陸思楚 周 新 閆洪超

子宮內(nèi)膜癌(endometrial carcinoma,EC)是婦科常見的三大惡性腫瘤之一,是歐美最常見的婦科惡性腫瘤,其發(fā)生率占女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的20%～30%[1]。近年來,隨著女性內(nèi)分泌代謝疾病發(fā)生率升高、婚孕年齡推遲及壽命延長等原因,EC發(fā)生率逐年上升,且趨于年輕化,嚴(yán)重危害著女性身體健康。雖然通過影像學(xué)或其他方法可以早期診斷內(nèi)膜癌,通過手術(shù)治療或結(jié)合輔助放化療使預(yù)后良好。但是部分患者容易發(fā)生轉(zhuǎn)移,5年生存率往往較低[2]。因此,發(fā)現(xiàn)影響EC惡化進(jìn)展的生物學(xué)標(biāo)志物,研究EC的侵襲和遷移機(jī)制,尋找新的治療靶點(diǎn)具有重要意義。

同源異型盒基因4 (sine oculis homeobox homolog 4, SIX4)是人類同源異型盒家族成員之一。最初研究顯示,SIX4在哺乳動物的組織器官發(fā)育中起著重要的作用。近年來一些研究表明,SIX4也參與調(diào)控腫瘤的分化與進(jìn)展,可能通過上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition, EMT)增強(qiáng)腫瘤的侵襲和遷移[3]。EMT是腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的重要前提,在此過程中上皮細(xì)胞極性喪失,間充質(zhì)樣特性形成,其特征包括E-cadherin表達(dá)減少及N-cadherin表達(dá)升高[4]。目前SIX4基因與EC的關(guān)系尚未見報道,其是否參與了EC致癌機(jī)制,是通過何種信號通路來調(diào)控腫瘤進(jìn)展的有待于進(jìn)一步研究。SIX4有望成為新的癌癥治療靶點(diǎn),進(jìn)而對該基因進(jìn)行靶向藥物的研制與開發(fā),以為臨床治療提供進(jìn)一步依據(jù)。

本研究將采用實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)法檢測SIX4在子宮內(nèi)膜腺癌組織中的表達(dá)水平,并探討其與子宮內(nèi)膜腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系。運(yùn)用RNA技術(shù)靶向抑制內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞中SIX4蛋白的表達(dá),并觀察抑制SIX4表達(dá)后對E-cadherin、N-cadherin的表達(dá)及內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響,以期為子宮內(nèi)膜癌的臨床診斷和治療提供新的思路和方法。

材料與方法

1.臨床標(biāo)本:選取2021年1月～2022年3月于徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院行手術(shù)治療的子宮內(nèi)膜腺癌患者60例?；颊吣挲g34～77歲,平均年齡為55.48±4.62歲;FIGO分期:Ⅰ～Ⅱ期34例,Ⅲ～Ⅳ期26例;浸潤肌層程度<1/2 38例, ≥1/2 22例。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性36例,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性24例;納入標(biāo)準(zhǔn):①所有臨床標(biāo)本術(shù)后病理證實(shí)為子宮內(nèi)膜腺癌;②術(shù)前未接受放化療及生物靶向治療;③不合并其他類型腫瘤病史及影響預(yù)后的慢性疾病史;④臨床資料完整。同期收集因子宮良性病變行刮宮術(shù)或全子宮切除術(shù),且術(shù)后病理證實(shí)為正常內(nèi)膜的組織標(biāo)本30例作為對照組,年齡38～64歲,平均年齡為50.42±5.91歲。本研究已征得患者的知情同意及徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)(倫理學(xué)審批號:XYFY2022-KL150-01)。

2.實(shí)驗(yàn)材料:Ishikawa細(xì)胞株復(fù)蘇于徐州醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室,RPMI-1640培養(yǎng)基購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司;胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司;兔抗人SIX4多克隆抗體及內(nèi)參兔抗人GAPDH多克隆抗體均購自美國Proteintech公司;E-cadherin、N-cadherin抗體均購自美國ABMART公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒和RT-qPCR試劑盒均購自上海吉瑪公司;SIX4引物序列、內(nèi)參引物序列、SIX4siRNA及對照siRNA均由上海吉瑪公司設(shè)計(jì)合成;Transwell小室購自美國Millipore公司;胰蛋白酶、脂質(zhì)體(Lipofectamine 8000)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

3.RT-qPCR法檢測SIX4的表達(dá):Trizol法分別提取內(nèi)膜癌組、對照組組織中的總RNA,RT-qPCR法分別檢測其表達(dá)水平。產(chǎn)物與GAPDH內(nèi)參進(jìn)行校正,2-ΔΔCt法測定其相對表達(dá)量。

4.細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞轉(zhuǎn)染:(1)細(xì)胞培養(yǎng):在37℃,5%的CO2的恒溫培養(yǎng)箱中,使用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素溶液的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)子宮內(nèi)膜腺癌Ishikawa細(xì)胞,孵育至細(xì)胞融合95%左右進(jìn)行傳代,傳3～4代細(xì)胞處于對數(shù)生長期時進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。(2)細(xì)胞轉(zhuǎn)染:將生長狀態(tài)良好的細(xì)胞接種于6孔板繼續(xù)培養(yǎng),待細(xì)胞融合至70%左右進(jìn)行轉(zhuǎn)染。利用Lipofectamine 8000將3條siRNA及陰性對照siRNA-NC分別轉(zhuǎn)染子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞,48h后收集細(xì)胞檢測。siRNA-1上游引物:5′-GGCGAGGA-GACGGUGUAUUTT-3′,siRNA-1下游引物:5′-AAUACACCGUCUCCUGGCCTT-3′;siRNA-2上游引物:5′-CCAGUUCAUCUGAUGGCAUTT-3′,siRNA-2下游引物:5′-AUGCCAUCAGAUGAACUGGTT-3′;siRNA-3上游引物:5′-GCUUCGAGUCGGCCAACCATT-3′,siRNA-3下游引物:5′-UGGUUGGCCGACUCGAAGCTT-3′;siRNA-NC上游引物:5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′,siRNA-NC下游引物:5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。

5.RT-qPCR法檢測各組細(xì)胞SIX4mRNA表達(dá)水平:于轉(zhuǎn)染48h后收集各組細(xì)胞,Trizol法提取RNA。用RT-qPCR法檢測SIX4mRNA表達(dá)水平。產(chǎn)物與內(nèi)參GAPDH進(jìn)行比較,2-ΔΔCt法測定相對表達(dá)量。

6.Western blot法:轉(zhuǎn)染48h后裂解細(xì)胞并收集蛋白,二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)法檢測蛋白濃度后進(jìn)行Western blot法檢測,成像后使用ImageJ軟件進(jìn)行分析。

7.Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力:上室預(yù)先用Matrige基質(zhì)膠(1∶8稀釋)包被,制備細(xì)胞懸液后以4×104個/孔密度接種于上室,下室中加入600μl含10%胎牛血清的培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24h取出。用4%多聚甲醛固定1h,結(jié)晶紫染色15min,用棉簽擦去未遷移細(xì)胞后磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution, PBS)沖洗3次。隨機(jī)選取5個視野計(jì)算細(xì)胞數(shù),取其平均值進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

8.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力:轉(zhuǎn)染后待各組細(xì)胞密度接近100%,用200μl無菌槍頭進(jìn)行劃痕,PBS沖洗脫落細(xì)胞后加入1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),分別在0h和24h在顯微鏡下觀察,選取不同視野標(biāo)記拍照,使用ImageJ軟件計(jì)算細(xì)胞劃痕面積并進(jìn)行分析。遷移率(%)=(0h劃痕面積-24h劃痕面積/0h劃痕面積)×100%。

結(jié) 果

1.SIX4mRNA在內(nèi)膜癌組和對照組中的表達(dá):SIX4mRNA在內(nèi)膜癌組和對照組中的相對表達(dá)量分別為1.000、0.288±0.076,內(nèi)膜癌組中,其表達(dá)水平較對照組明顯升高(P<0.05),詳見圖1。其中60例子宮內(nèi)膜腺癌中,SIX4mRNA的表達(dá)水平與子宮內(nèi)膜癌患者的年齡、組織類型和分化程度均無關(guān)(P>0.05),與肌層浸潤、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和FIGO分期相關(guān)(P<0.05),詳見表1。

表1 SIX4mRNA表達(dá)水平與子宮內(nèi)膜癌臨床病理特征之間的關(guān)系

圖1 SIX4mRNA在各子宮內(nèi)膜組織中的相對表達(dá)量

2.SIX4干擾效果:RT-qPCR檢測結(jié)果顯示,正常組、陰性對照組、抑制組1、抑制組2及抑制組3的SIX4mRNA相對表達(dá)量分別為1.000、0.892±0.062、0.281±0.025、0.106±0.016及0.517±0.062,其中抑制組2干擾效果最明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),故選取干擾效果最好的抑制組2進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn),詳見圖2。

圖2 RNA干擾對各組細(xì)胞SIX4mRNA表達(dá)的影響與正常組比較,*P<0.01,#P<0.001

3.SIX4、E-cadherin及N-cadherin蛋白表達(dá)水平:相較于正常組,陰性對照組SIX4、E-cadherin及N-cadherin蛋白表達(dá)水平未見明顯差異;相較于正常組,抑制組2 E-cadherin蛋白表達(dá)水平升高,SIX4、N-cadherin蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05),詳見圖3。

圖3 RNA干擾對Ishikawa細(xì)胞SIX4、E-cadherin及N-cadherin蛋白表達(dá)影響A.3組細(xì)胞中SIX4、E-cadherin及N-cadherin蛋白表達(dá)結(jié)果;B.3組細(xì)胞中SIX4、E-cadherin及N-cadherin蛋白水平的表達(dá)量。*P<0.05,**P<0.01

4.3組Ishikawa細(xì)胞侵襲能力比較:正常組穿膜細(xì)胞數(shù)為203.3±15.5個,陰性對照組穿膜細(xì)胞數(shù)為187.7±15.2個,抑制組2穿膜細(xì)胞數(shù)為86.0±7.5個。數(shù)據(jù)分析顯示,陰性對照組穿膜細(xì)胞數(shù)與正常組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,抑制組2明顯低于正常組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),詳見圖4。

圖4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力A.3組細(xì)胞Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果(結(jié)晶紫染色,×400);B.3組細(xì)胞穿膜細(xì)胞的個數(shù)。與正常組比較,*P<0.05

5.3組Ishikawa細(xì)胞遷移能力比較:劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,正常組遷移率為46.36%±3.36%,陰性對照組遷移率為39.06%±2.43%,抑制組2遷移率為18.74%±5.45%。與陰性對照組比較,正常組遷移率未見明顯差異,抑制組遷移率明顯低于陰性對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),詳見圖5。

圖5 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力A.3組細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果(×200);B.3組細(xì)胞的遷移率。與正常組比較,*P<0.01

討 論

EC是歐美發(fā)達(dá)國家最常見的女性惡性腫瘤,終身發(fā)病風(fēng)險為2.7%,其在中國發(fā)生率也呈逐年增加趨勢,對女性健康造成極大危害[5]。目前EC發(fā)病機(jī)制尚未完全明確,根治性手術(shù)是治療早期EC的最重要方法,而對于無法接受手術(shù)的中晚期EC患者,探索EC新的治療靶點(diǎn)具有極其重要的意義。

人類SIX家族由6個成員組成:SIX1、SIX2、SIX3、SIX4、SIX5和SIX6。SIX家族蛋白作為腫瘤干細(xì)胞相關(guān)的表面標(biāo)志物,不僅是器官發(fā)生的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,而且在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起著關(guān)鍵作用[6]。SIX4定位于人類染色體14q23上,是一段高度保守DNA編碼基因序列,通過將DNA序列與靶基因結(jié)合,既可以作為轉(zhuǎn)錄抑制因子,也可以作為轉(zhuǎn)錄激活因子,進(jìn)而調(diào)節(jié)鈉鉀泵亞基的表達(dá),也參與細(xì)胞生存、分化和遷移等過程[3, 7, 8]。作為SIX蛋白家族中的一員,SIX4與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程必然密不可分。在婦科腫瘤中,有研究證實(shí),SIX4的過表達(dá)可促進(jìn)卵巢癌的增殖、侵襲及遷移[9]。在其他腫瘤中,Sun等[10]研究表明,SIX4基因在結(jié)直腸癌中的高表達(dá),且導(dǎo)致預(yù)后不良,其作用機(jī)制為SIX4通過與缺氧誘導(dǎo)因子-1α協(xié)同上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子-α的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)腫瘤生長。Tang等[11]實(shí)驗(yàn)證實(shí)SIX4在非小細(xì)胞肺癌中增強(qiáng)腫瘤增殖、侵襲與遷移能力。

有研究顯示,肝癌中SIX4的高表達(dá)與TNM分期及生存期相關(guān),可能參與了EMT進(jìn)程[12]。Sun等[13]研究證實(shí),SIX4在乳腺癌組織中的表達(dá)異常增高,機(jī)制為SIX4通過促進(jìn)磷酸化的STAT3核易位,激活EMT通路,從而加速腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。近年來有研究表明,在食管鱗狀細(xì)胞中敲低SIX4的表達(dá)后,EMT相關(guān)的分子標(biāo)志物發(fā)生逆轉(zhuǎn),提示敲低SIX4后部分逆轉(zhuǎn)食管癌細(xì)胞的EMT過程[14]。此外,SIX4作為miR-203a的靶基因,參與了膀胱癌的惡性發(fā)展和EMT[15]。

因此,雖然SIX4已被證實(shí)在許多腫瘤中存在異常表達(dá),但卻少有研究探討其與子宮內(nèi)膜癌間的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系。本研究將探索SIX4與子宮內(nèi)膜癌之間的聯(lián)系,首先通過RT-qPCR法檢測SIX4在子宮內(nèi)膜腺癌組織樣本中的表達(dá)水平,結(jié)果顯示,SIX4在內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)量顯著高于正常內(nèi)膜組織,且其表達(dá)水平與子宮內(nèi)膜癌的FIGO分期、肌層浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移臨床病理特征相關(guān),表明了SIX4表達(dá)水平與子宮內(nèi)膜癌的惡性程度及進(jìn)展呈正相關(guān)。

為了進(jìn)一步探究SIX4在子宮內(nèi)膜癌惡性進(jìn)展中的具體作用機(jī)制,將靶向抑制SIX4的siRNA轉(zhuǎn)染至內(nèi)膜腺癌Ishikawa細(xì)胞系,進(jìn)而獲得了低表達(dá)SIX4的Ishikawa細(xì)胞。用Western blot法檢測到抑制SIX4表達(dá)后,E-cadherin表達(dá)升高,N-cadherin的表達(dá)降低,這表明SIX4通過參與EMT過程促進(jìn)腫瘤進(jìn)展,抑制其表達(dá)后可部分逆轉(zhuǎn)。Transwell實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,敲低Ishikawa細(xì)胞內(nèi)SIX4的表達(dá)后,其侵襲及遷移能力受到明顯抑制,這表明SIX4的高表達(dá)在子宮內(nèi)膜腺癌惡性進(jìn)展中具有重要的作用。然而本研究中的總體樣本量和涉及的EMT相關(guān)標(biāo)志物較少,所以實(shí)驗(yàn)未能探究更深層次的作用機(jī)制,其相關(guān)機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述,SIX4在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮一定的作用,其可能通過EMT過程促進(jìn)腫瘤進(jìn)展,抑制其表達(dá)可降低子宮內(nèi)膜腺癌Ishikawa細(xì)胞侵襲和遷移能力,SIX4有潛力成為子宮內(nèi)膜癌診斷的生物學(xué)標(biāo)志物及防治新靶點(diǎn)。