張利娟，孟慶印，莊莉，龔泉，李雪芹，李仕娟，周春艷

昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院/云南省腫瘤醫(yī)院1康復(fù)與姑息醫(yī)學(xué)科，2病理科，昆明 650118

肺癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率和病死率均較高的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅人類生命健康。其中，小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）的發(fā)病率約占全部肺癌類型的15%[1]。與非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）相比，SCLC 具有分化程度低、惡性程度高、早期易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和血行轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)，只有少數(shù)患者有手術(shù)切除的機(jī)會[2]。既往，靶向治療為NSCLC 的治療帶來了顯著進(jìn)展，但SCLC的治療方法卻鮮有突破，對于大部分SCLC患者，目前主要的治療手段仍然是化療聯(lián)合放療[3]。盡管大多數(shù)SCLC 患者初始對化療及放療較為敏感，治療效果較好，但很快就會產(chǎn)生耐藥性或復(fù)發(fā)，限制了SCLC患者的總生存率，與NSCLC相比，SCLC患者的預(yù)后較差，是目前惡性腫瘤治療的難點(diǎn)[4]。肝激酶B1（liver kinase B1，LKB1）是1998 年被芬蘭及德國學(xué)者在黑色素斑-胃腸道多發(fā)性息肉綜合征（Peutz-Jeghers syndrome，PJS）患者中鑒定出來的抑癌基因[5]。LKB1 已被證實(shí)與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但目前其與SCLC 關(guān)系的研究較少。本研究探討LKB1 在SCLC 組織中的表達(dá)及與患者臨床特征的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015 年5 月至2021 年12 月昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院/云南省腫瘤醫(yī)院收治的SCLC 患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)術(shù)后（包括根治性手術(shù)及姑息性手術(shù)）病理學(xué)檢查確診為SCLC，均為首次接受治療；年齡18～80 歲；TNM 分期為Ⅰ～Ⅳ期。排除標(biāo)準(zhǔn)：既往接受過抗腫瘤治療；含有混合性病理成分；病歷資料不完整。依據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入45 例SCLC 患者，其中男37 例，女8 例；年齡30～73 歲，中位年齡60 歲；TNM 分期：Ⅰ～Ⅱ期29 例，Ⅲ～Ⅳ期16 例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移18 例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移27 例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)通過，所有患者均知情同意。

1.2 免疫組化法檢測LKB1 蛋白的表達(dá)情況

取45 例SCLC 患者的SCLC 組織及距腫瘤組織5 cm 以上的癌旁組織，連續(xù)4 μm 切片，采用鏈霉抗生物素蛋白-過氧化物酶（streptavidin-peroxidase，SP）免疫組化染色檢測LKB1 蛋白的表達(dá)情況。一抗采用鼠抗人LKB1 單克隆抗體，二抗采用辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）單克隆抗體。采用二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，以已知陽性切片作為陽性對照，以磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）作為陰性對照。

結(jié)果判定：采用雙盲法對免疫組化結(jié)果進(jìn)行判定，LKB1 蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核呈棕黃色顆粒判定為陽性細(xì)胞，以染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞所占比例進(jìn)行評分。陽性細(xì)胞所占比例≤10%計(jì)0 分，陽性細(xì)胞所占比例11%～30%計(jì)1 分，陽性細(xì)胞所占比例31%～60%計(jì)2 分，陽性細(xì)胞所占比例＞60%計(jì)3 分；基本不染色計(jì)0 分，淡染色計(jì)1 分，棕黃色染色計(jì)2 分，棕黑色染色計(jì)3 分。將陽性細(xì)胞所占比例評分和染色強(qiáng)度評分相乘，0～1 分為陰性（-），2～3 分為弱陽性（+），其中4～6 分為中等陽性（++），＞6 分為強(qiáng)陽性（+++）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0 軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LKB1 蛋白表達(dá)情況的比較

SCLC 組織中LKB1 蛋白陽性表達(dá)率為71.1%（32/45），明顯低于癌旁組織的95.6%（43/45），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.000，P＜0.01）。（圖1）

圖1 LKB1蛋白在SCLC組織中的表達(dá)情況（SP染色，×400）

2.2 不同臨床特征SCLC 患者SCLC 組織中LKB1蛋白表達(dá)情況的比較

不同性別、吸煙史SCLC 患者SCLC 組織中LKB1 蛋白陽性表達(dá)率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期為Ⅲ～Ⅳ期SCLC 患者SCLC 組織中LKB1 蛋白陽性表達(dá)率分別低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期為Ⅰ～Ⅱ期的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表1）

表1 不同臨床特征SCLC 患者SCLC 組織中LKB1 蛋白表達(dá)情況的比較

3 討論

SCLC 是最具侵襲性的肺癌，5 年生存率僅為6%[6]，SCLC 具有生長迅速和快速轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)，對多種治療方法明顯耐藥[7]。目前，SCLC患者尚不能從靶向治療中獲益，即使是加入了免疫檢查點(diǎn)抑制劑（immune checkpoint inhibitor，ICI），SCLC 整體療效的改善也并不理想[8-9]。SCLC的這一現(xiàn)狀與NSCLC形成了鮮明的對比，在NSCLC 中，ICI 治療和靶向治療徹底改變了NSCLC 患者的生存結(jié)局[10]。因此，深入探討SCLC 的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，尋找新的診斷及治療靶點(diǎn)對SCLC 的防治有重要意義。抑癌基因LKB1已被證實(shí)在胃癌、腸癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤中存在異常表達(dá)[11]。LKB1失活已被證明可以促進(jìn)腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移，并改變對ICI 治療的反應(yīng)[12-16]。在NSCLC 樣大細(xì)胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌（large-cell neuroendocrine carcinoma，LCNEC）的一個亞群中也發(fā)現(xiàn)了復(fù)發(fā)的絲氨酸/蘇氨酸激酶11（serine/threonine kinase 11，STK11）突變[17]。相比之下，LKB1突變在SCLC 中尚未被確定為復(fù)發(fā)性事件，且對SCLC 中的LKB1 知之甚少[18]。有研究認(rèn)為，SCLC 中不存在LKB1突變[19]，但亦有研究證實(shí)，SCLC 中存在LKB1突變[20]，因此，LKB1 與SCLC 之間的關(guān)系亟待進(jìn)一步驗(yàn)證。目前關(guān)于SCLC 與LKB1 的國內(nèi)外相關(guān)研究報(bào)道較少。本研究探討LKB1 在SCLC 中的表達(dá)及與患者臨床特征的關(guān)系。

本研究結(jié)果顯示，SCLC 組織中LKB1 蛋白的陽性表達(dá)率為71.1%，明顯低于癌旁組織的95.6%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。表明SCLC 癌旁正常肺組織中LKB1 蛋白表達(dá)較高，LKB1 蛋白在SCLC 中可能具有一定程度的抑癌作用。進(jìn)一步對臨床特征的分析顯示，不同性別、吸煙史SCLC患者SCLC 組織中LKB1 蛋白陽性表達(dá)率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移SCLC患者SCLC 組織中LKB1 蛋白陽性表達(dá)率低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。表明在SCLC 中，LKB1 蛋白的表達(dá)可能與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，LKB1 蛋白陽性表達(dá)率較低的患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率較高，LKB1 蛋白可能在一定程度上抑制了SCLC 的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果顯示，TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期SCLC 患者SCLC 組織中LKB1 蛋白陽性表達(dá)率低于TNM 分期為Ⅰ～Ⅱ期的患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。表明LKB1 蛋白的表達(dá)與SCLC 發(fā)展進(jìn)程有關(guān)。

本研究結(jié)果證實(shí)了LKB1 蛋白在SCLC 發(fā)生發(fā)展中的重要作用，這與Sivakumar 等[21]的研究結(jié)果相符，該研究對3600 例SCLC 患者多達(dá)324 個腫瘤相關(guān)基因的外顯子進(jìn)行深度測序，發(fā)現(xiàn)了其中62例患者存在LKB1基因突變，占整個研究人群的1.7%，降低了這些患者的生存率。因此，有研究將LKB1突變作為SCLC 的一種新的基因亞型，更令人驚訝的是，有研究分析256 例非洲SCLC 患者的病歷資料分析發(fā)現(xiàn)，這些患者多數(shù)為RB1、腫瘤蛋白p53（tumor protein p53，TP53）野生型和LKB突變型，表明LKB突變型可能與不同種族有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，SCLC 組織中LKB1 蛋白的陽性表達(dá)率為71.1%，LKB1 蛋白表達(dá)情況與SCLC 患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM 分期有關(guān)，提示LKB1 可能作為SCLC 的潛在診斷、治療和預(yù)后評估靶點(diǎn)，有望為SCLC 患者帶來新的治療希望。LKB1 蛋白在SCLC 組織中低表達(dá)的原因尚不能完全明確，除基因突變外是否還有其他機(jī)制，LKB1 低表達(dá)在SCLC 中發(fā)生發(fā)展過程中所發(fā)揮的作用及相關(guān)信號通路尚未完全闡明，中國人群中LKB1突變情況如何等問題也有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，LKB1 蛋白在SCLC 中低表達(dá)，其表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM 分期有關(guān)，有望作為SCLC 患者潛在的治療靶點(diǎn)和預(yù)后評估指標(biāo)。