蔣智勇，謝建平

綜 述

分枝桿菌T7SS(ESX)分泌系統(tǒng)功能研究進展

蔣智勇，謝建平

西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院現(xiàn)代生物醫(yī)藥研究所，重慶 400715

分枝桿菌感染宿主后能夠通過分泌至胞外的效應(yīng)蛋白去影響宿主的免疫功能，其中ESX (或VII型)系統(tǒng)在效應(yīng)蛋白分泌方面發(fā)揮了重要作用。ESX分泌系統(tǒng)是分枝桿菌和許多放線菌中的蛋白質(zhì)輸出系統(tǒng)，但目前ESX系統(tǒng)如何將底物運輸穿過外膜的分子機制以及調(diào)控機制尚不清楚。本文對ESX系統(tǒng)的組成、功能、分類以及將底物運輸至周質(zhì)空間的相關(guān)研究進展展開了綜述，并探討了ESX系統(tǒng)在抗生素耐藥、持留及與宿主-噬菌體相互作用中的功能，以及作為新藥物靶標(biāo)的潛力，以期為結(jié)核病新藥物和疫苗抗原的發(fā)現(xiàn)提供新的見解。

ESX系統(tǒng)；分枝桿菌；膜復(fù)合體；抗生素；毒力因子

許多致病菌通過分泌的效應(yīng)蛋白影響宿主免疫功能，從而促進自身的存活。分枝桿菌多數(shù)蛋白通過Sec和Tat途徑分泌，不少毒力因子也通過其他分泌系統(tǒng)分泌。分枝桿菌 VII分泌系統(tǒng) (type VII secretion systems，T7SSs)，也稱作ESX(ESAT6 protein family secretion systems)系統(tǒng)，能夠?qū)⒍喾N不同的毒力蛋白轉(zhuǎn)運通過細(xì)胞膜。VII分泌系統(tǒng)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)近20年，ESX系統(tǒng)共發(fā)現(xiàn)有5種不同的亞型，分別為ESX-1、ESX-2、ESX-3、ESX-4、ESX-5[1]。該系統(tǒng)可以將底物從胞質(zhì)運輸?shù)桨猓┻^復(fù)雜的細(xì)胞膜，且不會停留在周質(zhì)空間中，這與Tat和Sec分泌途徑不同。ESX系統(tǒng)最初發(fā)現(xiàn)的功能是它的毒力因子作用，能夠逃避和修飾宿主的免疫，但是近些年研究發(fā)現(xiàn)該系統(tǒng)及其底物還存在其他的作用，如水平基因轉(zhuǎn)移，營養(yǎng)物質(zhì)和代謝物的攝取等[2]，在致病分枝桿菌中的生活史中十分重要，也是新藥物以及疫苗開發(fā)的主要方向之一。因此，了解ESX系統(tǒng)結(jié)構(gòu)及功能有助于研發(fā)控制分枝桿菌()感染引起的疾病。本文綜述了分枝桿菌的ESX系統(tǒng)的組成、功能及底物的運輸過程，以及ESX系統(tǒng)在抗生素耐藥、持留及與宿主-噬菌體相互作用中的功能，特別是作為新藥物靶標(biāo)的潛力。

1 ESX系統(tǒng)分類

分枝桿菌具有5個ESX系統(tǒng)，其中ESX-2的研究比較少[3]。ESX-4系統(tǒng)是最古老的系統(tǒng)，其他4個ESX系統(tǒng)是通過基因復(fù)制、基因多樣化(diversification)和基因水平轉(zhuǎn)移產(chǎn)生的類ESX-4系統(tǒng)(表1)。ESX-2與ESX-5進化同源性較高，它們都是在ESX-1產(chǎn)生后通過質(zhì)粒介導(dǎo)的基因水平轉(zhuǎn)移產(chǎn)生[4]。

ESX-1是最早被發(fā)現(xiàn)的VII型分泌系統(tǒng)。在致病菌中，它能夠破裂吞噬體膜，因此能夠移動到宿主胞質(zhì)中。ESX-1突變的細(xì)菌則會被滯留在吞噬體的隔間中[5]。ESX-1還可介導(dǎo)細(xì)菌DNA片段引起的I型干擾素分泌[6]。其次，ESX-1有助于肉芽腫的形成，促進分枝桿菌的持留與后續(xù)傳播。將Esx-1完全敲除會導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌與海分枝桿菌的溶血活性喪失[7]。在非致病菌中，ESX-1作用不同，它可以與ESX-4協(xié)同作用，能夠單向的將大片段的染色體DNA轉(zhuǎn)移，引起水平基因的轉(zhuǎn)移[8]。在受體菌中，ESX-1和ESX-4都是必需的，但在供體菌中，ESX-4不是必需的[4]。

ESX-3可能在調(diào)節(jié)宿主免疫中其重要作用，它可能與鐵離子和鋅離子攝取相關(guān)，并且能干擾宿主胞內(nèi)的免疫[9]。在結(jié)核分枝桿菌中，的轉(zhuǎn)錄以及其他相關(guān)與鐵離子吸取的基因被IdeR負(fù)調(diào)控，并且結(jié)核分枝桿菌中的小RNA MTS1338能夠上調(diào)ESX系統(tǒng)中3和(ESX conserved com-ponent)的表達[10]。此外，ESX-3系統(tǒng)與生物被膜的形成相關(guān)，敲除會導(dǎo)致生物被膜無法形成，也會導(dǎo)致恥垢分枝桿菌出現(xiàn)嚴(yán)重的生長缺陷[11]。

ESX-4被認(rèn)為最古老的ESX系統(tǒng)，目前研究尚未清楚。在多數(shù)物種中，ESX-4缺乏存在于其他ESX系統(tǒng)中的保守基因，例如和，以及保守的系統(tǒng)組分EspG和EccE[4]。在恥垢分枝桿菌()中，ESX-4與水平基因轉(zhuǎn)移相關(guān)。在膿腫分枝桿菌中，ESX-4與毒力作用相關(guān)。在海分枝桿菌中，ESX-4能夠影響肌動蛋白細(xì)胞骨架的重排從而影響巨噬細(xì)胞的吞噬作用，并且發(fā)現(xiàn)敲除EccD4能夠提高ESX-1與ESX-5底物的分泌[12]，體現(xiàn)了ESX系統(tǒng)的進化淵源。

ESX-5存在于緩慢生長的分枝桿菌中，與營養(yǎng)攝取以及免疫修飾蛋白的分泌相關(guān)。在海分枝桿菌中，ESX-5涉及脂肪酸的攝取與利用[4]。低磷酸條件下，結(jié)核分枝桿菌通過Pst-SenX3-RegX3系統(tǒng)上調(diào)了ESX-5的表達[13]。此外，ESX-5系統(tǒng)與分枝桿菌的細(xì)胞壁完整性以及毒力相關(guān)，可以通過減弱外膜的通透性來降低對ESX-5的需求[14]。突變ESX-5系統(tǒng)中的PE相關(guān)基因?qū)е路种U菌的毒性減弱以及在巨噬細(xì)胞中的存活能力下降[15]。而與則是結(jié)核分枝桿菌存活的必需基因，轉(zhuǎn)座子突變這兩個基因會導(dǎo)致分枝桿菌的死亡，當(dāng)導(dǎo)入與的重組質(zhì)粒時，敲除系統(tǒng)不會引起分枝桿菌的死亡[11]。但Tiwari等[16]將基因簇敲除后，結(jié)核分枝桿菌能夠存活，但是毒性大幅度降低。將Δ系統(tǒng)的結(jié)核分枝桿菌?異種BCG作為增強免疫方案，顯著增強了豚鼠()在感染分枝桿菌的存活率，表明ESX-5系統(tǒng)具有作為疫苗研發(fā)新靶標(biāo)的潛力[16]。

2 Esx底物

Esx的底物分為3類，這些底物都具有WxG和YxxxD/E基序(X代表任意氨基酸)。第一類是Esx蛋白，Esx蛋白是一種異源二聚物蛋白，總長約為100個氨基酸，具有保守的WxG基序位于2個α螺旋之間。它的配體蛋白在C端具有保守的YxxxD/E基序，是分泌所必需的[17]。目前研究比較多的是EsxA/EsxB (表2)。第二類是PE與PPE蛋白，PE與PPE蛋白在N端具有保守的脯氨酸和谷氨酸，在C端是多變的，保守的PE與PPE結(jié)構(gòu)域長度為110或180氨基酸[9]。此外，除了ESX-4，其他ESX系統(tǒng)中都存在與基因簇。PE與PPE結(jié)構(gòu)與Esx蛋白結(jié)構(gòu)類似，具有WXG基序，且在C端也具有YXXXD/E基序。部分PE與PPE蛋白可能與ESX系統(tǒng)分泌至外膜的通道形成相關(guān)[9]。第三類是Esp (ESX-specific protein)蛋白，這類蛋白是ESX-1系統(tǒng)的特異性底物。其中EspB蛋白的結(jié)構(gòu)比較清楚，它是一種單體蛋白，被MycP1切割裂解，Esp蛋白的N端與PE/PPE蛋白高度相似，并且能形成7聚物的疏水圓環(huán)插入細(xì)胞膜中[18]。EspA,C,D蛋白由同一操縱子編碼，與ESX-1的功能相關(guān)，也與致病菌的毒力相關(guān)。其中，EspE,F,H與EspA,C,D類似。此外，底物形成異源二聚體的兩種配對蛋白在分泌上相互依賴，如EspC/EspA依賴于EsxA/EsxB，PE35/PPE68_1依賴于EsxA底物[19]。

表1 不同ESX系統(tǒng)的組分

3 ESX系統(tǒng)的胞漿組分

EspG蛋白是ESX系統(tǒng)在胞漿中保守的分子伴侶，存在于所有編碼PE/PPE底物的分枝桿菌基因座中。盡管不同的基因座的EspG序列的相關(guān)性低，但是結(jié)構(gòu)卻十分相似[20,21]。EspG的β2-β3環(huán)是與PE/PPE的結(jié)合位點以及區(qū)別于其他同源系統(tǒng)的關(guān)鍵因素。

EspH是存在于Esp底物的分子伴侶，結(jié)構(gòu)與YbaB類似，是EspE/EspF的分子伴侶，在感染宿主進程中發(fā)揮重要作用。但是在斑馬魚幼體中，敲除EspH卻顯著增加了海分枝桿菌的毒力[22]。

EccA是ESX系統(tǒng)胞漿中的保守組分，屬于AAA+家族蛋白(多種細(xì)胞活動相關(guān)的ATP酶)，具有類分子伴侶活性。與、一樣，存在于除外的基因座中。EccA由兩個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，C端的AAA+ATPase結(jié)構(gòu)域和由6個串聯(lián)的重復(fù)4肽構(gòu)成N端，參與蛋白與蛋白之間的互作，且EccA的N端具有調(diào)控作用，能夠調(diào)節(jié)海分枝桿菌中枝枝菌酸的合成速率[6]。

4 ESX系統(tǒng)膜復(fù)合體

ESX系統(tǒng)包含5個保守的蛋白，分別為EccB、EccC、EccD、EccE、MycP。除了ESX-4系統(tǒng)和膿腫分枝桿菌通常缺乏EccE外，其他ESX系統(tǒng)都存在這5個組分。以結(jié)核分枝桿菌中的ESX-5系統(tǒng)為例，ESX系統(tǒng)膜復(fù)合體大小為2320 kDa，通過165跨膜螺旋(transmembrane helices，TMH)，錨定在細(xì)胞內(nèi)膜上，膜組件可以理解為3個二聚體，其中每個二聚體包括單個拷貝的MycP5和兩個原體，每個原體由單拷貝的EccB5、EccC5、EccE5和兩個拷貝的EccD5組成[23]。

EccB是定位于周質(zhì)空間中的單跨膜蛋白，有延長的準(zhǔn)雙重對稱的扭曲螺旋槳結(jié)構(gòu)域，包含有疏水中心結(jié)構(gòu)域，由中心的2個β平行和兩側(cè)的兩個重復(fù)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成[24]。單體具有明顯可區(qū)分內(nèi)部與外部構(gòu)象，通常與MycP在周質(zhì)空間形成二聚體。此外，EccB的N端和α螺旋結(jié)構(gòu)能與內(nèi)膜的胞質(zhì)側(cè)平行，還能與EccD以順時針方向結(jié)合，形成類似籃子的結(jié)構(gòu)[23]。

EccD具有11個跨膜結(jié)構(gòu)域，是最疏水的膜組分，其N端的110個氨基酸結(jié)構(gòu)類似于泛素構(gòu)象(ubiquitin like domains，Ubl)，在溶液中為二聚體。ESX系統(tǒng)中通常由6個EccD的二聚體形成具有內(nèi)腔的圓形筏子，天然環(huán)境下腔內(nèi)部含有大量膜脂[23]。

EccE點位于膜復(fù)合體的外部，具有2個跨膜螺旋，并且C端的胞質(zhì)部分雖然缺乏結(jié)合位點和催化位點，但是與糖基轉(zhuǎn)移酶具有微弱的同源性，對于膜復(fù)合體的穩(wěn)定以及底物的分泌十分必要。

EccC是ATP酶，N端具有2個TMH形成二聚體，中間具有莖(stalk)結(jié)構(gòu)域，連接C端的具有4個的FtsK/SpoIIIE樣核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域(nucleotide binding domain，NBD)，是ESX系統(tǒng)中最保守的中心蛋白。FtsK/SpoIIIE ATP酶家族的成員形成六聚體，形成了3個4-TMH束，這些束通過疏水相互作用結(jié)合在一起，有效地密封了被EccB包圍的膜復(fù)合體的中心空間。此外每個束中的EccC-TMH與內(nèi)部的EccB結(jié)合，從而不與外部的EccB發(fā)生作用[23]。EccC具有可塑性，它的存在狀態(tài)與ESX膜復(fù)合體的開放程度相關(guān)[25]。

MycP是一種膜結(jié)合，類似于枯草芽孢桿菌蛋白酶的絲氨酸蛋白酶，并非膜復(fù)合體的核心組分，但是在放線菌中的ESX系統(tǒng)中高度保守。MycP與枯草芽孢桿菌蛋白酶不同的是，它N端具有不能夠阻塞活性位點的延伸，并且不會降解，包裹于蛋白酶結(jié)構(gòu)域表面。MycP的蛋白酶結(jié)構(gòu)域和TMH與周質(zhì)內(nèi)側(cè)EccB和鑲嵌在膜外側(cè)EccD的相互作用，更好地將周質(zhì)MycP-EccB組裝錨定在膜上，同時也穩(wěn)定了二聚體單元，并且通過促進MycP-MycP與內(nèi)部和外部的EccB形成交叉二聚體穩(wěn)定了整個膜復(fù)合體[23]。

5 ESX系統(tǒng)跨內(nèi)膜的可能運輸機制

5.1 中心孔隙模型

膜復(fù)合體EccC在胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的6個亞基是可塑并且失活的。Esx底物與第三個NBD(D3)結(jié)合，降低了EccC的可塑性，并且組裝成帶有3個NBD的六聚物。同時，第二個結(jié)合事件發(fā)生在LINKER-2結(jié)構(gòu)域(LINKER-2結(jié)構(gòu)域?qū)BD1和NBD2連接在一起)，它與PE/PPE或與它們作用的分子伴侶結(jié)合，將LINKER-2與NBD1分離，解除對NBD1的抑制活性，從而激活膜復(fù)合體。此外，第二個結(jié)合事件還能促使EccB的構(gòu)象發(fā)生改變，允許膜復(fù)合體能夠通過轉(zhuǎn)運的蛋白。底物EsxB同源二聚體能夠促進EccC的寡聚化，但是不足以使ATP酶激活，還需要將D1結(jié)構(gòu)域鄰近的精氨酸指結(jié)構(gòu)寡聚化才能激活，但是EsxA卻具有抗EccC寡聚化作用。在激活過程中，EccC從延伸的構(gòu)象轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂蠥TP酶活性的水桶結(jié)構(gòu)，重排了大量的NBD結(jié)構(gòu)域，當(dāng)EccC的NBD從原來位點移向Ubl錨定的平臺以及本身具有ATP酶活性時，能夠促使膜復(fù)合體孔的開放[2,25,26]。

5.2 煽動者模型

煽動者轉(zhuǎn)運模型是中心孔隙模型的變體，主要區(qū)別是EccA作為分泌的煽動者。EccA四肽重復(fù)結(jié)構(gòu)域裝載Esx底物，它本身具有ATP酶的活性為底物進入ATP酶水桶中提供能量。EccA與D3六聚體尺寸能夠兼容，與EccA結(jié)合能夠穩(wěn)定D3結(jié)構(gòu)域的活性。這種模型只在特定的條件下發(fā)揮作用[26]。

5.3 原體孔隙模型

EccD二聚物作為在6個原體中的分泌孔，EccD孔隙幾乎完全疏水并且被脂質(zhì)堵住，具有親水性表面的基質(zhì)不太可能通過。PPE底物可以插入EccD孔隙中并且不會被排斥，然后引起EccD構(gòu)象的改變，可能是PE-PPE復(fù)合體在LINKER-2的結(jié)合位點與EccD孔隙鄰近，然后引起了EccC的NBD結(jié)構(gòu)域或D1結(jié)構(gòu)域重排導(dǎo)致了EccD孔隙發(fā)生移動。6對PE-PPE底物通過原體孔的同時會有1對Esx底物通過中心孔[26]。

6 ESX系統(tǒng)跨外膜的可能運輸機制

由于ESX系統(tǒng)的大小不足以跨過外膜(outer membrane，OM)，說明底物通過OM存在其他的機制，可能是由于OM轉(zhuǎn)運部分與核心膜復(fù)合體部分作用不夠穩(wěn)定，共純化無法將OM轉(zhuǎn)運部分分離出來。有研究發(fā)現(xiàn)EsxE/EsxF可以通過WXG基序與細(xì)胞膜發(fā)生作用，形成異源低聚物的跨膜孔，允許外毒素CpnT通過OM。此外，PE38/PPE7是分泌許多ESX-5系統(tǒng)底物所必需的，推測PE38/PPE71與外膜分泌ESX-5系統(tǒng)底物的機制有關(guān)[28]。鑒于底物依賴的共同轉(zhuǎn)運機制，推測ESX系統(tǒng)特異性的底物很可能介導(dǎo)了跨OM的過程[2,25,27]。

7 ESX系統(tǒng)的調(diào)控

ESX系統(tǒng)的調(diào)控與雙組分系統(tǒng)相關(guān)(two component system，TCS)。結(jié)核分枝桿菌被吞噬體吞噬之后，PhoPR雙組分系統(tǒng)的PhoR感受環(huán)境pH的改變，活化同源反應(yīng)調(diào)節(jié)器PhoP，上調(diào)基因簇上游操縱子的表達(圖1)，破裂吞噬體，促進結(jié)核分枝桿菌的胞內(nèi)存活[28]。雙組分系統(tǒng)MprAB能調(diào)控操縱子對細(xì)胞表面壓力變化的應(yīng)答[29]。操縱子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控間接影響基因簇中編碼的蛋白質(zhì)的分泌，因為Esp和Esx-1蛋白的分泌相互依賴。EspR、Phop和MprA的調(diào)控序列位于啟動子區(qū)域，與RD8區(qū)域重疊[29]。

轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)ESX系統(tǒng)，ESX膜復(fù)合體會誘導(dǎo)的表達，會誘導(dǎo)Esx底物的表達，從而防止Esx底物在胞質(zhì)中積累。當(dāng)ESX復(fù)合體缺乏時，不會誘導(dǎo)表達，從而防止Esx底物的積累。其中EspE和EspF在的自動調(diào)整中發(fā)揮了重要作用[17,19]。

圖1 VII型分泌系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)模型

PhoPR雙組分系統(tǒng)感應(yīng)pH改變，上調(diào)操縱子的表達，促進Esx底物的積累并分泌至胞外，破裂吞噬體膜。ESX系統(tǒng)還存在負(fù)反饋調(diào)節(jié)機制，通過調(diào)節(jié)Esx底物的含量。

8 ESX系統(tǒng)與抗生素的關(guān)系

針對ESX系統(tǒng)進行抗生素作用機理或者新藥研發(fā)的工作較少，但分析NIH各種化合物處理結(jié)核分枝桿菌后的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)[30]，靶向細(xì)胞壁的抗生素(表3)下調(diào)大部分Esx底物編碼基因的表達(圖2A)，但是部分ESX系統(tǒng)組分基因的表達也上調(diào)，推測可能是細(xì)胞壁上存在ESX系統(tǒng)膜復(fù)合體的感應(yīng)元件，能夠讓細(xì)菌感知ESX膜復(fù)合體的含量。但是由于細(xì)胞壁合成受阻，ESX系統(tǒng)膜復(fù)合體的感應(yīng)元件無法正常定位，無法向細(xì)菌傳遞飽和的信號，導(dǎo)致細(xì)菌持續(xù)表達膜復(fù)合體相關(guān)基因，從而導(dǎo)致相關(guān)組分基因的表達上調(diào)。其次，由于存在的負(fù)反饋機制，在感知膜復(fù)合體成分不足時，底物的表達量也降低，從而導(dǎo)致多數(shù)ESX系統(tǒng)底物基因的表達下調(diào)。纈氨霉素上調(diào)ESX-4中的膜復(fù)合體組分相關(guān)基因表達，表明ESX-4系統(tǒng)在結(jié)核分枝桿菌中的作用可能與氧化磷酸化相關(guān)，這需要進一步驗證。靶向核糖體的抗生素下調(diào)幾乎所有ESX系統(tǒng)組分的表達，但上調(diào)少數(shù)ESX系統(tǒng)底物的表達，這種明顯差異調(diào)控的具體原因尚不清楚。此外，Ioerger等[31]基于全細(xì)胞篩選，并且通過耐藥突變的全基因組測序和重組工程技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了EccB3能夠?qū)θ?xì)胞活性化合物1產(chǎn)生抗性(圖2B)，表明化合物1可能作為新抗生素的骨架[31]。

Rybniker等[32]發(fā)現(xiàn)苯并噻吩類抑制劑BTP15能夠通過抑制組氨酸激酶活性，解除對操縱子的調(diào)控，影響EsxA的分泌。這表明ESX系統(tǒng)可能作為新藥物靶標(biāo)[32]。

表3 抗生素作用靶標(biāo)

9 ESX系統(tǒng)在噬菌體感染中的作用

耐藥細(xì)菌是細(xì)菌感染治療的難點，而噬菌體治療可克服細(xì)菌的耐藥且具有高度的特異性，是感染控制的一重要方向。Chatterjee等[33]發(fā)現(xiàn)糞腸球菌()感染噬菌體后，會誘導(dǎo)ESX系統(tǒng)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，引起了細(xì)菌對于非噬菌體靶點的非親屬細(xì)菌細(xì)胞的拮抗作用，這說明噬菌體治療會改變微生物群落。此外，他們還發(fā)現(xiàn)在亞致死濃度的靶向膜損傷的抗生素也會引起這種效應(yīng)[33]。通過對龜分枝桿菌感染BP原噬菌體轉(zhuǎn)錄組的分析，發(fā)現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)錄明顯上調(diào)(表4)，這與Chatterjee等[34]的結(jié)論一致。

10 ESX系統(tǒng)與宿主的相互作用

通過分析感染結(jié)核分枝桿菌ΔRD1與WT的巨噬細(xì)胞48 h轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(GSE132283)[35]發(fā)現(xiàn)：等基因的表達顯著下調(diào)(圖3A)。其中EXT1是硫酸乙酰肝素生物合成的必需酶。硫酸乙酰肝素作為結(jié)核分枝桿菌表面蛋白肝素結(jié)合血凝素的受體，在啟動結(jié)核分枝桿菌在宿主中的持留發(fā)揮重要作用，這表明ESX-1的ΔRD1影響了分枝桿菌在宿主中的持留[36]。通過KEGG富集分析感染ΔRD1與WT結(jié)核分枝桿菌48 h后的巨噬細(xì)胞的相關(guān)炎癥因子以及免疫途徑發(fā)現(xiàn)：與WT相比，ΔRD1菌株感染的巨噬細(xì)胞的Toll-like receptor、TNF、NF-κB信號通路途徑的相關(guān)基因表達受到不同程度的影響(圖3B)，這與Hinman等[37]研究結(jié)果一致，即ESX-1通過影響吞噬體的酸化而鈍化依賴內(nèi)吞體特異性TLR2反應(yīng)的激活，影響TNF等炎癥因子的表達。

此外，ESX-1系統(tǒng)底物EsxA可以穿透多泡小體腔內(nèi)膜，有利于分枝桿菌利用胞內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)，從而促進細(xì)菌在胞內(nèi)的存活。ESCRT蛋白(endosomal sorting complex required for transport) Tsg101、Vps32和Vps4會定位于損傷處，修復(fù)被破壞的腔內(nèi)膜，但是由于分枝桿菌中的EsxA與PDIM造成的損傷是持續(xù)性的，因此僅僅依靠ESCRT的修復(fù)是僅僅不夠，此時還會通過自噬來進行修復(fù)，但是目前具體的修復(fù)機制尚不清楚。此外，還可以通過對細(xì)菌泛素化修飾從而將胞質(zhì)中的細(xì)菌作為靶標(biāo)進行自噬降解。但是上述的修復(fù)機制是通用的，在其他胞內(nèi)致病菌的感染中也存在這種修復(fù)方式[38]。膿腫分枝桿菌ESX-3底物EsxH和EsxG能夠與肝細(xì)胞生長因子調(diào)節(jié)的酪氨酸激酶底物(hepatocyte growth factor- regulated tyrosine kinase substrate)組分結(jié)合，降低了HGS與胞內(nèi)分選復(fù)合體的親和性，影響吞噬體的成熟，從而影響巨噬細(xì)胞的炎癥信號和細(xì)胞因子的產(chǎn)生，損害了CD4+細(xì)胞的激活[39,40]。

圖2 不同抗生素差異調(diào)控ESX系統(tǒng)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄

A：NIH數(shù)據(jù)中抗生素差異調(diào)控的基因轉(zhuǎn)錄熱圖；B：化合物1結(jié)構(gòu)式。

表4 龜分枝桿菌感染噬菌體后Esx相關(guān)基因的變化情況

圖3 ΔRD1改變巨噬細(xì)胞Toll-like receptor、TNF、NF-κB信號通路相關(guān)基因表達

A：感染ΔRD1與WT結(jié)核分枝桿菌48 h后巨噬細(xì)胞差異表達基因的火山圖。藍(lán)點顯示基因上調(diào)表達2倍，<0.05。紅點顯示基因表達低于0.5倍，<0.05。藍(lán)點顯示基因<2倍表達上調(diào)或下調(diào)，<0.05。綠點表達的基因在不同條件下無顯著差異，>0.05。B：比較ΔRD1與WT結(jié)核分枝桿菌感染48 h后樣本差異表達基因的KEGG分析中值最高的20條途徑。

11 ESX系統(tǒng)與持留的關(guān)系

持留結(jié)核分枝桿菌是結(jié)核病治療的一大難點，容易導(dǎo)致耐藥性細(xì)菌的產(chǎn)生。有研究發(fā)現(xiàn)，在BCG中回補MTB的RD1的相關(guān)基因會增強BCG在宿主細(xì)胞的持留性，表明RD1中的基因與結(jié)核分枝桿菌的持留密切相關(guān)[41]。ESX系統(tǒng)底物中PE/PPE家族與持留也存在聯(lián)系，在恥垢分枝桿菌中異源表達ESX5的底物(PPE25、PPE26、PPE27)，顯著增強了細(xì)菌在宿主中的持留能力[42,43]。此外，結(jié)核分枝桿菌可以將糖酵解途徑轉(zhuǎn)化為酮體合成途徑，去激活抗脂聚物G蛋白偶聯(lián)受體GPR109A，擾動宿主脂質(zhì)代謝的動態(tài)平衡，影響宿主細(xì)胞內(nèi)部脂滴的積累，促進“皂化”細(xì)胞的形成去適應(yīng)自身的持留狀態(tài)，EsxA可以促進3-羥基丁酸的產(chǎn)生，介導(dǎo)這個轉(zhuǎn)化過程，從而促進細(xì)菌的持留[44]。通過ESX系統(tǒng)底物的YXXXD/E特征序列并且結(jié)合Tucci等[45]鑒定的結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)濾液蛋白對ESX系統(tǒng)底物進行預(yù)測[45]發(fā)現(xiàn)Rv0467、Rv0981、DosT與分枝桿菌的持留相關(guān)，表明ESX系統(tǒng)在分枝桿菌的持留方面發(fā)揮著重要作用，但目前ESX系統(tǒng)還有許多底物的功能尚未清楚，需要進一步驗證。

12 結(jié)語與展望

ESX系統(tǒng)作為致病分枝桿菌毒力因子的關(guān)鍵，其組成、結(jié)構(gòu)以及功能的研究日益受到關(guān)注。恥垢分枝桿菌ESX-3和結(jié)核分枝桿菌ESX-5的部分高分辨率結(jié)構(gòu)已經(jīng)解析，據(jù)此可以預(yù)測ESX系統(tǒng)的運輸機制。這有助于靶向ESX系統(tǒng)的新抗生素研發(fā)。結(jié)核病治療新藥物貝達喹啉與德拉馬尼未改變ESX系統(tǒng)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[46,47]，但PA824、氯法齊明、纈霉素上調(diào)系列基因的轉(zhuǎn)錄，四環(huán)素下調(diào)基因的轉(zhuǎn)錄[30]。深入研究這些抗生素和ESX系統(tǒng)基因表達之間的關(guān)系，有助于發(fā)現(xiàn)新靶標(biāo)。

目前關(guān)于Esx底物的功能研究多是為了尋找合適的蛋白作為疫苗研發(fā)的新靶標(biāo)，其中關(guān)于EsxA/EsxB的研究最多。重組BCG菌株中單獨回補EsxA基因片段，EsxA蛋白還可以通過ESX-5系統(tǒng)分泌至胞外，并且只會增強疫苗的免疫原性，不會增加疫苗反應(yīng)原性[41]。此外，EsxA/EsxB還可以作為結(jié)核分枝桿菌感染的診斷標(biāo)志物。然而，EsxA和EsxB不能同時用于疫苗接種和診斷，因為它們應(yīng)用于在接種含有EsxA和EsxB制劑的人群中無法區(qū)分接疫苗和結(jié)核分枝桿菌感染的效果。因此迫切需要尋找新的蛋白作為疫苗的研發(fā)靶標(biāo)，目前已發(fā)現(xiàn)Esx樣蛋白有23種，這些蛋白可能具有作為疫苗靶標(biāo)的潛力，但與其相關(guān)的功能研究較少。ID93是一種多蛋白候選疫苗，包含4種結(jié)核分枝桿菌蛋白，其中兩種是Esx樣蛋白，即Rv3619c (EsxV)和Rv3620c (EsxW)，這種亞單位疫苗的免疫并沒有誘導(dǎo)對結(jié)核分枝桿菌純化蛋白衍生物(purified protein derivatives，PPD)的敏感性，這表明它作為疫苗的使用不會干擾PPD作為對結(jié)核病診斷的皮膚測試試劑的使用。ID93/GLA-SE (glucopyranosyl lipid adjuvant in a stable nano?emulsion)疫苗也已在接種了卡介苗的成人中進行了I期臨床試驗，結(jié)果顯示該疫苗耐受性良好，疫苗接種者沒有出現(xiàn)嚴(yán)重或嚴(yán)重的疫苗相關(guān)不良反應(yīng)。目前IIa期臨床試驗正在南非開普敦附近的3個臨床地點進行。這表明Esx樣蛋白底物具有較大的應(yīng)用前景，但相關(guān)的作用機制仍需要更多研究。

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Progress on the function ofT7SS (ESX) secretion system

Zhiyong Jiang, Jianping Xie

infection can affect the host’s immune function by secreting extracellular effector proteins. ESX (or type VII) system plays an important role in the secretion of effector proteins. ESX system is the protein export system in mycobacteria and many actinomycetes. However, how ESX system secretes and underlying mechanism of action remain unclear. In this review, we introduce the components, function, classification of ESX system and the process of substrates transfer to the peripheral space via this system, and discuss the roles of ESX system in antibiotics resistance, persistence, host-phage interaction, new drug targets. We hope to provide insights into the discovery of new drugs and vaccine antigens for tuberculosis.

ESX system;; membrane complex; antibiotic; virulence factor

2023-07-10;

2023-09-12;

2023-09-18

國家自然科學(xué)基金項目(編號：4112000164)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 4112000164)]

蔣智勇，碩士研究生，專業(yè)方向：微生物遺傳學(xué)與感染免疫。E-mail: 2287834994@qq.com

謝建平，博士，二級研究員，研究方向：結(jié)核分枝桿菌等重要病原致病耐藥機理與新防控措施研發(fā)。E-mail：georgex@swu.edu.cn

10.16288/j.yczz.23-188

(責(zé)任編委: 梁海華)