王志強(qiáng)，蔣學(xué)劍，張 亮，曾化偉，2，張加林*

（1.江蘇湯溝兩相和酒業(yè)有限公司，江蘇連云港 222535；2.淮北師范大學(xué)，安徽淮北 235000）

大曲作為中國(guó)白酒釀造過程中物系、酶系及菌系的重要載體[1]，為白酒發(fā)酵過程提供了豐富的微生物類群、功能酶及其風(fēng)味物質(zhì)，保證了糖化和發(fā)酵作用同時(shí)進(jìn)行。大曲品質(zhì)的好壞對(duì)于白酒的生產(chǎn)具有重要影響，大量研究表明曲中微生物的組成與大曲品質(zhì)之間存在一定的關(guān)聯(lián)性[2]。

行業(yè)內(nèi)學(xué)者通過高通量測(cè)序進(jìn)行了大曲菌群多樣性的研究[3-4]，同時(shí)也分析了大曲加工過程因子與微生物的關(guān)系[5-7]。然而，由于各家白酒釀造工藝的不同，造就了大曲制作工藝的差異性，同時(shí)形成了大曲種類的多樣性，因此進(jìn)一步研究大曲微生物組成與大曲品質(zhì)之間的關(guān)聯(lián)性對(duì)白酒風(fēng)格形成的機(jī)理探究具有重要意義。

“湯溝白酒”作為中國(guó)國(guó)家地理標(biāo)志產(chǎn)品，江淮派濃香型白酒代表之一，素有“香而不艷、凈而不寡、綿而不淡、甜而不膩”的獨(dú)特風(fēng)格。為進(jìn)一步探究湯溝白酒典型風(fēng)格的形成機(jī)理，本研究從分析2批次大曲微生物與環(huán)境、理化因子的動(dòng)態(tài)變化入手，進(jìn)一步使用冗余分析（RDA）深度解析大曲微生物與與環(huán)境、理化因子的關(guān)系，以期為大曲品質(zhì)提升提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

樣品收集：“湯溝”大曲于7 月份（H，中高溫曲）或8 月份（M，中溫曲）開始生產(chǎn)，樣品從江蘇湯溝兩相和酒業(yè)有限公司的實(shí)驗(yàn)車間采集。大曲樣品在四個(gè)發(fā)酵階段采集：主發(fā)酵階段的第4 天（H1 和M1），潮火期階段發(fā)酵的第12 天（H2 和M2），大火階段的第12 天（H3 和M3），以及后火階段的第32天（H4 和M4）。在存貯期還采集了3 次樣品：第1個(gè)月（H5 和M5）、第2 個(gè)月（H6 和M6）和第3 個(gè)月（H7 和M7）。每個(gè)樣品隨機(jī)抽取五塊大曲塊，粉碎并混合在一起進(jìn)行測(cè)定。

試劑：無(wú)菌PBS緩沖液，苯酚，氯仿。

儀器設(shè)備：安捷倫2100 生物分析儀，美國(guó)安捷倫；Quabit 2.0 熒光計(jì)，美國(guó)加利福尼亞州圣地亞哥Illumina；pH 計(jì)，中國(guó)上海伊內(nèi)薩；渦流振蕩器，真空冷凍干燥儀，冰箱等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取

將大曲樣品（5 g）置于帶有無(wú)菌PBS 緩沖液（1 mL）的20 mL試管中，并添加玻璃珠。使用渦流振蕩器將混合物攪拌3 min，以300 r/min 離心勻漿5 min，收集上清液并以10000 r/min 離心5 min以收集細(xì)胞沉淀物。根據(jù)Wang等[4]的方法，使用苯酚和氯仿提取細(xì)胞沉淀物的DNA，真空冷凍干燥后溶解在無(wú)菌水中（50μL）。DNA 樣本儲(chǔ)存在-70 ℃以備使用。

1.2.2 文庫(kù)制備和Illumina MiSeq測(cè)序

使用GENEWIZ Inc.設(shè)計(jì)的一組引物從DNA（50～100 ng）中產(chǎn)生擴(kuò)增子。采用包含“CCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT”序列的上游引物和包含“GGACTACNVGGGTWTCTAATCC”序列的下游引物擴(kuò)增V3 和V4 區(qū)。通過PCR 向16S rDNA 的PCR 產(chǎn)物末端加上帶有Index 的接頭，以便進(jìn)行NGS 測(cè)序。DNA 文庫(kù)使用安捷倫2100 生物分析儀進(jìn)行驗(yàn)證，并使用Quabit 2.0 熒光計(jì)進(jìn)行定量。根據(jù)制造商的說明將DNA 文庫(kù)進(jìn)行復(fù)合并加載到Illumina MiSeq 儀器上。使用2×300 配對(duì)末端（PE）配置進(jìn)行測(cè)序。圖像分析和基址調(diào)用由MiSeq儀器中嵌入的MiSeq控制軟件（MCS）進(jìn)行。

1.2.3 環(huán)境和生化特性的測(cè)定

用溫度計(jì)測(cè)定了大曲各取樣曲塊的中心溫度（YT）和各取樣曲塊周圍的環(huán)境溫度（ET），使用濕度計(jì)測(cè)量每個(gè)采樣點(diǎn)周圍的環(huán)境濕度（EH）。根據(jù)105 ℃下的干/濕重量測(cè)量方法測(cè)定每個(gè)樣品的含水量（WT）。使用pH 計(jì)測(cè)量蒸餾水（10 mL）中每個(gè)大曲樣品（1 g）的pH 值。大曲糖化力（SP）和發(fā)酵力（FP）的測(cè)定參考中華人民共和國(guó)輕工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，SP單位定義為1 g大曲淀粉在35 ℃和pH 4.6下水解1 h 產(chǎn)生的葡萄糖量，表示為mg/g·h；FP 單位定義為糖化溶液在30 ℃下發(fā)酵0.5 g大曲72 h而損失的重量，表示為g/100 g·72 h。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)做了3 次重復(fù)，計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，并使用Student t 檢驗(yàn)評(píng)估顯著差異。P 值為雙尾，P＜0.05 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用SPSS13.0 for Windows（SPSS Inc）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

根據(jù)OTU 分析結(jié)果，對(duì)不同分類級(jí)別的樣本進(jìn)行分類分析，以獲得目和屬級(jí)別的群落結(jié)構(gòu)圖。貝塔多樣性分析用于比較不同樣本之間物種多樣性（群落組成和結(jié)構(gòu)）的差異。根據(jù)距離矩陣，采用算術(shù)平均無(wú)權(quán)對(duì)分組法（UPGMA）建樹，得到多個(gè)距離上樣本（含分組信息）的主成分分析（PCA）圖。使用Canoco 4.5進(jìn)行RDA分析，以評(píng)估屬級(jí)微生物群與環(huán)境和生化特征之間的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 環(huán)境和生化變量的時(shí)間變化

每天測(cè)定環(huán)境變量，結(jié)果如圖1 所示。總的來說，兩個(gè)批次的環(huán)境濕度先降低后升高，除第15天、第23～28 天和第35 天的發(fā)酵階段外，8 月曲的濕度相對(duì)高于7 月曲。兩個(gè)批次的濕度和樣品溫度先升高后降低，除第1 天外，7 月曲的相對(duì)濕度相對(duì)高于8 月曲，發(fā)酵第4 天至第30 天7 月曲的樣品溫度相對(duì)高于8 月曲，發(fā)酵第23 天和第24 天時(shí)，7月曲的最高溫度為52 ℃，發(fā)酵第35 天時(shí)，8 月曲的最高溫度為46 ℃。顯然，相對(duì)較高的樣品溫度與相對(duì)較高的相對(duì)濕度有關(guān)。

圖1 兩批大曲的的環(huán)境和理化指標(biāo)的變化

從發(fā)酵第4 天到發(fā)酵第32 天，兩批大曲的水分含量急劇下降，在貯藏期的1 個(gè)月、2 個(gè)月和3 個(gè)月，水分含量略有下降。發(fā)酵0 d 時(shí)pH 值為6.37 和6.48，發(fā)酵過程中pH 值先降低后升高，最終pH 值穩(wěn)定在6.82～6.86 之間。貯藏期pH 值有波動(dòng)，8 月曲和7 月曲的pH 值分別在6.4～6.86 和5.70～6.82之間。兩批大曲的糖化力值先上升后下降，穩(wěn)定在190～240 mg/g·h（7 月曲）和440～530 mg/g·h（8 月曲）。發(fā)酵力在發(fā)酵過程中先上升后下降，在0.24～0.37 g/100 g·72 h（8月曲）和0.26～0.32 g/100 g·72 h（7月曲）的低水平下穩(wěn)定。除發(fā)酵第4天外，7月曲的糖化力顯著低于8 月曲，發(fā)酵力除第12 天外差異不顯著。結(jié)果表明，糖化力與發(fā)酵力無(wú)明顯相關(guān)性。

2.2 大曲樣品細(xì)菌菌群多樣性和稀釋曲線

從表1 以及圖2 發(fā)現(xiàn)，中溫大曲樣本的覆蓋率指數(shù)Coverage 平均值為99.67%，高溫大曲樣本的覆蓋率指數(shù)Coverage 平均值為99.95%，后者Coverage 平均水平偏高。雖然未達(dá)到飽和狀態(tài)，但隨著測(cè)序深度增加，新物種檢測(cè)出的數(shù)量減少，曲線基本趨于平穩(wěn)。說明樣本的測(cè)序深度滿足要求，大曲中主要的微生物種類都能夠檢測(cè)到。

圖2 兩批大曲的細(xì)菌群落的稀疏曲線

表1 兩批次據(jù)大曲細(xì)菌群落測(cè)序數(shù)以及α-多樣性分析

結(jié)合表1 以及圖2 可知，發(fā)酵過程中細(xì)菌群落物種豐富度與多樣性隨著發(fā)酵時(shí)間的變化而改變。中溫大曲發(fā)酵過程初期，樣本中細(xì)菌群落的豐富度和多樣性明顯較其他樣本低，說明新鮮曲坯中細(xì)菌種類較少；隨著大曲發(fā)酵的進(jìn)行，細(xì)菌群落的豐富度和多樣性逐漸增加，且多樣性在發(fā)酵后期（32 d）達(dá)到最大值，這說明環(huán)境中的微生物在大曲中富集，且大曲中存在的細(xì)菌開始適應(yīng)環(huán)境，充分利用原料中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)快速生長(zhǎng)繁殖，隨后在貯藏初期，細(xì)菌的多樣性開始降低，在貯藏2 個(gè)月達(dá)到最小值。分析上述現(xiàn)象原因：（1）微生物在大曲制作前期迅速生長(zhǎng)繁殖，并產(chǎn)生大量次級(jí)代謝產(chǎn)物，尤其是酸類物質(zhì)，這些酸類物質(zhì)會(huì)抑制酸性敏感細(xì)菌的生長(zhǎng)；（2）大曲發(fā)酵前期微生物的生長(zhǎng)代謝活動(dòng)會(huì)產(chǎn)生大量的生物熱；中溫大曲發(fā)酵品溫控制在50～60 ℃之間，因此，大曲中不耐熱微生物的生長(zhǎng)受到抑制或是逐漸消亡；（3）在貯藏時(shí)期，細(xì)菌群落的豐富度和多樣性開始下降，這很可能是由于溫度開始回落，大曲中原本適應(yīng)高溫環(huán)境的細(xì)菌受到抑制。

2.3 中、高溫大曲發(fā)酵過程中細(xì)菌群落在屬水平的結(jié)構(gòu)組成以及動(dòng)態(tài)變化

中溫大曲發(fā)酵過程中細(xì)菌群落分析，從圖3（a）中可以發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌群落主要由7 個(gè)屬構(gòu)成（相對(duì)豐度＞0.5 %）：乳桿菌屬（Lactobacillus）、魏氏菌屬（Weissella）、克羅諾桿菌屬（Cronobacter）、泛菌屬（Pantoea）、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、葡萄球菌屬（Staphylococcus），其相對(duì)豐度之和平均為89.4 %。乳桿菌屬（Lactobacillus）、魏氏菌屬（Weissella）作為主要的菌屬在整個(gè)發(fā)酵及貯存過程中處于優(yōu)勢(shì)地位，其中乳桿菌屬（Lactobacillus）較為特殊，作為發(fā)酵初期豐度最高的菌屬，隨著發(fā)酵的進(jìn)行其相對(duì)豐度顯著降低，22 d 后其相對(duì)豐度保持在21.7 %以下。這說明大曲的發(fā)酵環(huán)境對(duì)外源微生物是有選擇壓力的，由于大曲的制作過程是采用生料發(fā)酵，在發(fā)酵初期，很多原料中優(yōu)勢(shì)菌并不能直接利用生料，因此其生長(zhǎng)會(huì)受到抑制，初步推斷其可能為不耐熱菌，隨著發(fā)酵進(jìn)行，微生物的生長(zhǎng)代謝會(huì)產(chǎn)生大量的熱，大曲的品溫快速升高，通過采用通風(fēng)等物理方法，使大曲品溫（50～60 ℃）維持一段時(shí)間，不耐熱的細(xì)菌會(huì)逐漸被其他耐熱細(xì)菌替代。在貯藏時(shí)期溫度恢復(fù)正常后，該菌又逐步恢復(fù)較高值、豐度值有很好的體現(xiàn)。克羅諾桿菌屬（Cronobacter）在發(fā)酵過程中迅速成為主要的優(yōu)勢(shì)菌群，尤其是發(fā)酵中后期，保持在較高的水平24.6%，在貯存期保持在較低的水平（相對(duì)豐度＜3.0 %）。泛菌屬（Pantoea）在發(fā)酵和貯藏過程中，隨著發(fā)酵的進(jìn)行其相對(duì)豐度顯著增加，發(fā)酵后期達(dá)10.5%，當(dāng)開始貯藏放置時(shí)，相對(duì)豐度明顯降低，直至貯藏后期豐度又出現(xiàn)大幅度增加現(xiàn)象，相對(duì)豐度保持在8.9%以上?？死撞暇鷮伲↘lebsiella）與泛菌屬（Pantoea）有著相似的豐度變化趨勢(shì)。除以上5 種豐度較高的細(xì)菌外，芽孢桿菌屬（Bacillus）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）在發(fā)酵過程中，豐度呈相似穩(wěn)定的變化趨勢(shì)，在貯藏中后期迅速降低，并保持在較低的水平（相對(duì)豐度＜1.7%）。

圖3 兩批大曲的發(fā)酵過程中細(xì)菌群落在屬水平的組成

高溫大曲發(fā)酵過程中細(xì)菌群落分析，從圖3（b）中可以發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌群落分類較為豐富，主要由10 個(gè)屬構(gòu)成（相對(duì)豐度＞0.5 %），豐度較高的前8種：乳桿菌屬（Lactobacillus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）、泛菌屬（Pantoea）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、魏氏菌屬（Weissella）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、克羅諾桿菌屬（Cronobacter），其相對(duì)豐度之和平均為83.1%。乳桿菌屬（Lactobacillus）在發(fā)酵的前期和貯存后期具有較高豐度水平，尤其是貯藏后期保持在極高的水平，相對(duì)豐度達(dá)74.3 %。芽孢桿菌屬（Bacillus）在發(fā)酵過程中迅速成為主要的優(yōu)勢(shì)菌群，尤其是發(fā)酵中后期，保持在較高的水平40.0 %，在貯存期保持在較低的水平（相對(duì)豐度＜1.2%）?？死撞暇鷮伲↘lebsiella）和泛菌屬（Pantoea）作為主要的菌屬在整個(gè)發(fā)酵及貯存過程中處于優(yōu)勢(shì)地位。葡萄球菌屬（Staphylococcus）在發(fā)酵過程初期迅速成為優(yōu)勢(shì)菌群，尤其是發(fā)酵中后期，保持在較高的水平，最高豐度值達(dá)19.3 %，在貯存期保持在較低的水平（相對(duì)豐度＜3.2 %）。魏氏菌屬（Weissella）占比不大，菌群發(fā)展趨勢(shì)類似于乳桿菌屬（Lactobacillus）的變化趨勢(shì)。不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、克羅諾桿菌屬（Cronobacter）的菌群發(fā)展趨勢(shì)類似于芽孢桿菌屬（Bacillus）的變化趨勢(shì)。

2.4 兩批次大曲的菌群差異性分析

通過LEfSe 分析發(fā)現(xiàn)（圖4），Pseudomonas_sp_Mexd38、Morganella、Morganella及Latobacillales、Lactobacillaceae、Lactobacillus_pontis、Leuconostocaceae、Weissella、uncultured bacteriumWeissella在兩批次樣品中有顯著差異。

圖4 兩批大曲的大曲發(fā)酵過程中細(xì)菌LEfSe分析

2.5 細(xì)菌群落與環(huán)境生化指標(biāo)的相關(guān)性研究

RDA 分析是一種約束排序，用于分析優(yōu)勢(shì)細(xì)菌的相對(duì)豐度（屬級(jí)）與環(huán)境和生化變量之間的關(guān)系（圖5）。虛線從中心點(diǎn)到細(xì)菌點(diǎn)的箭頭銳角表示細(xì)菌群落與相應(yīng)的環(huán)境或生化變量有正相關(guān)性，鈍角表示負(fù)相關(guān)性。在發(fā)酵階段，兩批大曲中樣品溫度、室溫與Acinetobacter、Staphylococcus、Cronobacter、Pantoea呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，Lactobaclius與樣品溫度、室溫呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。整個(gè)培養(yǎng)過程中，兩批大曲的發(fā)酵力與Klebsiella菌有負(fù)相關(guān)關(guān)系。

圖5 細(xì)菌群落與環(huán)境和生化變量之間的相關(guān)性

3 結(jié)論

本研究揭示了兩批次大曲制備過程中環(huán)境、理化指標(biāo)及細(xì)菌群落的動(dòng)態(tài)變化。中溫大曲主要的菌 群Lactobacillus、Weissella、Cronobacter豐度較高，高溫大曲主要的菌群Lactobacillus、Bacillus、Klebsiella、Pantoea、Staphylococcus豐度較高。總體上，Lactobacillus（乳桿菌屬）是發(fā)酵前階段最豐富的原核菌屬，發(fā)酵后期其豐度有下降，經(jīng)過三個(gè)月貯藏后Lactobacillus（乳桿菌屬）豐度上升。在兩批大曲制備過程中，溫度是控制細(xì)菌群落的重要因素，發(fā)酵力與Klebsiella呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。通過LEfSe 分析兩批大曲的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)了顯著性差異標(biāo)志性的細(xì)菌種。本研究加深了對(duì)大曲制備的理論認(rèn)識(shí)（包括貯藏可能功能的鑒定、兩批大曲細(xì)菌差異、菌群變化和因子關(guān)聯(lián)性等），為提高大曲質(zhì)量提供了潛在的控制方法。