歐秀芳，吳瑩，李寧，姜麗麗，劉寶，宮磊

遺傳學(xué)教學(xué)

基于科教融合培養(yǎng)大學(xué)生拔尖創(chuàng)新能力的表觀遺傳學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)課程

歐秀芳，吳瑩，李寧，姜麗麗，劉寶，宮磊

東北師范大學(xué)，分子表觀遺傳學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春 130024

科教融合是高校培養(yǎng)拔尖創(chuàng)新人才的有效途徑。表觀遺傳學(xué)是對(duì)經(jīng)典遺傳學(xué)的拓展，針對(duì)本校拔尖人才培養(yǎng)體系中表觀遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容的缺失，我們首次進(jìn)行了表觀遺傳學(xué)科教融合、協(xié)同育人的嘗試，將本實(shí)驗(yàn)室前期在水稻中開展的基因的研究成果進(jìn)行實(shí)驗(yàn)教學(xué)轉(zhuǎn)化，建成了一個(gè)集前沿性、研究型和創(chuàng)新性為一體，以學(xué)生獨(dú)立實(shí)驗(yàn)為中心，考核方式多元化的表觀遺傳學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)課程。本課程以基因突變體和野生型為實(shí)驗(yàn)材料，將表觀遺傳上游酶促基因突變與基因組內(nèi)特定位點(diǎn)的DNA甲基化和基因組穩(wěn)定性聯(lián)系起來。通過本課程的實(shí)踐，學(xué)生對(duì)表觀遺傳修飾的重要作用有了更深刻理解，科研能力得到極大提升，強(qiáng)力支撐了本專業(yè)拔尖創(chuàng)新人才的培養(yǎng)。

科教融合；表觀遺傳學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)；實(shí)驗(yàn)教學(xué)

創(chuàng)新型人才的培養(yǎng)是國(guó)家長(zhǎng)遠(yuǎn)發(fā)展的大計(jì)。黨的二十大明確提出要深入實(shí)施科教興國(guó)戰(zhàn)略，建立和完善我國(guó)自主培養(yǎng)拔尖人才的培養(yǎng)體系。2018年，教育部發(fā)布了《關(guān)于加快建設(shè)高水平本科教育全面提高人才培養(yǎng)能力的意見》，強(qiáng)調(diào)高校要以高水平科學(xué)研究支撐本科人才培養(yǎng)，要將最新的科研成果及時(shí)轉(zhuǎn)化為教育教學(xué)內(nèi)容(http://www.moe.gov.cn/ srcsite/A08/s7056/201810/t20181017_351887.html)。因此科教融合是高校培養(yǎng)拔尖創(chuàng)新人才的有效途徑。

表觀遺傳學(xué)是對(duì)經(jīng)典遺傳學(xué)的拓展，解析了遺傳學(xué)上提到的環(huán)境如何導(dǎo)致可遺傳的基因表達(dá)變化，并最終產(chǎn)生可遺傳新表型的問題。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，水稻()中主要負(fù)責(zé)維持CG甲基化的酶基因的純合突變可引起全基因組范圍內(nèi)不同位點(diǎn)發(fā)生DNA甲基化變異和轉(zhuǎn)座子活性的改變，并且在水稻的不同器官(葉片和愈傷)中表現(xiàn)出變異模式和程度的差異[1,2]，該成果完善了植物中基因功能的理論，證明了DNA甲基化在調(diào)控植物正常生長(zhǎng)發(fā)育中的重要作用。

東北師范大學(xué)生物科學(xué)專業(yè)是教育部“拔尖計(jì)劃2.0”人才培養(yǎng)基地，《表觀遺傳學(xué)》理論課程是“拔尖計(jì)劃2.0”學(xué)生培養(yǎng)必修課程。針對(duì)本校人才培養(yǎng)中表觀遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容的缺失，依托“分子表觀遺傳學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室”，2018年我們將上述本實(shí)驗(yàn)室的科研成果轉(zhuǎn)化為實(shí)驗(yàn)課程資源，構(gòu)建了一門綜合表觀遺傳學(xué)最新研究領(lǐng)域和前沿技術(shù)的獨(dú)立的“表觀遺傳學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)課程”。該課程是“拔尖計(jì)劃2.0”學(xué)生必修課程，學(xué)生在預(yù)修了遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、表觀遺傳學(xué)、遺傳學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)以及分子生物學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，在第5學(xué)期進(jìn)行修讀，課程共計(jì)36學(xué)時(shí)，每年學(xué)生人數(shù)40人左右，分兩個(gè)班級(jí)進(jìn)行平行授課。課程采用理論和實(shí)踐相結(jié)合的方式進(jìn)行，主要探究基因突變對(duì)水稻特定序列DNA甲基化和轉(zhuǎn)座子活性的影響。通過本課程的實(shí)踐，培養(yǎng)學(xué)生獨(dú)立思考、自主分析和解決科研中存在問題的創(chuàng)新能力；培養(yǎng)學(xué)生通過閱讀、研究、觀察和實(shí)踐手段獲取知識(shí)的自主學(xué)習(xí)能力以及通過團(tuán)隊(duì)協(xié)作學(xué)習(xí)知識(shí)和技能的交流合作能力。目前本課程已經(jīng)過6輪教學(xué)實(shí)踐檢驗(yàn)和持續(xù)改進(jìn)，顯著提高了學(xué)生的科研能力，全面提升了人才培養(yǎng)質(zhì)量。

1 表觀遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)引入本科生課堂的重要意義

表觀遺傳學(xué)是指不需要DNA序列變異而發(fā)生的可遺傳的基因表達(dá)改變[3]。表觀遺傳機(jī)制包括DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑以及非編碼RNA豐度變化等[4～6]。研究表明，表觀遺傳變異在生物進(jìn)化、作物改良和人類健康中都具有重要作用[7～9]。

目前，全國(guó)各高校無論是基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)還是綜合實(shí)驗(yàn)大都針對(duì)經(jīng)典遺傳學(xué)設(shè)計(jì)而開展，缺少表觀遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容。本校的遺傳學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)，也存在上述問題，并且綜合實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容重疊較多，研究性內(nèi)容不足，實(shí)驗(yàn)內(nèi)容多為“驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象、培養(yǎng)動(dòng)手能力”的課程，教學(xué)內(nèi)容上缺少設(shè)計(jì)性和創(chuàng)新性，與本學(xué)科的科研成果融合明顯不足，缺少對(duì)學(xué)生整體科研思維的培養(yǎng)。教學(xué)模式上也與基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)差別不大，仍然主要以“教師教為中心”，學(xué)生根據(jù)教師的講解或示范進(jìn)行操作，缺少對(duì)學(xué)生主動(dòng)思考和探索能力的培養(yǎng)?？己朔绞饺匀惠^單一，過程性評(píng)價(jià)不足，多采取實(shí)驗(yàn)報(bào)告或總結(jié)論文的考核方式，對(duì)創(chuàng)新能力的綜合考評(píng)不夠，導(dǎo)致現(xiàn)有遺傳學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)的教學(xué)內(nèi)容和模式對(duì)學(xué)生科研能力培養(yǎng)的支撐度顯著不足，不能契合拔尖創(chuàng)新人才的培養(yǎng)目標(biāo)?！侗碛^遺傳學(xué)》是本校生物科學(xué)專業(yè)“拔尖計(jì)劃2.0”學(xué)生的必修課程，多年理論教學(xué)發(fā)現(xiàn)學(xué)生缺少理論知識(shí)的實(shí)踐轉(zhuǎn)化，表觀遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容在教學(xué)體系中完全缺失。因此在本科生培養(yǎng)方案中引入表觀遺傳學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)對(duì)于完善生物科學(xué)專業(yè)學(xué)生的實(shí)驗(yàn)體系，培養(yǎng)具有原始創(chuàng)新能力的拔尖人才具有重要意義。

2 從科研成果中挖掘適用于實(shí)驗(yàn)教學(xué)的題材

DNA甲基化是一種極其重要且相對(duì)穩(wěn)定并可遺傳的表觀遺傳修飾，其變化會(huì)影響基因表達(dá)和基因組穩(wěn)定性[10,11]。生物固有的DNA甲基化水平和模式改變會(huì)導(dǎo)致生物表型異常甚至死亡，但一定范圍內(nèi)的甲基化變異又為適應(yīng)和物種進(jìn)化提供了物質(zhì)基礎(chǔ)[12]。在植物中，DNA甲基化可發(fā)生在CG、CHG和CHH位點(diǎn)(H代表A/T/C三種堿基中的任意一種)[13～16]，其中CG位點(diǎn)的甲基化是最普遍發(fā)生的形式[13]。植物中CG甲基化主要由MET1 (methyltransferase 1)負(fù)責(zé)維持。在擬南芥()中，純合突變顯著降低了全基因組范圍內(nèi)CG甲基化的水平(從24.6%下降到0.42%)，植株發(fā)育明顯異常[17～19]。擬南芥是雙子葉模式植物的代表，然而許多重要作物如小麥()、玉米()和水稻都屬于單子葉植物，因此本實(shí)驗(yàn)室前期研究提出一個(gè)重要科學(xué)問題：基因在單、雙子葉之間的功能是否保守？

水稻是單子葉模式植物的代表。水稻中是維持CG甲基化的主要功能基因[20～22]。本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)基因的純合和雜合突變體的幼苗、長(zhǎng)期培養(yǎng)的愈傷組織進(jìn)行了系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)純合突變顯著降低基因組范圍內(nèi)CG甲基化水平(從39.88%下降到9.69%)，說明基因在單、雙子葉之間具有功能保守性。但是水稻純合突變體幼苗僅能在培養(yǎng)基條件下存活14天，長(zhǎng)至3 cm左右后即死亡[1]，而擬南芥純合突變體能完成整個(gè)發(fā)育過程[19,23,24]。此外，在正常培養(yǎng)條件下，擬南芥雜合突變體后代表現(xiàn)出明顯的表型分歧[23]，而水稻雜合突變體的表型和野生型沒有明顯差別[1]，這表明基因在單、雙子葉之間具有明顯的功能差異。

在植物中，DNA甲基化與轉(zhuǎn)座子穩(wěn)定性密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)室對(duì)連續(xù)3年繼代培養(yǎng)的純合突變體、雜合突變體和野生型愈傷組織進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)在純合突變體的愈傷組織中發(fā)生了大規(guī)模的轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座爆發(fā)[2]，說明CG甲基化在維持轉(zhuǎn)座子的穩(wěn)定性和基因組穩(wěn)定性方面具有重要作用[1,2]。上述研究成果完善了植物中基因的功能，證明了DNA甲基化在調(diào)控植物正常生長(zhǎng)發(fā)育中的重要作用。

本課程以上述研究為基石，教師以理論課上提出的科學(xué)問題“基因在單、雙子葉之間的功能是否相同？”為核心，對(duì)其進(jìn)行表觀遺傳學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)的轉(zhuǎn)化，該研究成果聚焦表觀遺傳學(xué)的理論和應(yīng)用前沿，將理論和實(shí)踐相結(jié)合，科研和教學(xué)相融匯，契合本校生物學(xué)一級(jí)學(xué)科拔尖創(chuàng)新人才的培養(yǎng)目標(biāo)。

3 科研成果向創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)化的具體實(shí)踐

科研成果在具體轉(zhuǎn)化時(shí)不能將整個(gè)研究成果作為實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，在可行性上，要考慮本科生的實(shí)驗(yàn)周期和實(shí)施成本；在內(nèi)容設(shè)計(jì)上，要具有系統(tǒng)性、創(chuàng)新性和高階性，能夠真正體現(xiàn)培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新意識(shí)和科研探索精神；在實(shí)施過程中，要注意培養(yǎng)學(xué)生獨(dú)立、完整的科研思維；在轉(zhuǎn)化過程中，教師的每一步設(shè)計(jì)都要體現(xiàn)對(duì)學(xué)生科研能力的培養(yǎng)，引導(dǎo)學(xué)生主動(dòng)思考、主動(dòng)探索。課程設(shè)計(jì)的整體思路突出學(xué)生的主導(dǎo)地位，學(xué)生自己負(fù)責(zé)分析和解決問題，教師發(fā)揮引導(dǎo)和答疑解惑的作用。課程內(nèi)容及具體學(xué)時(shí)安排見表1。

3.1 科學(xué)問題的提出

教師課前講解實(shí)驗(yàn)課程相關(guān)理論知識(shí)，即植物中DNA甲基化的建立、維持及其生物學(xué)功能，重點(diǎn)關(guān)注DNA甲基化在維持基因組穩(wěn)定性方面的作用。以雙子葉模式植物擬南芥為例，介紹基因的作用及其突變后對(duì)擬南芥基因組DNA甲基化和表型的影響，接下來引導(dǎo)學(xué)生思考，提出科學(xué)問題：?jiǎn)?、雙子葉植物中的功能是否相同？根據(jù)擬南芥相關(guān)研究，提出以下問題：(1)水稻中拷貝有幾個(gè)？(2)基因突變對(duì)水稻基因組穩(wěn)定性、DNA甲基化以及表型有何影響？本實(shí)驗(yàn)室前期研究是基于組學(xué)分析，這種大尺度的分析并不適用于本科實(shí)驗(yàn)，因此在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)，教師引導(dǎo)學(xué)生將科學(xué)問題具體化，即“基因突變對(duì)水稻特定序列DNA甲基化和轉(zhuǎn)座子活性的影響”。

表1 課程安排

3.2 實(shí)驗(yàn)材料

在組織培養(yǎng)條件下，水稻粳稻日本晴(L. ssp., cv. Nipponbare)基因組中反轉(zhuǎn)座子被激活，插入到基因，再生獲得基因雜合突變體，本實(shí)驗(yàn)室所用雜合突變體水稻材料最初來源于日本生物科學(xué)研究所，雜合突變體自交后可獲得純合突變體()、雜合突變體()和野生型()。本實(shí)驗(yàn)以雜合突變體自交5～9代(2018年～2022年)獲得的純合突變體()、雜合突變體()和野生型()幼苗，以及由以上3種基因型種子誘導(dǎo)繼代培養(yǎng)3～7年(2018年～2022年)的愈傷組織為實(shí)驗(yàn)材料。學(xué)生根據(jù)所要解決的科學(xué)問題選擇實(shí)驗(yàn)材料，如科學(xué)問題為“純合突變對(duì)水稻愈傷組織中特定轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座活性和DNA甲基化的影響”，學(xué)生可以選擇該基因的野生型以及純合突變體的愈傷組織作為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行研究。

3.3 實(shí)驗(yàn)方法

3.3.1 水稻基因組DNA提取及濃度檢測(cè)

學(xué)生每4人為一組，組內(nèi)再分為兩個(gè)小組，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)中的生物學(xué)重復(fù)和技術(shù)重復(fù)。教師為學(xué)生提供實(shí)驗(yàn)材料，學(xué)生可采用改良的CTAB法[25]或植物基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技北京有限公司，DP305)進(jìn)行水稻幼苗和/或愈傷組織基因組DNA的提取，并利用Nanodrop微量分光光度計(jì)和/或瓊脂糖凝膠電泳對(duì)DNA的質(zhì)量和濃度進(jìn)行檢測(cè)。該部分從技能層面使學(xué)生掌握植物基因組DNA提取方法和DNA質(zhì)量評(píng)估方法；從思維角度培養(yǎng)學(xué)生應(yīng)用多種實(shí)驗(yàn)方法對(duì)結(jié)果進(jìn)行相互驗(yàn)證的科研思維。

3.3.2 實(shí)驗(yàn)材料基因型鑒定

學(xué)生利用水稻插入突變體數(shù)據(jù)庫(RiceInsertion Mutant Database)查找插入基因的具體位點(diǎn)、插入方向以及插入位點(diǎn)上下游的序列信息，利用primer5軟件設(shè)計(jì)引物，以3.3.1所提取的基因組DNA為模板，通過PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳，確定材料基因型。該部分從技能層面讓學(xué)生學(xué)會(huì)應(yīng)用水稻突變體數(shù)據(jù)庫和引物設(shè)計(jì)軟件，明確PCR引物設(shè)計(jì)的基本原則以及PCR反應(yīng)的原理；從思維角度使學(xué)生明確科研中實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)確的重要性。

3.3.3 轉(zhuǎn)座子激活檢測(cè)

學(xué)生根據(jù)教師講解的轉(zhuǎn)座子激活相關(guān)知識(shí)，查閱文獻(xiàn)，利用公開數(shù)據(jù)庫或?qū)嶒?yàn)室已有的基因組重測(cè)序數(shù)據(jù)，在水稻全基因組范圍內(nèi)選擇感興趣的轉(zhuǎn)座子，通過設(shè)計(jì)引物、位點(diǎn)特異的PCR擴(kuò)增以及瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)基因突變對(duì)水稻特定轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座活性的影響。重測(cè)序數(shù)據(jù)和分析方法參考實(shí)驗(yàn)室前期科研成果[2]。該部分從技能層面使學(xué)生掌握基因組重測(cè)序的原理和基因組內(nèi)轉(zhuǎn)座子多態(tài)性分析的原理；從思維角度培養(yǎng)學(xué)生根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇適合實(shí)驗(yàn)方案的科研思維。

3.3.4 DNA甲基化檢測(cè)和變異分析

學(xué)生利用特定位點(diǎn)亞硫酸鹽測(cè)序法檢測(cè)特定序列DNA甲基化情況。具體實(shí)驗(yàn)過程包括：亞硫酸鹽測(cè)序引物的設(shè)計(jì)；亞硫酸鹽處理基因組DNA；PCR擴(kuò)增目的產(chǎn)物的回收、與T載體連接、轉(zhuǎn)化；陽性克隆篩選、測(cè)序以及測(cè)序數(shù)據(jù)分析。實(shí)驗(yàn)方法參照用于本課程轉(zhuǎn)化的科研成果[1]。該部分從技能角度培養(yǎng)學(xué)生團(tuán)隊(duì)協(xié)作設(shè)計(jì)DNA甲基化檢測(cè)實(shí)驗(yàn)方案的能力；從思維角度培養(yǎng)學(xué)生將大尺度(基因組范圍)和小尺度(特點(diǎn)位點(diǎn))結(jié)合起來綜合分析問題的科研思維。

3.4 代表性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.4.1 水稻幼苗和愈傷組織基因組DNA的提取及濃度檢測(cè)

圖1A展示了某小組利用不同方法提取的野生型(+/+)和純合突變體(–/–)愈傷組織和幼苗的基因組DNA，并用Nanodrop微量分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的質(zhì)量和濃度，發(fā)現(xiàn)從愈傷組織中所提取的DNA濃度明顯低于幼苗中，并且試劑盒法提取的DNA的濃度要高于改良的CTAB法，但兩種方法所提取的DNA純度(260/280)無差異(圖1A)。將圖1A中的DNA稀釋10倍后利用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，以λDNA(濃度為10 ng/μL)作為檢測(cè)DNA完整性和估測(cè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)，通過亮度估測(cè)濃度發(fā)現(xiàn)與Nanodrop所測(cè)濃度基本一致，可進(jìn)一步確定所提取的基因組DNA的濃度(圖1B)。

圖1 DNA質(zhì)量和濃度的檢測(cè)

A：Nanodrop微量分光光度計(jì)檢測(cè)水稻基因組DNA；B：瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)水稻基因組DNA(稀釋10倍)。λDNA濃度為10 ng/μL，+/+代表野生型，–/–代表純合突變體。

3.4.2 PCR擴(kuò)增鑒定實(shí)驗(yàn)材料基因型。

根據(jù)水稻插入突變體數(shù)據(jù)庫提供的信息，反向插入到基因的第6個(gè)外顯子(圖2A)。PCR引物設(shè)計(jì)時(shí)需要兩對(duì)引物組合使用(圖2A)，引物對(duì)A位于插入位點(diǎn)兩端(primer1和primer2)，引物對(duì)B的一側(cè)位于插入位點(diǎn)上游(primer1)，另一側(cè)位于的3′端(primer3)，該設(shè)計(jì)巧妙的共用一個(gè)引物primer1，與primer2組成了引物對(duì)A，與primer3組成了引物對(duì)B，由于本身長(zhǎng)度為4.3 kb，通過控制PCR反應(yīng)程序中的延伸時(shí)間為1分鐘(1分鐘大約可擴(kuò)增1 kb的序列長(zhǎng)度)，即可根據(jù)兩對(duì)引物擴(kuò)增條帶的有無來判斷材料的基因型。利用圖2B中的引物序列進(jìn)行擴(kuò)增，如僅在引物對(duì)A擴(kuò)增出目的條帶(500 bp)，則基因型為野生型(+/+)；僅在引物對(duì)B中擴(kuò)增出目的條帶(500 bp)，則基因型為純合突變體(–/–)；如在引物對(duì)A和B中均能擴(kuò)增出目的條帶(500 bp)，則該基因型為雜合突變體(+/–)(圖2C)。

圖2 實(shí)驗(yàn)材料基因型鑒定

A：反向插入到的第六個(gè)外顯子及引物設(shè)計(jì)的位置；B：用于鑒定基因型所用的引物信息；C：引物對(duì)A和B在不同基因型中擴(kuò)增出的目的條帶。+/+代表野生型，+/–代表雜合突變體，–/–代表純合突變體。M：100 bp DNA Ladder。

3.4.3 轉(zhuǎn)座子激活及其上游序列DNA甲基化變異檢測(cè)

本部分重點(diǎn)突出學(xué)生自主探究，學(xué)生可在水稻全基因組范圍內(nèi)選擇感興趣的轉(zhuǎn)座子進(jìn)行研究，通過PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座激活情況。如某小組選擇進(jìn)行研究，屬于MITEs類轉(zhuǎn)座子，全長(zhǎng)430 bp，的序列具有高度保守性，在粳稻中約有50個(gè)拷貝，與水稻基因組進(jìn)化相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)能在特定環(huán)境條件誘導(dǎo)下激活[26～28]。通過與野生型(+/+)愈傷組織相比，在純合突變(–/–)的2個(gè)單獨(dú)繼代培養(yǎng)的愈傷組織中均檢測(cè)到的純合跳出(圖3A)，在–/–的2號(hào)愈傷組織中檢測(cè)到的純合插入(圖3B)。

圖3 轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座活性檢測(cè)和DNA甲基化分析

A：在愈傷組織中與野生型(+/+)相比，純合突變體(–/–)發(fā)生了的跳出；B：在愈傷組織中與野生型(+/+)相比，純合突變體(–/–)發(fā)生了的插入；C：插入位點(diǎn)及上游序列信息；D：亞硫酸鹽測(cè)序分析野生型(+/+)與純合突變體(–/–)中DNA甲基化情況。M：100 bp DNA Ladder。

在距離插入位點(diǎn)上游833～380 bp (目的序列長(zhǎng)度453 bp)處設(shè)計(jì)引物(圖3C)，檢測(cè)插入與其上游序列DNA甲基化的相關(guān)性，在453 bp的序列中，包括5個(gè)CG位點(diǎn)，將–/–和+/+進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)在–/–中CG甲基化顯著降低(圖3D)，而CHG和CHH甲基化無明顯變化。說明的插入可能與其上游序列CG甲基化降低相關(guān)。

3.5 多元的成績(jī)?cè)u(píng)價(jià)方式

本課程采取過程性的多元化評(píng)價(jià)體系，包括撰寫與本課程相關(guān)的研究綜述、以小組為單位的研究設(shè)計(jì)及匯報(bào)、學(xué)生個(gè)人實(shí)驗(yàn)操作的規(guī)范性評(píng)價(jià)、實(shí)驗(yàn)記錄和研究論文。每項(xiàng)評(píng)定方式滿分均為100，各項(xiàng)評(píng)價(jià)方式對(duì)學(xué)生的具體要求、考核目的、評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)以及所占比例見表2。

表2 課程評(píng)價(jià)方式

4 課程實(shí)踐中的教學(xué)反饋和反思

為更好地了解科研轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的教學(xué)效果，自2020年春季起，通過問卷方式對(duì)修完本課程的學(xué)生進(jìn)行調(diào)查，問卷通過問卷星APP進(jìn)行發(fā)布，包括四輪教學(xué)實(shí)踐(2020春、2021春、2022春和2022秋)。問卷共計(jì)19道題，其中1～15為主觀題，重點(diǎn)關(guān)注學(xué)生對(duì)課程教學(xué)內(nèi)容、教學(xué)模式的設(shè)置、考核方式的合理性、自身科研思維和科研能力提高等的滿意度，每道題設(shè)置5個(gè)選項(xiàng)，分別為“非常不同意”、“不同意”、“一般”、“同意”和“非常同意”，以選擇后兩項(xiàng)即“同意”和“非常同意”學(xué)生比例的和作為學(xué)生滿意度指標(biāo)；16和17題為分類選擇題，關(guān)注學(xué)生在實(shí)驗(yàn)課后的自我反思和反饋；18和19題為開放性問題，關(guān)注學(xué)生對(duì)課程的建議，為課程后續(xù)改進(jìn)提供依據(jù)。

4.1 學(xué)生對(duì)課程的滿意度

通過主觀題的設(shè)置調(diào)查學(xué)生對(duì)該課程的滿意度，從表3中可以看出本實(shí)驗(yàn)內(nèi)容的設(shè)置突出了研究型教學(xué)內(nèi)容(問題1)，課程的教學(xué)內(nèi)容和模式(問題2、3)充分調(diào)動(dòng)了學(xué)生自主學(xué)習(xí)、主動(dòng)思考和解決問題的能力(問題4、7)，在實(shí)驗(yàn)中學(xué)生能夠明確實(shí)驗(yàn)中需要注意的關(guān)鍵點(diǎn)(問題5)，整個(gè)實(shí)驗(yàn)課程的設(shè)置以學(xué)生為主導(dǎo)(問題6)，學(xué)生通過小組協(xié)作(問題4、5、14)完成實(shí)驗(yàn)，考核方式的多元化設(shè)置(問題8、9)有助于學(xué)生更加注重實(shí)驗(yàn)過程中的嚴(yán)謹(jǐn)性，學(xué)生高度認(rèn)可這種學(xué)習(xí)方式(問題10)，認(rèn)為能夠有效培養(yǎng)他們的科研思維和創(chuàng)新能力(問題11)，并且學(xué)生認(rèn)同高階挑戰(zhàn)性的課程能夠激發(fā)他們的學(xué)習(xí)興趣(問題12)，學(xué)到更多的知識(shí)(問題13)。以上結(jié)論來自于前14個(gè)問題的滿意度，表3中除個(gè)別學(xué)期個(gè)別問題的滿意度在85%左右外，其余滿意度都在90%以上，甚至有的達(dá)到100%，這說明總體上學(xué)生高度認(rèn)可這種教學(xué)模式。值得注意的是，學(xué)生對(duì)問題15的滿意度明顯偏低，這說明高階挑戰(zhàn)性的研究型實(shí)驗(yàn)內(nèi)容的設(shè)置增加了學(xué)生的課業(yè)負(fù)擔(dān)，這也從側(cè)面反應(yīng)了綜合性創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)的一個(gè)特點(diǎn)，學(xué)生需要花費(fèi)更多的精力和時(shí)間去完成這門課，但同時(shí)也讓學(xué)生領(lǐng)悟了科研中所需要的努力、付出和堅(jiān)持。

表3 學(xué)生滿意度調(diào)查

4.2 學(xué)生的自我反思

課程完成后，學(xué)生通過自我反思(圖4A，問題16：在本實(shí)驗(yàn)課中，您認(rèn)為影響自己學(xué)習(xí)效果的因素是什么？)，認(rèn)為自身對(duì)實(shí)驗(yàn)中生物學(xué)問題理解的不夠深入對(duì)學(xué)習(xí)效果的影響最大，其次是自主閱讀文獻(xiàn)能力不足，而對(duì)教師的依賴性過大及實(shí)驗(yàn)操作能力對(duì)學(xué)習(xí)效果的影響則相對(duì)較小，這也正是綜合性探究實(shí)驗(yàn)與以往基礎(chǔ)驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)最大的區(qū)別，學(xué)生作為課程的主導(dǎo)，要具有主動(dòng)探究和主動(dòng)思考的能力，通過本實(shí)驗(yàn)課的實(shí)踐讓學(xué)生認(rèn)識(shí)到目前自身存在的不足，有助于其在今后學(xué)習(xí)中的改進(jìn)和提高。同時(shí)，教師根據(jù)學(xué)生反饋，在2022年春季加強(qiáng)了課程相關(guān)理論內(nèi)容的講解，在一定程度上提高了學(xué)生對(duì)生物學(xué)問題的理解能力。但也注意到此項(xiàng)依然是學(xué)生存在的主要問題，在今后的授課中教師將在理論課中增加答疑討論環(huán)節(jié)，并在表觀遺傳學(xué)理論課中對(duì)涉及實(shí)驗(yàn)課內(nèi)容的部分以科研案例的形式進(jìn)行詳細(xì)講解，來幫助學(xué)生更好地理解實(shí)驗(yàn)中的科學(xué)問題。

通過本實(shí)驗(yàn)課的訓(xùn)練(圖4B，問題17：課程結(jié)束后，您覺得哪一項(xiàng)能力提高的最多？)，學(xué)生認(rèn)為其科研能力、問題解決能力和合作能力提高的最多。從圖中可以看出在所調(diào)查的4個(gè)學(xué)期中此3項(xiàng)始終位列前三，學(xué)生的批判思維和創(chuàng)新能力也有所提高，但其選擇比例較低的原因可能與本題設(shè)置有關(guān)，此題設(shè)置為單選題，學(xué)生只能從中選擇一項(xiàng)，而實(shí)際上科研能力和問題解決能力的提高就包含批判性思維和創(chuàng)新能力的提高，因此通過學(xué)生的反饋，可以看出本課程達(dá)到了提高學(xué)生科研能力的目的。

4.3 學(xué)生對(duì)課程的建議

開放性問題18和19由學(xué)生自由回答，重點(diǎn)關(guān)注學(xué)生對(duì)課程的建議。對(duì)于問題18：本實(shí)驗(yàn)課的教學(xué)模式你喜歡哪部分？學(xué)生普遍反饋喜歡在教師提供一定的引導(dǎo)和啟發(fā)下，讓他們以小組合作方式進(jìn)行自主探索和自主設(shè)計(jì)的教學(xué)模式。對(duì)于問題19：您希望以后的課程在哪些方面得到改善？在2020年和2021年春季的調(diào)查中，學(xué)生反饋教師理論課講解時(shí)間偏少，建議增加理論課學(xué)時(shí)，因此在2022年春季和秋季的實(shí)驗(yàn)課中，理論課由之前的2學(xué)時(shí)調(diào)整為4學(xué)時(shí)。此外在2022年秋季的調(diào)查中，學(xué)生反饋希望教師增加對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理部分的指導(dǎo)，并增加小組間的討論環(huán)節(jié)。對(duì)于此反饋，教師擬在下一輪的教學(xué)實(shí)踐中，增加實(shí)驗(yàn)后的成果匯報(bào)部分，師生共同對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和討論，培養(yǎng)學(xué)生的批判性思維。

圖4 學(xué)生的自我反思

A：?jiǎn)栴}16：在本實(shí)驗(yàn)課中，您認(rèn)為影響自己學(xué)習(xí)效果的因素是什么？B：?jiǎn)栴}17：課程結(jié)束后，您覺得哪一項(xiàng)能力提高的最多？

4.4 教師的實(shí)踐反思

通過連續(xù)4年的調(diào)查反饋，教師及時(shí)掌握了學(xué)生在學(xué)習(xí)中遇到的問題和學(xué)習(xí)需求，及時(shí)調(diào)整授課模式，靈活調(diào)整課堂內(nèi)容，提高了實(shí)驗(yàn)課的教學(xué)質(zhì)量。除以上學(xué)生反饋的建議外，教師在多輪授課中也發(fā)現(xiàn)本課程存在可以進(jìn)一步改進(jìn)的部分，即如何建立轉(zhuǎn)座子活性與其自身或臨近區(qū)域DNA甲基化關(guān)系，要求學(xué)生自主選擇轉(zhuǎn)座子進(jìn)行轉(zhuǎn)座活性與DNA甲基化相關(guān)性的研究。本部分的開放性和發(fā)散性極高，學(xué)生可以在水稻全基因組范圍選擇轉(zhuǎn)座子，這就存在著選擇的轉(zhuǎn)座子的差異，轉(zhuǎn)座子是否發(fā)生轉(zhuǎn)座激活的差異，轉(zhuǎn)座子自身甲基化狀態(tài)的差異、轉(zhuǎn)座子原位點(diǎn)是否存在DNA甲基化、轉(zhuǎn)座子激活位點(diǎn)的臨近序列的甲基化狀態(tài)的差異等，每組學(xué)生的選擇不同，結(jié)果就不同。若學(xué)生選擇用于分析的片段本身不存在DNA甲基化，則無法建立甲基化狀態(tài)和轉(zhuǎn)座子活性的關(guān)系。為了提高本部分的實(shí)驗(yàn)成功率，教師要求學(xué)生在具體實(shí)驗(yàn)方案確定時(shí)對(duì)選擇的轉(zhuǎn)座子進(jìn)行詳細(xì)介紹，并且要對(duì)進(jìn)行DNA甲基化分析區(qū)段的甲基化情況狀態(tài)進(jìn)行確定，可利用實(shí)驗(yàn)室發(fā)表文獻(xiàn)中的甲基化組數(shù)據(jù)進(jìn)行查詢[1,2]，這在一定程度上提高了本部分實(shí)驗(yàn)的成功率。

除此之外，本課程也有一些新發(fā)現(xiàn)，如在檢測(cè)轉(zhuǎn)座子激活的實(shí)驗(yàn)中，學(xué)生在–/–中發(fā)現(xiàn)了新的跳出位點(diǎn)，經(jīng)過材料基因型的確認(rèn)以及3次重復(fù)，證實(shí)該結(jié)果是可信的。此時(shí)學(xué)生提出問題：為什么相同基因型的愈傷組織中的活性不同？其他位點(diǎn)的活性是否也發(fā)生了改變？其他轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座活性是否也有不同？造成這些差異的原因是什么？針對(duì)學(xué)生的疑問，教師引導(dǎo)學(xué)生進(jìn)一步思考：“愈傷組織在連續(xù)多代的培養(yǎng)中，其基因組、DNA甲基化組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組、代謝組等會(huì)發(fā)生怎樣的變化？這些變化與其再生能力是否相關(guān)？”學(xué)生可以在課程結(jié)束后自主查閱文獻(xiàn)，甚至可以進(jìn)行相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)來進(jìn)行進(jìn)一步的探究。由此本課程通過一個(gè)綜合性實(shí)驗(yàn)的探索引發(fā)了學(xué)生更深、更廣的思考，不斷開拓學(xué)生的科研思維，培養(yǎng)學(xué)生創(chuàng)新能力。

5 結(jié)語

前沿科研成果向一線教學(xué)轉(zhuǎn)化時(shí)，要考慮育人目標(biāo)以及學(xué)?？蓪?shí)現(xiàn)的軟、硬件設(shè)施，實(shí)驗(yàn)周期和實(shí)驗(yàn)成本等。本文通過具體的科研轉(zhuǎn)化，將表觀遺傳學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)研究問題和實(shí)驗(yàn)技術(shù)轉(zhuǎn)化為綜合型創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)課程，在完善專業(yè)教學(xué)體系基礎(chǔ)上，實(shí)現(xiàn)了課程的高階性，具有一定的挑戰(zhàn)度。該課程將表觀遺傳修飾上游關(guān)鍵酶基因突變與轉(zhuǎn)座子活性和特定序列的DNA甲基化狀態(tài)關(guān)聯(lián)，學(xué)生在基因組范圍內(nèi)自主選擇感興趣的轉(zhuǎn)座子進(jìn)行探究，能夠更好幫助學(xué)生理解表觀遺傳修飾在維持基因組穩(wěn)定性中的重要作用。本實(shí)驗(yàn)與華南農(nóng)業(yè)大學(xué)設(shè)計(jì)的表觀遺傳實(shí)驗(yàn)顯著不同，后者重點(diǎn)關(guān)注一個(gè)基因自身DNA甲基化修飾變異引起的基因表達(dá)改變和表型變異[29]。本課程在具體實(shí)施中要充分考慮本科生的知識(shí)水平和科研能力，進(jìn)行有的放矢的引導(dǎo)，讓學(xué)生作為科研的主角，課程的重點(diǎn)不在于學(xué)生是否能夠得到預(yù)期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，更注重的是讓學(xué)生學(xué)會(huì)進(jìn)行科學(xué)研究，提高學(xué)生獨(dú)立探索、獨(dú)立思考和獨(dú)立解決問題的科研能力，這才是通過實(shí)驗(yàn)教學(xué)培養(yǎng)拔尖人才的重要舉措。

[1] Hu LJ, Li N, Xu CM, Zhong SL, Lin XY, Yang JJ, Zhou TQ, Yuliang AZ, Wu Y, Chen YR, Cao XF, Zemach A, Rustgi S, von Wettstein D, Liu B. Mutation of a major CG methylase in rice causes genome-wide hypomethylation, dysregulated genome expression, and seedling lethality., 2014, 111(29): 10642–10647.

[2] Hu LJ, Li N, Zhang ZB, Meng XC, Dong QL, Xu CM, Gong L, Liu B. CG hypomethylation leads to complex changes in DNA methylation and transpositional burst of diverse transposable elements in callus cultures of rice., 2020, 101(1): 188–203.

[3] Berger SL, Kouzarides T, Shiekhattar R, Shilatifard A. An operational definition of epigenetics., 2009, 23(7): 781–783.

[4] Allis CD, Jenuwein T. The molecular hallmarks of epigenetic control., 2016, 17(8): 487–500.

[5] Li B, Carey M, Workman JL. The role of chromatin during transcription., 2007, 128(4): 707–719.

[6] Feinberg AP. The key role of epigenetics in human disease prevention and mitigation., 2018, 378(14): 1323–1334

[7] Ashe A, Colot V, Oldroyd BP. How does epigenetics influence the course of evolution?, 2021, 376(1826): 20200111.

[8] Lieberman-Lazarovich M, Kaiserli E, Bucher E, Mladenov V. Natural and induced epigenetic variation for crop improvement., 2022, 70: 102297.

[9] Zhang L, Lu QJ, Chang C. Epigenetics in health and disease., 2020, 1253: 3–55.

[10] Phillips T. The role of methylation in gene expression., 2008, 1(1): 116.

[11] Moore LD, Le T, Fan GP. DNA methylation and its basic function., 2013, 38(1): 23–38.

[12] Gallusci P, Dai ZW, Génard M, Gauffretau A, Leblanc- Fournier N, Richard-Molard C, Vile D, Brunel-Muguet S. Epigenetics for plant improvement: current knowledge and modeling avenues., 2017, 22(7): 610–623.

[13] Law JA, Jacobsen SE. Establishing, maintaining and modifying DNA methylation patterns in plants and animals., 2010, 11(3): 204–220.

[14] Cao XF, Jacobsen SE. Locus-specific control of asymmetric and CpNpG methylation by the DRM and CMT3 methyltransferase genes., 2002, 99(Suppl 4): 16491–16498.

[15] Stroud H, Greenberg MV, Feng SH, Bernatavichute YV, Jacobsen SE.Comprehensive analysis of silencing mutants reveals complex regulation of themethylome., 2013, 152(1–2): 352–364.

[16] Zemach A, Yvonne Kim M, Hsieh PH, Coleman-Derr D, Eshed-Williams L, Thao K, Harmer SL, Zilberman D. Thenucleosome remodeler DDM1 allows DNA methyltransferases to access H1-containing heterochromatin., 2013, 153(1): 193–205.

[17] Cokus SJ, Feng SH, Zhang XY, Chen ZG, Merriman B, Haudenschiil CD, Pradhan S, Nelson SF, Pellegrini M, Jacobsen SE. Shotgun bisulphite sequencing of thegenome reveals DNA methylation patterning., 2008, 452(7184): 215–219.

[18] Lister R, O’Malley RC, Tonti-Filippini J, Gregory BD, Berry CC, Harvey Millar A, Ecker JR. Highly integrated single-base resolution maps of the epigenome in., 2008, 133(3): 523–536.

[19] Mathieu O, Reinders J, Caikovski M, Smathajitt C, Paszkowski J. Transgenerational stability of theepigenome is coordinated by CG methylation., 2007, 130(5): 851–862.

[20] Pavlopoulou A, Kossida S. Plant cytosine-5 DNA methyltransferases: structure, function, and molecular evolution., 2007, 90(4): 530–541.

[21] Yamauchi T, Johzuka-Hisatomi Y, Fukada-Tanaka S, Terada R, Nakamura I, Iida S. Homologous recombination-mediated knock-in targeting of the MET1a gene for a maintenance DNA methyltransferase reproducibly reveals dosage-dependent spatiotemporal gene expression in rice., 2009, 60(2): 386–396.

[22] Yamauchi T, Johzuka-Hisatomi Y, Terada R, Nakamura I, Iida S. The MET1b gene encoding a maintenance DNA methyltransferase is indispensable for normal develop-ment in rice., 2014, 85(3): 219–232.

[23] Saze H, Mittelsten Scheid O, Paszkowski J. Maintenance of CpG methylation is essential for epigenetic inheritance during plant gametogenesis., 2003, 34(1): 65–69.

[24] Kankel MW, Ramsey DE, Stokes TL, Flowers SK, Haag JR, Jeddeloh JA, Riddle NC, Verbsky ML, Richards EJ.MET1 cytosine methyltransferase mutants., 2003, 163(3): 1109–1122.

[25] Kidwell KK, Osborn TC. Simple plant DNA isolation procedures. In: Beckmann JS, Osborn TC, eds. Plant Genomes: Methods for Genetic and Physical Mapping. Springer, Dordrecht, 1992.

[26] Jiang N, Bao ZR, Zhang XY, Hirochika H, Eddy SR, McCouch SR, Wessler SR. An active DNA transposon family in rice., 2003, 421: 163–167.

[27] Kikuchi K, Terauchi K, Wada M, Hirano HY. The plant MITEis mobilized in anther culture., 2003, 421: 167–170.

[28] Shan XH, Ou XF, Liu ZL, Dong YZ, Lin XY, Li XW, Liu B. Transpositional activation ofin an asymmetric nuclear somatic cell hybrid of rice andwas accompanied by massive element loss., 2009, 19: 1325–1333.

[29] Zhang XQ, Li N, Xie XM. Design and exploration of epigenetic comprehensive experiments., 2021, 43(12): 1179–1187.張向前, 李楠, 解新明. 表觀遺傳學(xué)綜合性實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與探討. 遺傳, 2021, 43(12): 1179–1187.

Epigenetics comprehensive experimental course based on the integration of science and education to cultivate students' ability of cutting-edge innovation

Xiufang Ou, Ying Wu, Ning Li, Lili Jiang, Bao Liu, Lei Gong

The integration of science and education is an effective way for universities to cultivate students in cutting-edge innovative interests. Epigenetics is the expansion of classical genetics, the corresponding experimental courses of which have not been integrated into the current teaching system. In this paper, by taking advantage of our laboratory's research on the DNA methylation maintenance gene,in rice, we have integrated our innovative findings in the education curriculum, and built a comprehensive teaching system on experimentation research, which greatly stimulates the curiosity of the students. Taking themutants and its isogenic wild-type rice plants as experimental materials, this course has successfully demonstrated a causal link between genetic mutation and epigenetic variation, a topic widely interested by the students in learning genetics and epigenetics. Through the practice of this course, students have a deeper understanding of the important role of epigenetic modifications, their scientific research capabilities have been greatly improved, thereby strongly supporting the cultivation of top innovative talents among the students.

integration of science and education; epigenetics comprehensive experiment; experimental education

2023-07-03;

2023-11-15;

2023-11-16

吉林省高等教育教改研究課題立項(xiàng)(編號(hào)：JLO4169120190727102937，JLJY202393805644，JG2020008)資助[Supported by the Higher Education Teaching Reform Research Topic of Jilin Province (Nos. JLO4169120190727102937, JLJY202393805644, JG2020008)]

歐秀芳，博士，副教授，研究方向：表觀遺傳學(xué)。E-mail: ouxf074@nenu.edu.cn

宮磊，博士，教授，研究方向：進(jìn)化生物學(xué)。E-mail: gongl100@nenu.edu.cn

10.16288/j.yczz.23-179

(責(zé)任編委: 陳德富)