盛 磊,周杰詩,韓 旭,李伊楠,劉慧娟,孫 濤

(南開大學(xué)藥學(xué)院,天津 300350)

急性肺損傷(acute lung injury,ALI)為中度或輕度的急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS),表現(xiàn)為進(jìn)行性低氧血癥、呼吸困難和呼吸功增加[1],可由膿毒癥(Sepsis)或創(chuàng)傷等肺外原因引起,因其高發(fā)病率和死亡率,嚴(yán)重威脅人類健康。目前臨床上尚無特異性的治療方案,一般針對癥狀采取機(jī)械性通氣供氧進(jìn)行支持性護(hù)理,但療效不佳,死亡率仍高達(dá)40%[2],因此急需有效治療藥物的出現(xiàn)。ACT001是二甲基胺含笑內(nèi)酯(dimethylaminomicheliolide,DMAMCL)的富馬酸鹽形式,其易溶于水、原料廉價(jià)易得、制備工藝簡單成熟、成藥性好[3-5],具有抗多種腫瘤、白血病和免疫調(diào)節(jié)活性,且作為治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma,GBM)的孤兒藥,目前已被批準(zhǔn)進(jìn)行多項(xiàng)臨床試驗(yàn)(ACTRN12616000228482,澳大利亞和新西蘭;ChiCTR-OIC-17013604,中國)。

NF-κB是膿毒癥病理進(jìn)程中促進(jìn)炎癥反應(yīng)發(fā)生和擴(kuò)大的關(guān)鍵因子,外源性刺激因子如脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)與Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)結(jié)合,激活核因子NF-κB,增加一系列促炎基因的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)一系列炎癥因子如:TNF-α、IL-6等的生成與釋放[6],引起免疫因子風(fēng)暴;過量的炎癥因子繼續(xù)誘導(dǎo)活性氧(reactive oxygen species,ROS)的產(chǎn)生和氧化應(yīng)激[7],共同導(dǎo)致肺部的損傷與衰竭。

有大量研究報(bào)道ACT001能通過抑制NF-κB相關(guān)通路發(fā)揮一系列生物活性:ACT001可以通過抑制AKT磷酸化抑制小膠質(zhì)細(xì)胞NF-κB核易位,從而抑制NLRP3炎癥小體活化,實(shí)現(xiàn)下調(diào)小膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)炎癥反應(yīng)[8];ACT001可以直接結(jié)合IκκB,抑制其磷酸化,從而抑制NF-κB信號通路實(shí)現(xiàn)抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤生長[9]。

基于以上背景我們評價(jià)ACT001對膿毒癥引起的急性肺損傷的保護(hù)作用并探究其藥理機(jī)制,為急性肺損傷的研究與臨床治療提供新的方案。

1 材料

1.1 細(xì)胞RAW264.7(小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞)購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司;

1.2 藥物與試劑RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、青/鏈霉素購自 Gibco 公司,ROS檢測試劑盒、一氧化氮檢測試劑盒和總SOD活性檢測試劑盒(WST-8法)購自碧云天生物技術(shù)有限公司;TNF-α、IL-6 EILSA檢測試劑盒購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司;RNA提取試劑盒購自上海雅酶生物科技有限公司;ACT001由南開大學(xué)陳悅教授提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物實(shí)驗(yàn)動物品系為SPF級C57BL/6(6-8周)小鼠,購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司,實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號為:SYXK(津)2019-0001。

2 方法

2.1 小鼠急性肺損傷模型的建立及給藥治療本研究建立腹腔注射LPS的小鼠膿毒癥急性肺損傷模型。對小鼠進(jìn)行分組,分為:對照組(control)、模型組(LPS)、ACT001低劑量治療組(ACT001-L)和高劑量治療組(ACT001-H)。d1模型組和治療組小鼠按30 mg·kg-1腹腔注射LPS,對照組不做處理,治療組造模2 h后分別按照低劑量100 mg·kg-1,高劑量200 mg·kg-1腹腔注射ACT001溶液,每24 h再次給藥治療。自造模起,每12 h觀察小鼠生存狀態(tài),并記錄小鼠體溫等數(shù)據(jù)。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組RAW264.7細(xì)胞用含有10%胎牛血清和1%青鏈霉素混合液的RPMI 1640培養(yǎng)基置于37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn),設(shè)置①對照組(control):正常培養(yǎng)的RAW264.7細(xì)胞組;②模型組(LPS):LPS濃度為1 mg·L-1;③ACT001低劑量治療組(ACT001-L):LPS濃度為1 mg·L-1,ACT001濃度為5 μmol·L-1;④ACT001高劑量治療組(ACT001-H):LPS濃度為1 mg·L-1,ACT001濃度為10 μmol·L-1。

2.3 小鼠肺泡灌洗液的收集造模24 h后,將小鼠安樂死,仰臥固定于操作臺上,暴露氣管,酒精棉球消毒,滯留針緩慢插入頸部氣管約1/3處,用預(yù)冷PBS沖洗肺部3次,每次0.4 mL,收集肺泡灌洗液(BALF)。灌洗液轉(zhuǎn)入EP管后立即置于冰盒中,1 000 r·min-1、4 ℃離心5 min,取得的上清用于蛋白質(zhì)含量的測定,下層沉淀用紅細(xì)胞裂解液處理后用流式細(xì)胞術(shù)檢測中性粒細(xì)胞水平。

2.4 組織病理學(xué)評估急性肺損傷程度造模第7天將各組小鼠安樂死,取肺組織用10%福爾馬林固定,流水沖洗,常規(guī)脫水、石蠟包埋切片后進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色,在顯微鏡下觀察肺組織的損傷情況。

2.5 肺濕干比測量造模24 h后,將小鼠安樂死,取出完整的肺立即稱重為濕重,隨后將肺組織置于EP管中開蓋于烘箱中60 ℃烘至恒重即為干重。濕重除以干重即為肺濕干比。

2.6 流式細(xì)胞術(shù)

2.6.1MHC-Ⅱ檢測 取給藥培養(yǎng)24 h后的各組細(xì)胞,吸棄培養(yǎng)基,PBS清洗2次,加入胰酶消化后加完全培養(yǎng)基終止消化,800 r·min-1離心5 min,PBS重懸得到單細(xì)胞懸液,加入MHC-Ⅱ抗體,4 ℃孵育45 min,離心棄上清,再加二抗4 ℃避光孵育30 min,PBS清洗后過濾網(wǎng),用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

2.6.2中性粒細(xì)胞檢測 取肺泡灌洗液離心后得到的細(xì)胞沉淀用紅細(xì)胞裂解液處理,PBS重懸得到單細(xì)胞懸液,加入Ly6G和CD11b抗體避光孵育45 min,PBS洗去抗體后過濾網(wǎng),用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

2.6.3ROS檢測 制備同“2.6.1”中的單細(xì)胞懸液,按照ROS檢測試劑盒說明書進(jìn)行處理,最后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

2.7 ELISA取上述收集到的血清和培養(yǎng)基上清,嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書檢測IL-6、TNF-α的含量。

2.8 Western blot細(xì)胞培養(yǎng)給藥24 h后,提取各組細(xì)胞總蛋白,采用BCA蛋白定量法檢測各組細(xì)胞蛋白濃度,99 ℃滅活蛋白10 min,SDS-PAGE凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶封閉3 h,一抗4 ℃孵育過夜,二抗室溫孵育2 h,ECL顯色并用成像儀進(jìn)行顯影。

2.9 qRT-PCR用RNA提取試劑盒提取給藥培養(yǎng)24 h后的各組細(xì)胞的總RNA,參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA,引物序列由擎科生物合成,詳見Tab 1。加入cDNA模板對Arg-1、iNOs、SOD基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增,以GAPDH為內(nèi)參照,采用△△CT值法測定各基因表達(dá)水平。

Tab 1 Primer sequence for real time PCR

2.10 NO含量和總SOD活性的測定取給藥培養(yǎng)24 h后的各組細(xì)胞,取上清按照一氧化氮檢測試劑盒說明書測定NO含量,取細(xì)胞按照總SOD活性檢測試劑盒檢測總SOD活性。

2.11 質(zhì)譜分析取給藥培養(yǎng)24 h后的各組細(xì)胞,提取總蛋白質(zhì),膠內(nèi)酶解,多肽在0.1%的甲酸中重新懸浮,離心,并注入三重四離子阱和Orbitrap質(zhì)譜儀,所有MS原始數(shù)據(jù)均使用MaxQuant進(jìn)行分析。

3 結(jié)果

3.1 ACT001對小鼠急性肺損傷模型的治療作用

3.1.1ACT001改善急性肺損傷小鼠的一般生活狀態(tài),延長生存期并維持體溫恒定 ACT001結(jié)構(gòu)如Fig 1A所示,在體內(nèi)代謝為活性成分含笑內(nèi)酯(micheliolide,MCL)(Fig 1B),建立膿毒癥誘發(fā)急性肺損傷模型后給藥,實(shí)驗(yàn)過程中觀察小鼠一般生活狀態(tài):對照組小鼠行為活躍,皮毛柔順、有光澤,呼吸平穩(wěn),排便正常;與對照組小鼠相比,模型組小鼠行動遲緩,多數(shù)呈蜷縮狀,汗毛直立,出現(xiàn)寒顫,肛門處有糞便凝固粘連毛發(fā);ACT001治療組小鼠隨治療劑量增加,生存狀態(tài)較模型組有明顯改善。

Fig 1 The chemical structure of ACT001 and MCL

生存情況顯示:模型組小鼠在造模的60 h內(nèi)出現(xiàn)了大規(guī)模的死亡,與之相比,治療組小鼠,尤其是高劑量組的死亡率明顯降低(Fig 2A)。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)小鼠的死亡往往伴隨著較低的體溫(<33 ℃),與對照組相比,模型組在造模后48 h內(nèi)平均體溫明顯降低(P<0.01);與之相比,治療組小鼠的體溫提高且穩(wěn)定,尤其是高劑量治療組在造模后24、36、48 h較模型組都有顯著性差異(P<0.01)(Fig 2B)?？梢夾CT001在急性肺損傷的早期和癥狀高峰期就能發(fā)揮良好的治療作用,抑制疾病進(jìn)展。

3.1.2ACT001改善急性肺損傷小鼠肺組織病理 HE染色(Fig 3A)結(jié)果顯示:對照組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常,肺泡結(jié)構(gòu)完整且排列整齊,肺泡間隙無出血和炎性細(xì)胞浸潤現(xiàn)象;模型組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)紊亂,肺泡結(jié)構(gòu)被明顯破壞,出血嚴(yán)重,可見大量炎性細(xì)胞浸潤;高劑量治療組小鼠較模型組情況得到了極大改善,出血與炎性細(xì)胞浸潤明顯減輕,肺泡結(jié)構(gòu)相對完整,低劑量治療組仍有輕微出血現(xiàn)象,但仍明顯優(yōu)于模型組。肺損傷評分(Fig 3B)結(jié)果與HE染色結(jié)果相一致。由此可見,ACT001劑量依賴性地改善LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷。

Fig 2 Effect of ACT001 on percent survival and temperature

3.1.3ACT001緩解急性肺損傷小鼠肺水腫情況 模型組小鼠因肺組織結(jié)構(gòu)受損、肺泡結(jié)構(gòu)被破壞,出現(xiàn)嚴(yán)重的出血和炎性滲出,由Fig 3C可見其肺濕干比較對照組明顯上升(P<0.01),呈現(xiàn)肺水腫狀態(tài)。在ACT001的治療下,肺濕干比較模型組降低,其中高劑量治療組下降程度更加明顯(P<0.01),可見ACT001劑量依賴性地改善急性肺損傷小鼠肺水腫情況。

3.1.4ACT001改善肺組織中蛋白質(zhì)滲出和中性粒細(xì)胞浸潤 流式細(xì)胞術(shù)檢測肺泡灌洗液中中性粒細(xì)胞水平,結(jié)果顯示:模型組小鼠肺泡灌洗液中中性粒細(xì)胞水平較對照組明顯增加(P<0.01),而在接受ACT001治療后,低、高劑量治療組肺泡灌洗液中中性粒細(xì)胞水平均大幅度下降(P<0.01)(Fig 4A,B);BCA法檢測BALF中蛋白質(zhì)濃度(Fig 4C),結(jié)果顯示:模型組蛋白質(zhì)濃度較對照組明顯增加(P<0.01),而在ACT001作用下劑量依賴性降低(P<0.01);綜合以上結(jié)果表明:ACT001可緩解急性肺損傷小鼠肺部的蛋白質(zhì)滲出和炎性細(xì)胞浸潤。

3.1.5ACT001降低急性肺損傷小鼠血清中炎癥因子濃度 ELISA檢測血清中炎癥因子水平(Fig 4D,E),結(jié)果顯示:模型組的TNF-α及IL-6含量較對照組均明顯升高(P<0.01),而在高劑量ACT001治療下明顯降低(P<0.01)。

3.2 ACT001改善LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥反應(yīng)

3.2.1ACT001促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞M2 抗炎極化,抑制M1促炎極化 Western blot結(jié)果如Fig 5A所示,以β-actin為內(nèi)參,在LPS刺激下,RAW264.7細(xì)胞的iNOs蛋白相對表達(dá)水平明顯上升,而在ACT001作用下,其表達(dá)水平劑量依賴性下降,Arg-1的蛋白表達(dá)水平趨勢與之相反。qRT-PCR(Fig 5B)結(jié)果和Western blot結(jié)果相一致。共同說明:ACT001劑量依賴性地促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞M2抗炎極化,抑制M1促炎極化。

3.2.2ACT001抑制RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生 NO Griess法測定各組RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生的NO水平,如Fig 5C所示,模型組與對照組相比,LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中NO濃度明顯上升(P<0.01);ACT001低、高劑量組與模型組相比,NO含量均明顯下降(P<0.01)且呈現(xiàn)劑量依賴性。

3.2.3ACT001抑制RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子 ELISA檢測各組RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生的相關(guān)炎癥因子水平(Fig 5D),結(jié)果顯示:LPS炎癥模型組的TNF-α及IL-6水平較對照組明顯升高(P<0.01),而在ACT001影響下劑量依賴性降低(P<0.01)。

3.3 ACT001改善LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞氧化應(yīng)激

3.3.1ACT001清除ROS 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生的ROS水平,結(jié)果如Fig 6A,B所示:LPS刺激下,ROS陽性的細(xì)胞比例較對照組明顯增加(P<0.01),而在ACT001影響下,與模型組相比,ACT001低、高劑量組ROS陽性細(xì)胞比例分別下調(diào)約11.1%和33.4%(P<0.01)。

3.3.2ACT001促進(jìn)SOD mRNA的表達(dá),增加SOD活性 qRT-PCR檢測各組RAW264.7細(xì)胞的SOD mRNA的表達(dá)水平(Fig 6C),總SOD活性檢測試劑盒檢測總SOD活性(Fig 6D),兩者結(jié)果相一致:模型組較對照組的SOD mRNA水平和蛋白活性下降(P<0.01),ACT001低、高劑量組較模型組均上升(P<0.01)。

3.4 ACT001主要通過MHC-Ⅱ途徑改善急性肺損傷提取各組不同處理RAW264.7細(xì)胞的蛋白質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜檢測及KEGG通路富集分析(Fig 7A),將在模型組中上調(diào)的通路與給藥后下調(diào)的通路取交集發(fā)現(xiàn),ACT001可能主要是通過影響抗原處理與呈遞通路發(fā)揮治療膿毒癥誘發(fā)的急性肺損傷的作用。

Fig 4 Effect of ACT001 on BALF and inflammation factors in serum in LPS-induced ALI

Western blot檢測抗原處理與呈遞通路中關(guān)鍵蛋白p-STAT1、CIITA和MHC-Ⅱ的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)LPS刺激下,RAW264.7細(xì)胞中p-STAT1、CIITA和MHC-Ⅱ的蛋白表達(dá)水平明顯增加,而在ACT001作用下,尤其在高濃度ACT001環(huán)境中,三者的蛋白水平明顯下降(Fig 7B);進(jìn)一步地,我們標(biāo)記了RAW264.7細(xì)胞表面的MHC-Ⅱ蛋白,用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析驗(yàn)證,結(jié)果(Fig 7C,D)與Western blot結(jié)果相一致。綜合以上結(jié)果表明ACT001能夠通過抑制STAT1的701位酪氨酸磷酸化,抑制轉(zhuǎn)錄因子CIITA產(chǎn)生,從而抑制MHC-Ⅱ的表達(dá),抑制抗原處理與呈遞過程發(fā)揮抗炎、抗氧化作用,最終實(shí)現(xiàn)治療膿毒癥誘發(fā)的急性肺損傷。

4 討論

膿毒癥仍然是重癥監(jiān)護(hù)病房(intensive care unit,ICU)死亡的主要原因,也是一項(xiàng)重大的全球公共衛(wèi)生安全挑戰(zhàn)。膿毒癥會引起多器官損傷衰竭,而肺是其首先損害的重要器官,可導(dǎo)致急性肺損傷,最終導(dǎo)致死亡[10]。革蘭陰性菌的LPS結(jié)合細(xì)胞表面Toll樣受體,引起過度的先天性免疫反應(yīng),在肺部表現(xiàn)為產(chǎn)生大量的炎癥因子、引起免疫細(xì)胞的招募和活化并產(chǎn)生過量的ROS[11],導(dǎo)致血管通透性增加、正常內(nèi)皮屏障功能持續(xù)喪失以及肺泡結(jié)構(gòu)受損,正常的肺微循環(huán)遭到破壞,導(dǎo)致富含蛋白質(zhì)的肺水腫積累,影響肺換氣功能,表現(xiàn)為進(jìn)行性動脈低氧血癥、呼吸困難和呼吸功明顯增加,最終導(dǎo)致個(gè)體死亡[12]。其藥物開發(fā)大多都停留在臨床前階段,臨床上也缺乏十分有效的藥物,因此,尋找有效的靶點(diǎn)與藥物是當(dāng)前急需解決的問題。

Fig 5 Effect of ACT001 on anti-inflammatory activity of RAW264.7 cells under LPS

Fig 6 Effect of ACT001 on antioxidative activity of RAW264.7 cells under LPS

Fig 7 Effect of ACT001 on different pathways of RAW264.7 cells under LPS

急性肺損傷的病理生理進(jìn)程復(fù)雜,目前還沒有完全闡明其發(fā)病機(jī)制,可由創(chuàng)傷感染等因素引起,所以本研究采取腹腔注射LPS的方式引起的全身免疫因子風(fēng)暴,構(gòu)建小鼠急性肺損傷模型。其病理進(jìn)程中大量免疫細(xì)胞如中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞在肺部被招募和激活[13],其中中性粒細(xì)胞在急性肺損傷的進(jìn)程中發(fā)揮著核心作用[14],其活化可增加肺泡-毛細(xì)血管屏障的通透性,導(dǎo)致ROS產(chǎn)生,增加局部炎癥從而導(dǎo)致肺組織損傷[15]。本研究結(jié)果顯示:在個(gè)體水平上,ACT001維持模型小鼠體溫恒定,提高存活率;在組織水平上,ACT001能明顯減輕肺部的中性粒細(xì)胞浸潤,保護(hù)肺泡結(jié)構(gòu),減少滲血和蛋白質(zhì)滲出,改善肺水腫情況,降低血清中炎癥因子水平,并呈現(xiàn)出劑量依賴性。全面而有力地證明了ACT001對膿毒癥引起的急性肺損傷具有良好的治療作用。

大量證據(jù)[13,15-16]表明,炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激是急性肺損傷病理進(jìn)程中對機(jī)體造成損傷的兩種重要途徑:外源性物質(zhì)結(jié)合相關(guān)受體,如TLRs,通過病原體相關(guān)分子模式(pathogen-related molecular patterns,PAMPs)或損傷相關(guān)分子模式(damage-related molecular patterns,DAMPs),激活核因子NF-κB,誘導(dǎo)一系列炎癥因子釋放引起免疫因子風(fēng)暴;免疫因子的大量產(chǎn)生進(jìn)一步誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和ROS的產(chǎn)生[7],導(dǎo)致個(gè)體的肺血管內(nèi)皮損傷,引起出血和免疫細(xì)胞浸潤,最終導(dǎo)致死亡。

NF-κB-誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOs)-NO信號通路是一條重要的氧化應(yīng)激通路,而iNOs也是RAW264.7細(xì)胞促炎M1極化的標(biāo)志物。Western blot和qRT-PCR結(jié)果共同表明:ACT001促進(jìn)LPS處理的RAW264.7細(xì)胞由促炎M1極化類型向抗炎M2極化類型轉(zhuǎn)變,降低NO、IL-6、TNF-α的產(chǎn)生與釋放,抑制炎癥反應(yīng)擴(kuò)大。ROS的流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示:在ACT001治療下,接受LPS刺激的RAW264.7產(chǎn)生的ROS大幅度下降,且呈現(xiàn)劑量依賴性;通過對總SOD活性和SOD mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行檢測,推測可能是ACT001促進(jìn)SOD的產(chǎn)生來發(fā)揮清除ROS的作用。從而證明了ACT001對炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激這兩條關(guān)鍵損傷通路都能發(fā)揮良好的治療作用。

最后通過質(zhì)譜檢測并進(jìn)行KEGG通路富集,探究ACT001治療急性肺損傷的機(jī)制,發(fā)現(xiàn)抗原處理與呈遞通路在LPS刺激下明顯上調(diào)而在ACT001處理下發(fā)生下調(diào),推測其是ACT001發(fā)揮作用的關(guān)鍵通路。巨噬細(xì)胞是專業(yè)抗原呈遞細(xì)胞之一(antigen-presenting cells,APCs),組織相容性復(fù)合體2(MHC-Ⅱ)是其抗原處理與呈遞過程中的重要分子,磷酸化的STAT1可生成二聚體,激動MHC-Ⅱ基因的轉(zhuǎn)錄因子CIITA,從而促進(jìn)MHC-Ⅱ基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯,生成大量MHC-Ⅱ蛋白[17];抗原在溶酶體等細(xì)胞器處理下產(chǎn)生抗原肽,與MHC-Ⅱ分子在細(xì)胞內(nèi)結(jié)合,并被運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞膜上,被CD4+T細(xì)胞識別結(jié)合,進(jìn)而引起下游的一系列免疫反應(yīng),包括炎癥和氧化應(yīng)激等[18]。我們使用Western blot檢測了p-STAT1、CIITA和MHC-Ⅱ的蛋白表達(dá)水平,證明了ACT001可以抑制STAT1的701位酪氨酸磷酸化,抑制CIITA的產(chǎn)生,從而抑制MHC-Ⅱ基因的表達(dá),抑制抗原處理與呈遞;我們還進(jìn)一步通過流式細(xì)胞術(shù)檢測不同處理下細(xì)胞表面帶有MHC-Ⅱ蛋白的RAW264.7細(xì)胞比例,結(jié)果也與Western blot結(jié)果相一致,進(jìn)一步證明了ACT001對MHC-Ⅱ通路的抑制作用。

綜上所述,ACT001可以通過抑制STAT1的701位酪氨酸磷酸化,抑制CIITA的產(chǎn)生,從而抑制MHC-Ⅱ基因的表達(dá),抑制抗原處理與呈遞通路,在炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激層面都發(fā)揮活性,有效緩解膿毒癥引起的急性肺損傷的肺水腫、蛋白質(zhì)滲出和炎性細(xì)胞浸潤等肺部損傷,維持個(gè)體體溫穩(wěn)定,提高存活率,從而治療膿毒癥引起的急性肺損傷。

此外ACT001也具有良好的生物安全性和穩(wěn)定性,并且原料廉價(jià)易得,有望作為“老藥新用”型藥物開發(fā)成為治療膿毒癥引起的急性肺損傷的新藥。