王 萌,曹玉爽,郭莉琛,杜鑫苑,柴麗娟,袁 慶,胡利民

(天津中醫(yī)藥大學(xué)組分中藥國家重點實驗室、方劑學(xué)教育部重點實驗室、天津市中藥藥理學(xué)重點實驗室,天津 301617)

缺血/再灌注(ischemia-reperfusion injury,I/R)腦損傷情況下,可引起大量炎癥、白細(xì)胞黏附、活性氧化等級聯(lián)反應(yīng),破壞血腦屏障(BBB),從而導(dǎo)致神經(jīng)元死亡[1-2]。腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(brain microvascular endothelial cells, BMECs)是BBB的重要細(xì)胞成分,其細(xì)胞間緊密連接蛋白功能障礙會導(dǎo)致BBB完整性破壞,加重腦損傷[3-4]。心腦舒通膠囊(Xinnao shutong, XNST)是中藥蒺藜科屬植物蒺藜(TribulusterrestrisL. T)干燥地上全草提取制成的膠囊劑,臨床廣泛應(yīng)用于腦缺血的治療[5]。前期研究發(fā)現(xiàn),XNST及其3種單體成分(化合物Ⅱ-14A、Ⅱ-5A、原薯蕷皂苷)能促進OGD/R損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)因子釋放[6],且能明顯降低腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥因子TNF-α、IL-6的釋放[7]。本研究進一步通過考察其對OGD/R損傷后BMECs屏障完整性的保護作用及機制,為XNST治療缺血性卒中的臨床應(yīng)用及其二次開發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及實驗試劑bEnd.3 細(xì)胞株(ATCC,美國);缺氧小室(STEMCELL,27310,加拿大);熒光素鈉(Sigma,美國);anti-lamin-B1 (ab171123)、Claudin-5 (ab15106)、Occludin (ab31721)、ZO-1(ab96594)購于美國Abcam公司;anti-p-JNK(#4668,Invitrogen公司);anti-JNK(#9252,Invitrogen公司);anti-p38(#9212)、anti-p-ERK1/2(#9101)、anti-ERK1/2(#9102)、 β-actin(#4967)、anti-p-IκBα(#2859)、anti-I kappa B kinase (IKK)(#2697)、anti-p-IKK (#2697)、anti-NF-κB/p65(#3032)均購于美國CST公司,Hoechst 33258 (Thermo,美國)。

1.2 實驗儀器37 ℃飽和濕度培養(yǎng)箱(Thermo,FORMA3111型,美國),倒置相差顯微鏡(Nikon,TE200,日本),多功能讀板機(TECAN,瑞士),低溫高速離心機(BECKMAN,64R型,美國),超微量核酸分析儀(Malcom,E-spect,日本),實時熒光定量PCR儀(Applied Biosystems,7500型,美國),電阻儀(MERS00002,Millipore,美國),半干轉(zhuǎn)儀(Bio-rad,美國),熒光顯微鏡(Leica Microsystems,GER)。

1.3 方法

1.3.1藥物配制 XNST(批號:Z22021965,吉林敖東股份有限公司,中國):準(zhǔn)確稱量XNST中的藥粉溶于無菌超純水,分別配制1、10 g·L-1濃度母液于100 ℃沸水中煮沸30 min后過0.22 μm一次性過濾器,用時以DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液按1 ∶1 000稀釋。單體化合物:①化合物Ⅱ-14A(C61H100O13),②化合物Ⅱ-5A(terrestrinin A),③原薯蕷皂苷化合物(protodioscin):稱取各單體粉末溶于DMSO中配制成10 mmol·L-1母液,用時以DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液按1 ∶1 000稀釋,單體化合物結(jié)構(gòu)式如Fig 1所示。

1.3.2細(xì)胞培養(yǎng) 將bEnd.3細(xì)胞培養(yǎng)于含有10% 胎牛血清和100 kU·L-1鏈霉素和100 kU·L-1青霉素的DMEM中,在5% CO2、37 ℃飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.3細(xì)胞分組和處理 對照組(control):將培養(yǎng)液置換為高糖緩沖液,5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱正常培養(yǎng)4 h,4 h后置換為DMEM培養(yǎng)液,置5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

模型組(OGD/R):將培養(yǎng)液置換為無糖緩沖液,于缺氧小室內(nèi)進行缺氧缺糖處理,向小室內(nèi)持續(xù)充入94% N2+5% CO2+1% O2的混合氣體5 min后關(guān)閉缺氧小室,將小室放入 37 ℃孵箱中培養(yǎng)4 h后,換成DMEM培養(yǎng)液,置5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

加藥組:課題組前期研究發(fā)現(xiàn),XNST在1、10 mg·L-1濃度能明顯降低OGD/R損傷bEnd.3細(xì)胞炎癥因子TNF-α的釋放[7],因此本研究繼續(xù)以1、10 mg·L-1濃度XNST深入考察其對OGD/R損傷bEnd.3細(xì)胞屏障功能的影響。具體操作為缺氧缺糖處理同模型組,4 h后加入含XNST(1、10 mg·L-1)或化合物Ⅱ-14A、Ⅱ-5A、原薯蕷皂苷(10 μmol·L-1)的DMEM培養(yǎng)液,并置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.4藥物對OGD/R損傷bEnd.3細(xì)胞跨膜電阻值(TEER)的影響 bEnd.3細(xì)胞按1×107L-1接種于Transwell小孔上層,連續(xù)檢測其電阻值變化,待電阻值達(dá)到穩(wěn)定值之后,對細(xì)胞進行造模及加藥處理,具體操作方法及實驗分組如1.3.3所示。24 h后每孔分別從3個不同地方檢測電阻值,每組3孔,同時測量無細(xì)胞的空白Transwell培養(yǎng)液的電阻值作為基準(zhǔn)值。

1.3.5藥物對OGD/R損傷bEnd.3細(xì)胞熒光素鈉透過率的影響 待 TEER 電阻值穩(wěn)定后,用 1×PBS 溶液清洗 Transwell 內(nèi)外兩側(cè)各 2～3次,向內(nèi)側(cè)加入200 μL新鮮配制的含 Na-Flu(100 μg·L-1) DMEM 溶液,外側(cè)加入0.5 mL DMEM 溶液,置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中避光孵育1 h。1 h后取外側(cè)100 μL溶液于96孔黑板中,將培養(yǎng)板放入熒光酶標(biāo)儀中測定激發(fā)波長為485 nm,發(fā)射波長為530 nm的熒光強度。

1.3.6RT-PCR法檢測藥物對Claudin-5/Occludin/ZO-1 mRNA影響 bEnd.3細(xì)胞接種到6孔板,細(xì)胞分組及處理如1.3.3所述。24 h后用預(yù)冷的PBS輕洗細(xì)胞3次,用TRIzol法提取RNA。并按照SYBR GREEN PCR Master Mix試劑盒說明書進行擴增,用ABI 7500 RT-PCR 儀獲得每個樣品反應(yīng)的CT值,將mRNA水平歸一化為GAPDH水平,并根據(jù)以下公式計算處理細(xì)胞相對于對照樣本的閾值循環(huán)(CT)值的變化倍數(shù):變化倍數(shù)=2(-ΔΔCT)。所有樣本均重復(fù)分析3次。特異性引物對列于Tab 1。

Tab 1 Specific primer pairs

1.3.7藥物對相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 bEnd.3細(xì)胞接種到6孔板,細(xì)胞分組及處理同1.3.3所述。24 h后用預(yù)冷的PBS輕洗細(xì)胞2次。每孔加入100 μL蛋白裂解液(含1%PMSF),于冰上震蕩裂解15 min,刮下細(xì)胞于4 ℃ 12 000 r·min-1離心10 min。小心吸取上清并用BCA法測定其蛋白濃度。經(jīng)10% SDS-PAGE膠質(zhì)進行電泳轉(zhuǎn)移到PVDF膜,將所述膜在室溫下用5%脫脂乳孵育2 h并且在4 ℃下用以下一抗孵育過夜:JNK、p-JNK、p38、p-p38、ERK1/2、p-ERK1/2、Claudin-5、 Occludin 、ZO-1、NF-κB/p65、I kappa B alpha (IκBα)、p-IκBα、I kappa B kinase (IKK)、p-IKK、β-actin、lamin-B1作為內(nèi)參,4 ℃滾軸孵育過夜后用TBST漂洗相應(yīng)PVDF膜5 min×4次。加入相應(yīng)的二抗室溫下孵育1 h用TBST漂洗5 min×4次。用ECL化學(xué)發(fā)光試劑對PVDF膜進行顯影,使用ImageJ軟件從光密度值定量分析條帶。

1.3.8免疫熒光檢測Claudin-5/NF-κB的表達(dá) 將bEnd.3細(xì)胞培養(yǎng)在24孔板上,4%多聚甲醛固定15 min,0.1% Triton-X 100滲透10 min,3%牛血清白蛋白封閉細(xì)胞1 h,加入Claudin-5和NF-κB/p65一抗孵育。用PBS洗滌細(xì)胞3次,加入抗兔Alexa Fluor?488、抗兔Alexa Fluor?555于37 ℃孵育30 min。PBS輕洗3次,Hoechst 33258孵育5 min。PBS洗滌細(xì)胞3次后熒光顯微鏡下拍照。

2 結(jié)果

2.1 藥物對OGD/R 損傷bEnd.3 細(xì)胞TEER值及Na-Flu透過的影響如Tab 2所示,與control比較,OGD/R組能明顯降低bEnd.3細(xì)胞的電阻值(P<0.01),增加Na-Flu透過率(P<0.01);與OGD/R比較,XNST(1、10 mg·L-1)及化合物Ⅱ-14A、Ⅱ-5A、protodioscin均能明顯增加損傷bEnd.3細(xì)胞的電阻值(P<0.01),降低Na-Flu透過率(P<0.01)。

Tab 2 Effect of drugs on TEER and Na-Flu permeability in damaged bEnd.3

2.2 藥物對OGD/R 損傷bEnd.3 細(xì)胞Claudin-5熒光表達(dá)的影響如Fig 2顯示,control組Claudin-5熒光表達(dá)較強,且內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu)完整;與control組比較,OGD/R組Claudin-5的熒光強度明顯降低,細(xì)胞間緊密連接破壞(P<0.01);與OGD/R組比較,XNST及化合物Ⅱ-14A、Ⅱ-5A、protodioscin均能增強Claudin-5熒光表達(dá),改善細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu)(P<0.05);與XNST組比較,化合物Ⅱ-5A、protodioscin能明顯增加Claudin-5熒光表達(dá)(P<0.05)。

Fig 1 Structural formula of three monomer compounds

2.3 藥物對OGD/R 損傷bEnd.3 細(xì)胞Claudin-5/Occludin/ZO-1 mRNA影響如Tab 3所示,與control組比較,OGD/R組能明顯降低bEnd.3細(xì)胞Claudin-5、Occludin、ZO-1的mRNA表達(dá)(P<0.01);與OGD/R組比較,XNST、化合物Ⅱ-14A、Ⅱ-5A、protodioscin能明顯增加Claudin-5的mRNA表達(dá)(P<0.01),XNST能明顯增加Occludin的mRNA表達(dá)(P<0.05),protodioscin能明顯增加ZO-1的mRNA表達(dá)(P<0.01);與XNST組比較,化合物Ⅱ-14A、Ⅱ-5A、protodioscin能明顯增加Claudin-5的mRNA表達(dá)(P<0.05),protodioscin能明顯增加ZO-1的mRNA表達(dá)(P<0.01)。

Tab 3 Effect of drugs on Claudin-5/Occludin/ZO-1 mRNA in OGD/R-damaged bEnd.3

2.4 藥物對OGD/R 損傷bEnd.3 細(xì)胞Claudin-5/Occludin/ZO-1 蛋白表達(dá)影響如Fig 3所示,與control組比較,OGD/R組能明顯降低bEnd.3細(xì)胞Claudin-5、Occludin、ZO-1的蛋白的表達(dá)(P<0.05);與OGD/R組比較,XNST能明顯增加bEnd.3細(xì)胞Claudin-5、Occludin的蛋白表達(dá)(P<0.05),化合物Ⅱ-14A、Ⅱ-5A明顯增加bEnd.3細(xì)胞Claudin-5、Occludin、ZO-1的蛋白表達(dá)(P<0.05),protodioscin明顯增加bEnd.3細(xì)胞Claudin-5、ZO-1的蛋白表達(dá)(P<0.01);與XNST組比較,化合物Ⅱ-5A、protodioscin能明顯增加Claudin-5的蛋白表達(dá)(P<0.01),Ⅱ-14A、Ⅱ-5A、protodioscin能明顯增加ZO-1的蛋白表達(dá)(P<0.01)。

Fig 3 Effect of drugs on expression of tight junction protein in bEnd.3 cells under OGD/R n=3)

2.5 藥物對OGD/R 損傷bEnd.3 細(xì)胞MAPK蛋白磷酸化表達(dá)的影響如Fig 4所示,與control組比較,OGD/R組能明顯增加JNK、p38、ERK1/2磷酸化水平(P<0.01);與OGD/R組比較,XNST明顯降低了p-JNK水平升高(P<0.05),但p-p38和p-ERK1/2沒有降低。與OGD/R比較,化合物Ⅱ-5A和protodioscin治療明顯降低p-JNK、p-p38和p-ERK1/2表達(dá)水平(P<0.05),化合物Ⅱ-14A對p-JNK、p-p38和p-ERK1/2水平?jīng)]有明顯影響。與XNST組比較,化合物Ⅱ-5A、protodioscin能明顯抑制ERK1/2蛋白磷酸化表達(dá)(P<0.01)。

Fig 4 Effect of drugs on phosphorylation expression of MAPK protein in OGD/R injury bEnd.3 cells n=3)

2.6 藥物對OGD/R 損傷bEnd.3 細(xì)胞NF-κB的核轉(zhuǎn)位的影響免疫熒光染色檢測NF-κB的主要亞基p65是否被轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi),判斷NF-κB是否被激活。免疫熒光結(jié)果如Fig 5所示,與control組比較,OGD/R組NF-κB/p65的核轉(zhuǎn)位明顯增加;與OGD/R組比較,XNST、Ⅱ-14A、Ⅱ-5A和protodioscin均能明顯抑制NF-κB/p65的核轉(zhuǎn)位;與XNST組比較,protodioscin能明顯抑制NF-κB/p65核轉(zhuǎn)位(P<0.01)。

2.7 藥物對OGD/R 損傷bEnd.3 細(xì)胞NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響如Fig 6所示,與Control組比較,OGD/R組細(xì)胞核中核NF-κB/p65水平明顯升高(P<0.01),bEnd.3細(xì)胞質(zhì)中IκBα和IKK的磷酸化水平明顯增加(P<0.01);與OGD/R組比較,XNST、Ⅱ-14A、Ⅱ-5A和protodioscin的NF-κB / p65易位以及IκBα和IKK蛋白磷酸化明顯降低(P<0.01);與XNST組比較,protodioscin能明顯抑制IKK蛋白磷酸化(P<0.01)。

Fig 6 Effect of drugs on NF-κB protein expression in OGD/R injury bEnd.3 cells n=3)

3 討論

既往研究和臨床試驗均證實,XNST對腦缺血具有明顯作用,臨床應(yīng)用于治療偏癱、語言障礙、動脈硬化等[8-9]。藥理學(xué)研究表明,XNST可通過抑制細(xì)胞凋亡和誘導(dǎo)血管生成促進急性腦缺血時MCAO/R大鼠的功能恢復(fù)[10]。BMECs具有緊密連接結(jié)構(gòu),限制細(xì)胞外物質(zhì)運輸?shù)侥X,對維持腦內(nèi)穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要[11]。BBB通透性增加可加重腦缺血后中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的發(fā)展[12]。緊密連接蛋白Claudin-5、Occludin和ZO-1是腦內(nèi)皮細(xì)胞維持緊密連接所必需的,它們可以密封相鄰內(nèi)皮細(xì)胞之間的細(xì)胞間隙,為循環(huán)分子形成選擇性通透屏障[13]。本研究結(jié)果表明,XNST及化合物Ⅱ-14A、Ⅱ-5A、protodioscin能通過增加內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接蛋白Claudin-5、Occludin和ZO-1的mRNA及蛋白表達(dá)水平,改善細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu),增加細(xì)胞間跨膜電阻及降低熒光素鈉透過性,從而促進內(nèi)皮細(xì)胞屏障完整性,其中單體化合物protodioscin對Claudin-5及ZO-1的mRNA及蛋白表達(dá)作用明顯。

BMECs屏障功能受許多復(fù)雜的細(xì)胞信號通路和分子的調(diào)節(jié)[14]。MAPK是哺乳動物細(xì)胞中的Ser/Thr蛋白激酶,即c-jun N末端激酶(JNK)、細(xì)胞外信號相關(guān)激酶(ERK1/2)和p38蛋白[15]。NF-κB信號調(diào)節(jié)各種免疫和內(nèi)皮屏障破壞的基因的表達(dá),這些信號調(diào)節(jié)主要促炎細(xì)胞因子、黏附分子和緊密連接蛋白的上調(diào)[16]。本研究結(jié)果顯示,XNST及化合物Ⅱ-14A、Ⅱ-5A、protodioscin明顯抑制JNK、ERK1/2、p38的蛋白磷酸化,抑制MAPKs信號通路激活。且能明顯抑制NF-κB核轉(zhuǎn)位,抑制IκBα和IKK的磷酸化水平,表明其能通過抑制NF-κB通路激活來抑制炎癥反應(yīng)和發(fā)揮保護內(nèi)皮細(xì)胞屏障完整性作用,其中單體化合物protodioscin對NF-κB核轉(zhuǎn)位作用明顯。

綜上所述,本研究結(jié)果表明,XNST及化合物Ⅱ-14A、Ⅱ-5A、protodioscin可改善OGD/R損傷內(nèi)皮細(xì)胞屏障完整性,穩(wěn)定細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu),其機制可能與抑制NF-κB和MAPK信號通路激活有關(guān),且單體化合物protodioscin對增加緊密連接蛋白表達(dá)及抑制NF-κB核轉(zhuǎn)位作用更為明顯。本研究結(jié)果可為XNST治療腦缺血的臨床應(yīng)用提供藥理學(xué)依據(jù),也為從植物藥中尋找具有促血腦屏障完整性腦保護作用的單體化合物提供參考。