王 鵬, 袁 瑤, 張海港, 劉 雅

(陸軍軍醫(yī)大學藥學與檢驗醫(yī)學系藥理學教研室,重慶 400038)

近年來動脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)一直穩(wěn)居人類健康的 “第一殺手”,其防治已成為全世界共同關注的重大課題。越來越多的流行病學和臨床研究支持非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)的病理進展與AS及其心血管事件之間的因果關聯(lián),同時NAFLD患者心血管風險與NAFLD的嚴重程度呈正相關[1]。由于生活方式的改變和經(jīng)濟的繁榮,全球NAFLD患者已超過17億,這成為高血壓、吸煙、膽固醇水平等經(jīng)典危險因素嚴格控制之下而AS相關心血管疾病發(fā)病率仍居高不下的重要原因之一[2]。鑒于NAFLD已成為AS病程中血管損傷的持續(xù)驅(qū)動因素,因此對肝臟脂肪變性以及功能的改善很可能是抗AS的新的重要途徑。

卡維地洛 (carvedilol)是第三代β受體拮抗劑,兼具非選擇性β受體和α1受體的阻斷作用, 廣泛用于射血分數(shù)降低型心力衰竭、高血壓和心肌梗死后左心室功能不全的治療。近年研究表明,在動脈粥樣硬化性心血管疾病(atherosclerotic cardiovascular diseases, ASCVDs)患者、以及肥胖、糖尿病等動物實驗中,Car均表現(xiàn)出傳統(tǒng)β受體拮抗劑所不具備的代謝獲益[3]。同時有大量的研究關注Car對肝臟纖維化、缺血/再灌注損傷、肝硬化、門靜脈高壓等多種肝臟損傷的保護作用[4],然而卡維地洛對脂肪肝的影響卻鮮見報道。本研究擬初步闡明卡維地洛通過改善肝臟脂肪變性,發(fā)揮抗AS的作用。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑本實驗已通過陸軍軍醫(yī)大學倫理委員會審查。ApoE-/-小鼠(C57BL/6JGpt-Apoeem1Cd82/Gpt)購于江蘇集萃藥康生物科技有限公司,動物使用許可證號為SYXK(渝)20170002;卡維地洛(純度≥98%;索萊寶公司,C9980);羧甲基纖維素鈉(畢得醫(yī)藥,BD01294049);高膽固醇飼料(40% kcal fat, 1.25% cholesterol, 0.5% cholic acid;Research Diets,D12109C);Acad10、Mtor和β-actin引物購自上海生工。BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天公司,P0012S);2 × BeyoFastTMSYBR Green qPCR Mix(碧云天公司,D7260);小鼠脂肪酸β氧化酶(FAβO) ELISA Kit (蒙柏歐生物科技公司,MBE6046);mTOR抗體 (Cell Signaling Technology, 2983);ACAD10抗體 (購自中國武漢三鷹公司,17161-1-AP);β-actin抗體 (正能生物公司,250132);總RNA提取試劑盒(索萊寶公司,R1200);逆轉錄試劑盒 (Thermo Fisher,K1622);ECL發(fā)光液 (葆光生物,BG0001)。

1.2 動物分組和處理8周齡雄性ApoE-/-小鼠隨機分為對照組(Control)和卡維地洛組(Carvedilol)。根據(jù)文獻和預實驗結果,確定卡維地洛(溶解于5 g·L-1羧甲基纖維素鈉)灌胃給藥,劑量為12.5 mg·kg-1[5]。同時Control組小鼠給予5 g·L-1羧甲基纖維素鈉溶液灌胃,每天1次,共計10周。兩組小鼠均給予高脂高膽固醇飼料喂養(yǎng)。

1.3 血脂水平及肝功能檢測小鼠禁食過夜,取眼球血,室溫放置2 h,3 000×g離心10 min取血清。用全自動生化分析儀檢測總膽固醇(total cholesterol, TC)、總甘油三脂(total triglycerides, TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol, HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C)、天冬氨酸轉氨酶(aspartate aminotransferase, AST)、丙氨酸轉氨酶(alanine transaminase, ALT)。計算AS指數(shù)(atherosclerotic index, AI) = (TC-HDL)/HDL;心臟危險因素(cardiac risk factor, CRF) = TC/HDL[6]。

1.4 血糖水平檢測小鼠禁食過夜,取鼠尾血用血糖儀檢測空腹血糖(fasting blood glucose, FBG)。糖耐量檢測(glucose tolerance test, GTT):小鼠禁食16 h,給予葡萄糖2 g·kg-1腹腔注射,分別于注射前(0 min),注射后15、30、60、90、120 min取鼠尾血檢測血糖值。胰島素耐量測試(insulin tolerance test, ITT):小鼠禁食6 h,給予胰島素0.5 U·kg-1腹腔注射,分別于注射前(0 min),注射后15、30、60、90、120 min取鼠尾血檢測血糖值。

1.5 頭臂干、肝臟、胰腺和脂肪組織HE染色取小鼠頭臂干、肝臟、胰腺和睪丸上脂肪組織,切成2 mm×1 mm×1 mm小塊,4% 多聚甲醛固定24 h,制備石蠟切片,脫蠟染色,脫水封片,光學顯微鏡下觀察病理形態(tài)學改變,并利用軟件(Image-Pro plus Version 6.0; Media Cybernetics, Silver Spring, MD)計算頭臂干AS斑塊面積及血管內(nèi)、中膜比值。分別對肝臟[7]、脂肪和胰腺組織病理學改變進行評分[8]。

1.6 肝臟油紅O染色肝臟組織4% 多聚甲醛固定24 h后冰凍切片,油紅O染色40～60 min,60% 異丙醇脫色,蘇木素染液復染30 sec,水洗后光學顯微鏡觀察,并利用軟件(Image-Pro plus Version 6.0; Media Cybernetics, Silver Spring, MD) 計算油紅O染色面積。

1.7 肝臟脂肪酸β氧化酶檢測取少量肝臟組織,加入適量生理鹽水并低溫勻漿,3 000 r·min-1離心10 min取上清。肝臟脂肪酸β氧化酶水平按ELISA檢測試劑盒說明進行,酶標儀檢測在450 nm處的吸光度。

1.8 Real-time PCR檢測肝臟組織Acad10和MtormRNA的表達PBS沖洗肝臟組織,加入裂解液,低溫勻漿裂解,加入0.2 mL氯仿,12 000 r·min-1離心10 min取上清至吸附柱,多次漂洗后得到總RNA。用逆轉錄試劑盒將RNA逆轉為cDNA。用2×BeyoFastTMSYBR Green qPCR Mix試劑和引物配制反應體系對cDNA進行擴增和定量分析,采用2-△△CT法進行計算。所有小鼠基因引物序列見Tab 1。

Tab 1 Sequences of primers

1.9 Western blot檢測肝臟組織ACAD10和mTOR蛋白表達肝臟組織用PBS沖洗后加入IP裂解液,低溫勻漿裂解。4 ℃ 14 000×g離心5 min取上清,BCA法測定蛋白濃度。電泳、轉膜、封閉,于4 ℃ 孵育抗體:ACAD10(1 ∶300)、mTOR(1 ∶1 000)、β-actin(1 ∶10 000)過夜。37 ℃孵育山羊抗兔(1 ∶2 000)、馬抗鼠(1 ∶1 500) 二抗2 h后,ECL發(fā)光液顯影,ImageJ軟件分析蛋白相對含量。

2 結果

2.1 卡維地洛減輕ApoE-/-小鼠AS損傷本實驗用高脂高膽固醇飼料喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠建立AS模型,頭臂干HE染色表明Carvedilol組小鼠AS斑塊面積較Control組明顯減少(P<0.01),動脈損傷包括內(nèi)皮細胞脫落、內(nèi)彈力膜斷裂、平滑肌細胞增殖、遷移等明顯改善,此外動脈內(nèi)-中膜比值(P<0.05)較Control組明顯降低(Fig 1)。

Fig 1 Carvedilol reduced severity of atherosclerosis

2.2 卡維地洛對ApoE-/-小鼠血脂水平的影響如Fig 2A所示,與Control組相比,Carvedilol組ApoE-/-小鼠外周血中TC、TG、LDL含量與Control組無統(tǒng)計學差異,但是HDL的含量明顯升高(P<0.05)。AI和CRF是公認的靈敏度最高的AS及相關心血管疾病易感性的預測指標,在本實驗中卡維地洛可明顯降低ApoE-/-小鼠AI (P<0.05)和CRF (P<0.05) (Fig 2B)。

2.3 卡維地洛對ApoE-/-小鼠血糖水平的影響兩組ApoE-/-小鼠空腹血糖(FBG)未見顯著差異。但GTT結果表明,給予葡萄糖腹腔注射后30 min開始至120 min,Carvedilol組小鼠血糖水平一直較Control組明顯降低(P<0.05);ITT實驗則發(fā)現(xiàn)與Control組相比,Carvedilol組小鼠胰島素注射后15 min至60 min,血糖水平均明顯下降(P<0.05或0.01),但是在胰島素注射后90 min血糖水平開始升高(P<0.01),持續(xù)至120 min (P<0.05)?？梢娍ňS地洛明顯增強胰島素敏感性和葡萄糖穩(wěn)態(tài),從而提升了ApoE-/-小鼠在AS病程中應對血糖變化風險的能力(Fig 3)。

2.4 卡維地洛改善ApoE-/-小鼠肝臟損傷如Fig 4A,B所示,Control組小鼠肝臟表現(xiàn)出典型的脂肪樣變性,包括肝臟內(nèi)廣泛的脂質(zhì)空泡沉積,伴有明顯的淋巴細胞浸潤,評分提示病變相當于中度NAFLD;然而卡維地洛幾乎完全逆轉了ApoE-/-小鼠肝臟組織結構的損傷,評分提示為輕度NAFLD,與Control組小鼠相比,NAFLD評分明顯下降 (P<0.01);肝臟油紅O染色表明Carvedilol組肝臟脂質(zhì)含量較Control組明顯減少(P<0.01) (Fig 4C)。外周血ALT (P<0.01)和AST(P<0.01)水平也較Control組明顯降低(Fig 4D,E)。

Fig 2 Effects of carvedilol on level of blood lipids in ApoE-/-

Fig 3 Effects of carvedilol on blood glucose

2.5 卡維地洛對ApoE-/-小鼠肝臟脂肪酸β氧化水平的影響如Fig 5所示,Carvedilol組小鼠肝臟脂肪酸氧化水平較Control組明顯升高(P<0.01),提示卡維地洛能夠減輕ApoE-/-小鼠肝臟線粒體脂肪酸氧化的損傷。

Fig 4 Carvedilol alleviated liver injuries and improved

2.6 卡維地洛對ApoE-/-小鼠胰腺和脂肪組織的影響Control組胰腺結構紊亂、疏松,胰腺組織腺泡細胞間隔水腫,可見脂滴和炎癥細胞浸潤,導管周圍有實質(zhì)性壞死,而Carvedilol組小鼠胰腺組織緊實,細胞和管腔基本保持正常結構,并未發(fā)現(xiàn)明顯的脂質(zhì)浸潤。睪丸上脂肪組織HE染色顯示,Control組脂肪細胞明顯增大,形態(tài)不規(guī)則,呈大空泡狀,細胞壁變薄、間隙增寬,血管幾乎被增大的脂肪細胞擠壓不見,而Carvedilol組小鼠脂肪細胞大小適中,其間血管分布正常。Carvedilol組小鼠胰腺組織病理學評分和脂肪細胞大小較Control組均顯著下降(P<0.01),提示卡維地洛可顯著減輕AS小鼠胰腺和脂肪組織的損傷 (Fig 6)。

Fig 5 Effect of carvedilol on hepatic fatty acid

Fig 6 Effects of carvedilol on damages of pancreas and adipose

2.7 卡維地洛對ApoE-/-小鼠肝臟Acad10 和Mtor mRNA表達的影響與Control組比較,Carvedilol組肝臟Acad10 mRNA表達水平明顯升高(P<0.01)而Mtor mRNA表達明顯下調(diào)(P<0.01) (Fig 7)。

Fig 7 Effects of carvedilol on mRNA expression

2.8 卡維地洛對ApoE-/-小鼠肝臟ACAD10和mTOR 蛋白表達的影響Carvedilol組肝臟ACAD10蛋白表達較Control組明顯上調(diào)(P<0.05),而mTOR蛋白表達水平明顯下降 (P<0.01) (Fig 8)。

Fig 8 Effects of carvedilol on protein expression

3 討論

本實驗用高脂高膽固醇飼料喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠建立AS模型,同時給予卡維地洛灌胃10周,小鼠AS斑塊面積即顯著減少,動脈損傷明顯減輕,提示了卡維地洛具有抗AS作用?？ňS地洛可明顯升高AS小鼠外周血HDL-C水平,并幾乎可以完全逆轉AS小鼠肝臟組織表現(xiàn)出的典型的脂肪樣變性。Chen等[5]研究表明了卡維地洛可顯著增強Huh-7細胞中ATP結合盒轉運子蛋白A1(ATP-binding cassette transporter A1, ABCA1)表達。ABCA1是關鍵的膽固醇逆轉運蛋白,肝臟ABCA1表達的升高有利于膽固醇向循環(huán)轉運,從而導致外周血HDL-C水平升高,并減少肝臟脂質(zhì)累積?？ňS地洛同時減輕了AS小鼠胰腺、脂肪組織的損傷、顯著增加糖代謝的能力,這都有利于改善NAFLD[9]。目前眾多的臨床證據(jù)支持NAFLD與AS的聯(lián)系,一項包含27項研究的薈萃分析,通過頸動脈內(nèi)膜中層厚度、內(nèi)皮功能障礙、冠狀動脈鈣化和動脈壁硬度測量,在調(diào)整了年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)、吸煙、LDL、胰島素抵抗和代謝綜合征等經(jīng)典危險因素后,發(fā)現(xiàn)NAFLD是亞臨床AS的獨立危險因素,而且NAFLD患者頸動脈斑塊出現(xiàn)的頻率更高,提示脂肪肝可能在AS的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用;此外,ASCVDs也已成為NAFLD患者最常見的死亡原因[10]。因此卡維地洛減輕肝臟脂肪變性,很可能是其實現(xiàn)AS保護的重要途徑。

?；o酶A脫氫酶 (acyl-CoA dehydrogenases, ACADs)是一組結構相似的線粒體黃素酶,參與脂肪?；o酶A (acyl-CoAs)衍生物的β-氧化,已證實人類基因組包含ACAD家族的11個成員,具有一系列底物特異性和組織表達譜。其中ACAD10是ACAD家族的新成員,2004年由中國學者首先克隆,隨后Jerry Vockley實驗室預測ACAD10在線粒體β-氧化中對長鏈底物具有最大活性;通過構建ACAD10-/-小鼠發(fā)現(xiàn)ACAD10的缺失導致的最顯著的特征是肥胖、糖耐量異常以及外周胰島素抵抗,同時其外周血?；鈮A表達譜的改變符合長鏈脂肪酸β-氧化受損的表現(xiàn)[11]。一項全基因組關聯(lián)研究(genome-wide association study, GWAS) 證實了皮馬印第安人2型糖尿病的高發(fā)與Acad10變異相關;Acad10基因多態(tài)性成為高血壓遺傳易感性增加的決定因素[12]。在本研究中,卡維地洛升高AS小鼠肝臟脂肪酸β-氧化酶水平,同時明顯增強肝臟組織ACAD10 mRNA和蛋白表達水平,即可增強對長鏈Acyl-CoA的催化。長鏈脂肪酸的堆積被證實可以直接插入線粒體內(nèi)膜,造成線粒體嵴缺陷,使電子傳遞鏈功能受損[13]。近年越來越多的證據(jù)表明線粒體脂肪酸代謝功能障礙與AS密切相關。因此,盡管目前尚缺乏直接的實驗室和臨床證據(jù)證實ACAD10具有AS保護作用,仍有理由推測卡維地洛可能上調(diào)肝臟組織ACAD10來糾正AS病程中糖脂紊亂。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)作為細胞能量代謝的重要傳感器和控制器,與細胞生長和代謝密切相關,同時在AS、NAFLD等疾病中發(fā)揮著重要作用[14]。Wu等[15]研究表明,二甲雙胍限制RagC通過核孔進入細胞核活化,阻斷了RagC介導的mTOR激活,從而促進ACAD10表達的增加;mTOR抑制劑雷帕霉素也可誘導ACAD10表達上調(diào)。Wu 等[16]發(fā)現(xiàn)二甲雙胍呈劑量依賴性抑制HaCaT細胞mTOR的表達,同時伴有ACAD10表達的升高,應用魚藤酮抑制線粒體復合體可產(chǎn)生同樣的效應。然而mTORC1的過表達幾乎可以逆轉二甲雙胍誘導的HaCat細胞中ACAD10表達的增加,因此mTORC1的抑制可導致ACAD10的上調(diào)。Allen 等[17]通過特異性mTOR結合和功能測定證實了卡維地洛為新型的mTOR抑制劑,這與本實驗中卡維地洛可顯著下調(diào)AS小鼠肝臟mTOR表達的結果一致?？傊?卡維地洛可通過抑制肝臟mTOR激活、上調(diào)ACAD10參與糖脂代謝,從而緩解脂肪肝,發(fā)揮抗AS作用。然而,卡維地洛調(diào)控mTOR與ACAD10的上下游關系尚缺乏直接證據(jù),ACAD10對肝臟代謝功能的調(diào)控機制亦亟待深入研究。