)生氧化損傷[16]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,氧化應(yīng)激能導(dǎo)致腎臟發(fā)生多種疾病,如糖尿病、慢性腎衰竭、腎癌等[17-19]。機(jī)體自身的抗氧化防御體系,能切斷脂質(zhì)鏈?zhǔn)椒磻?yīng),避免自由基產(chǎn)生過剩,維持機(jī)體氧化穩(wěn)定,減少細(xì)胞氧化損傷。SOD、CAT、GSH-Px、銅藍(lán)蛋白、維生素和尿酸等都是機(jī)體抗氧化防御體系的組成部分[20-21]。XOD是體內(nèi)核酸代謝中的重要酶,它可以催化體內(nèi)嘌呤化合物的氧化,最后形成尿酸,從而產(chǎn)生大量的自由基,導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞和功能障礙[22-23];SOD將超氧化物陰離子轉(zhuǎn)化為相對(duì)穩(wěn)定的H2O2;CAT將H2O2還原為H2O;GSH-Px 通過防止過氧化氫氧化而起到防止細(xì)胞氧化損傷的重要作用[24],三者能有效清除體內(nèi)過多的自由基[25-26];T-AOC是衡量機(jī)體抗氧化能力綜合指標(biāo),其反映了非酶抗氧化防御系統(tǒng)的活性和抗氧化酶的水平[27]。KONG等[28]的研究表明草魚(Ctenopharyngodonidellus) 肝臟T-SOD隨干酒糟可溶物的添加量的增加呈下降趨勢(shì)(P<0.05)。研究發(fā)現(xiàn),連續(xù)給大鼠灌胃8周乙醇,大鼠睪丸中黃嘌呤氧化酶(XO)活性降低[29]。李華磊等[30]研究表明在肉雞飼糧中添加15%玉米干酒糟及其可溶物會(huì)降低肉雞血清中T-AOC活性,本試驗(yàn)結(jié)果與其一致,也與本試驗(yàn)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果一致,說明飼喂75%酒糟會(huì)使山羊腎臟抗氧化系統(tǒng)失調(diào),產(chǎn)生氧化應(yīng)激。

炎癥是機(jī)體對(duì)有害刺激物的防御反應(yīng),與機(jī)體營養(yǎng)健康之間有著密切的聯(lián)系,這種反應(yīng)可以減輕感染、清除損傷細(xì)胞、啟動(dòng)組織修復(fù)。炎癥與許多疾病有關(guān),包括感染性和自身免疫性疾病,各臟器和腫瘤疾病[31-32]。慢性炎癥中巨噬細(xì)胞激活因子激活巨噬細(xì)胞長期且低量的分泌TNF-α、IL-1β等細(xì)胞因子以維持炎癥的發(fā)展[33]。TNF-α是炎癥早期產(chǎn)生的促炎因子,可以導(dǎo)致發(fā)熱,刺激內(nèi)皮細(xì)胞釋放大量炎性因子和促進(jìn)中性粒細(xì)胞黏附到上皮細(xì)胞,進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生局部炎性反應(yīng)[34-35]。IL-1β是一種由大腦中的神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞、星型膠質(zhì)細(xì)胞和外周多種免疫細(xì)胞產(chǎn)生和釋放的重要的促炎細(xì)胞因子,可誘導(dǎo)炎癥,促進(jìn)黏附分子的分泌和多種炎癥因子產(chǎn)生,是體內(nèi)誘導(dǎo)作用最強(qiáng)的炎癥介質(zhì)之一[35-36]。IL-6由T淋巴細(xì)胞在IL-1和TNF-α的誘導(dǎo)下分泌的免疫調(diào)節(jié)因子,其參與炎癥反應(yīng)及造血過程等,在機(jī)體的抗感染免疫中起重要作用[36-38]。TNF-α、IL-1β、IL-6均屬于機(jī)體的促炎因子,可反映出機(jī)體的炎性程度,因此,通過檢測(cè)三者含量可反映機(jī)體的基本炎癥狀況。李華磊等[30]研究表明在肉雞飼糧中添加15%玉米干酒糟及其可溶物肉雞血清中IL-6含量顯著上升;CHEN等[39]的研究表明保育豬飼喂 30%玉米酒糟及其可溶物的日糧3周會(huì)增加結(jié)腸組織中TNF-α的水平;WEBER等[40]給斷奶豬飼喂含有7.5%干酒糟可溶物的日糧,發(fā)現(xiàn)在日糧中添加7.5%干酒糟可溶物會(huì)增加回腸組織中IL-6和IL-1β mRNA的相對(duì)豐度。本研究結(jié)果與其趨勢(shì)相似。表明用75%酒糟飼喂山羊會(huì)使山羊腎臟免疫系統(tǒng)受到刺激,從而出現(xiàn)炎癥反應(yīng)。

分析顯著富集到的3條信號(hào)通路發(fā)現(xiàn)共富集到21個(gè)相同的差異基因,這21個(gè)基因在NCBI中有注釋的主要可以分為3類:NADH脫氫酶、細(xì)胞色素c氧化酶、ATP合酶。同時(shí)分析GO富集中的差異基因,發(fā)現(xiàn)生物過程中差異基因主要富集在電子傳遞鏈和呼吸電子傳遞鏈。氧化磷酸化是在細(xì)胞中產(chǎn)生的一系列氧化還原反應(yīng),是有氧呼吸的標(biāo)志,其分解糖、脂、氨基酸等的最終產(chǎn)物是ATP[41]。線粒體電子傳遞鏈在一系列電子傳遞反應(yīng)下通過氧化磷酸化產(chǎn)生細(xì)胞ATP,其提供細(xì)胞生存所需約95%的能量[42-43],如圖8所示,真核生物電子傳遞鏈中的氧化磷酸化系統(tǒng)由5種酶組成:NADH-泛醌氧化還原酶(復(fù)合物I)、琥珀酸-泛醌氧化還原酶(復(fù)合物Ⅱ)、泛醇-細(xì)胞色素c氧化還原酶(復(fù)合物Ⅲ,或細(xì)胞色素bc1復(fù)合物)、細(xì)胞色素c氧化酶(復(fù)合物Ⅳ)和ATP合酶(復(fù)合物Ⅴ)[44-45]。NADH脫氫酶是電子傳遞鏈的“入口酶”,催化電子從NADH轉(zhuǎn)移到電子鏈,是電子傳遞鏈的第一步,在能量代謝中起著至關(guān)重要的作用[46-48]。細(xì)胞色素C氧化酶是線粒體呼吸鏈末端的限速酶[49],通過其催化核心中存在的4種氧化還原活性金屬輔因子催化電子從細(xì)胞鐵色素c轉(zhuǎn)移到分子氧,是呼吸鏈中唯一能夠直接與氧作用,將氧還原成水的復(fù)合物[50-51],對(duì)有氧能量的產(chǎn)生有關(guān)鍵作用[52]。ATP合酶是多個(gè)蛋白亞單位組成的蘑菇狀結(jié)構(gòu)寡聚復(fù)合物,由F1水溶性部分和Fo組成,是細(xì)胞生物能量機(jī)制的關(guān)鍵參與者。其F1部分承擔(dān)ATP合酶的催化活性,Fo部分嵌在線粒體內(nèi)膜中形成跨膜離子通道。F1γ亞基轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)依次接觸3組αβ單元中的β亞基,使β亞基的構(gòu)象進(jìn)行規(guī)律性、循環(huán)變化,γ亞基每旋轉(zhuǎn)360度就合成3個(gè)分子的ATP 。ATP合酶逆向轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí),ATP被水解成ADP和Pi[53-55]。研究表明酒精通過多種機(jī)制使腎臟產(chǎn)生自由基并導(dǎo)致腎臟氧化應(yīng)激[56]。本研究通過轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)腎臟的氧化磷酸化系統(tǒng)中的NADH 脫氫酶、細(xì)胞色素c氧化酶、ATP 合酶表達(dá)量明顯差異,這說明飼喂75%酒糟會(huì)使山羊腎臟發(fā)生氧化應(yīng)激,這與ABOUEL等[57]、李華磊等[30]的研究結(jié)果一致。此外,轉(zhuǎn)錄組測(cè)序也發(fā)現(xiàn)差異基因富集于NF-κB信號(hào)通路、JAK-STAT信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路等炎癥通路中。這與本研究前面的研究結(jié)果一致,表明75%酒糟飼喂山羊會(huì)使山羊腎臟免疫系統(tǒng)受到刺激。

圖8 氧化磷酸化反應(yīng)