肖 娜 夏素芹 李 莉

胃癌是全球第五大常見的惡性腫瘤,其發(fā)生率及病死率占我國惡性腫瘤的第2位[1]。早期胃癌患者經(jīng)內(nèi)鏡及外科治療后,其5年生存率可達(dá)91%[2]。由于其早期癥狀不典型,絕大多數(shù)患者確診時已處于中晚期,失去了手術(shù)治療的機(jī)會,其5年生存率不超過25%[3]。因此,早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療是胃癌診療中的關(guān)鍵。

動力蛋白激活蛋白(dynactin, DCTN)是一種多亞基復(fù)合物,通過激活動力蛋白,參與細(xì)胞的有絲分裂、細(xì)胞骨架重新組裝及調(diào)控物質(zhì)向微管負(fù)端運(yùn)輸,在各種細(xì)胞功能中發(fā)揮著許多重要作用[4]。DCTN2目前被認(rèn)為是DCTN的主要調(diào)節(jié)者和微管交通的組織者,與惡性黑色素瘤、結(jié)腸腺癌等多種疾病的發(fā)生有關(guān),因?yàn)槠潺嫶蠖鴱?fù)雜的結(jié)構(gòu),其作用的機(jī)制尚未得到充分研究[5,6]。

腫瘤高表達(dá)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白(cell-cycle-related and expression-elevated protein in tumor,CREPT)能夠和轉(zhuǎn)錄中的關(guān)鍵酶--RNA聚合酶Ⅱ(RNAPⅡ)在癌基因細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)上結(jié)合,使Cyclin D1基因形成環(huán)狀結(jié)構(gòu),從而促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄,加速細(xì)胞周期的進(jìn)程、增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移能力,促進(jìn)腫瘤的發(fā)生與發(fā)展,為腫瘤的基因診斷和基因靶向治療提供了新思路[7]。目前已發(fā)現(xiàn)CREPT與非小細(xì)胞肺癌、腎癌、宮頸癌等腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展密切相關(guān),而CREPT在胃癌中的表達(dá)水平及其與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系尚不明確[8～10]。本研究通過免疫組化法檢測DCTN2和CREPT在胃癌及癌旁組織中的表達(dá)水平,分析其與胃癌患者的臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系,初步探討DCTN2和CREPT在胃癌診斷及預(yù)后預(yù)測中的價值。

對象與方法

1.研究對象:納入2014年3月～2015年9月在徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院初治并接受胃癌切除術(shù)的90例胃癌患者,其中男性51例,女性39例,患者中位年齡為61歲,回顧性收集90例胃癌患者的術(shù)后腫瘤組織、癌旁組織(取材距腫瘤邊緣≥5.0cm,且病理證實(shí)無腫瘤細(xì)胞浸潤)和臨床資料,所有患者均經(jīng)組織病理學(xué)證實(shí)為胃癌,其中70例胃癌患者術(shù)后接受化療,20例患者術(shù)后未化療。納入標(biāo)準(zhǔn):①組織病理學(xué)確診為胃癌;②初治患者,術(shù)前未接受放療、化療、靶向治療等抗腫瘤治療;③具有完整的腫瘤標(biāo)志物及影像學(xué)評估資料;④隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn):①無明確病理診斷信息;②合并有高血壓、糖尿病、冠心病等基礎(chǔ)病或其他腫瘤;③隨訪信息不完整或失訪者。隨訪90例胃癌患者的1、3、5年生存率,隨訪截止時間為2022年9月,納入的90例患者均完成隨訪。在長期隨訪中,死亡患者均因胃癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移所致。本研究獲得徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會審核批準(zhǔn)。

2.免疫組化法檢測及結(jié)果判讀:采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶(SP)連結(jié)法進(jìn)行免疫組化染色,即:組織切片經(jīng)烤片、二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化、內(nèi)源性過氧化物酶滅活、抗原修復(fù)、通透、封閉后,滴加DCTN2單克隆抗體(1∶200,Proteintech,武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)和CREPT單克隆抗體(1∶200,美國Thermo Fisher公司),將組織切片置于4℃孵育過夜。次日取出組織切片置于37℃復(fù)溫45min,滴加生物素標(biāo)記的二抗(1∶200,徐州微科曼得生物工程有限公司),37℃條件下孵育1h,滴加SP后37℃條件下孵育30min。上述反應(yīng)中,除血清封閉外,其余各步后均需用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution, PBS)漂洗。隨后滴加DAB液顯色10min,自來水沖洗10min后終止反應(yīng),使用蘇木精(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)復(fù)染2min,鹽酸乙醇分化,充分水洗返藍(lán)后,梯度乙醇脫水,二甲苯溶液透明,干燥后使用中性樹膠封片,光學(xué)顯微鏡下觀察拍照并保存。

病理參數(shù)采用陽性腫瘤細(xì)胞百分比評分和染色深度評分的乘積進(jìn)行評估。陽性腫瘤細(xì)胞百分比評分是選取鏡下5個視野(×400倍鏡)的陽性細(xì)胞平均數(shù)計分:0～5%為0分,6%～25%為1分,26%～50%為2分,51%～75%為3分,76%～100%為4分。染色深度評分是多數(shù)細(xì)胞呈現(xiàn)的染色深淺與背景著色情況對比計分:無著色為0分,淡黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分。2個參數(shù)相乘得出免疫反應(yīng)性評分(immunereactivity score, IRS),范圍為0～12分,評分<6分記為低表達(dá),≥6分記為高表達(dá)。

3.統(tǒng)計學(xué)方法:應(yīng)用SPSS 26.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析,采用Graphpad prism 8進(jìn)行做圖。計數(shù)資料以例數(shù)(百分比)[n(%)]表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn);采用Spearman法分析DCTN2與CREPT表達(dá)的相關(guān)性;采用Kaplan-Meier法分析DCTN2和CREPT的表達(dá)水平與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系并繪制生存曲線圖,組間差異比較采用Log-rank檢驗(yàn);采用COX比例風(fēng)險模型進(jìn)行單因素和多因素分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1. DCTN2和CREPT在胃癌及癌旁組織中的表達(dá)水平:免疫組化結(jié)果顯示,DCTN2蛋白表達(dá)定位于胃癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中,CREPT蛋白表達(dá)定位于細(xì)胞核內(nèi)。對DCTN2和CREPT的表達(dá)水平進(jìn)行統(tǒng)計分析后得知,胃癌組織中有68例(75.56%)出現(xiàn)DCTN2高表達(dá),而癌旁組織中僅有20例(22.22%)出現(xiàn)DCTN2高表達(dá),癌組織中DCTN2的高表達(dá)率明顯高于癌旁組織,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。胃癌組織和癌旁組織中分別有66例(73.33%)和26例(28.89%)出現(xiàn)CREPT高表達(dá),癌組織中CREPT高表達(dá)率亦明顯高于癌旁組織,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001),詳見圖1和表1。

表1 DCTN2和CREPT在胃癌和癌旁組織中的表達(dá)情況[n(%)]

圖1 免疫組化法檢測DCTN2和CREPT在胃癌組織和癌旁組織中的表達(dá)(×400)A.胃癌組織中DCTN2的表達(dá)(高表達(dá));B.癌旁組織中DCTN2的表達(dá)(低表達(dá));C.胃癌組織中CREPT的表達(dá)(高表達(dá));D.癌旁組織中CREPT的表達(dá)(低表達(dá))

2.胃癌組織中DCTN2與CREPT的表達(dá)相關(guān)性:胃癌組織中共有60例(66.67%)出現(xiàn)DCTN2與CREPT共同高表達(dá),12例(13.33%)出現(xiàn)DCTN2與CREPT共同低表達(dá),兩者在胃癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.442,P<0.05)。

3.胃癌組織中DCTN2和CREPT表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系:胃癌組織中DCTN2和CREPT的表達(dá)水平與患者的分化程度、TNM分期、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān),即分化程度越低、TNM分期越高(Ⅲ～Ⅳ期)、浸潤深度越深(T3～T4)、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌患者更容易出現(xiàn)DCTN2和CREPT高表達(dá),差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。此外,患者的性別、年齡、是否出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移對DCTN2和CREPT的表達(dá)無顯著影響,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),詳見表2。

表2 胃癌組織中DCTN2和CREPT表達(dá)水平與患者臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

4.胃癌組織中DCTN2和CREPT表達(dá)水平對患者預(yù)后的影響:DCTN2高表達(dá)組胃癌患者的術(shù)后1、3、5年累積生存率及總生存率分別為86.76%、69.12%、52.94%和20.59%,均明顯低于DCTN2低表達(dá)組胃癌患者的術(shù)后1、3、5年累積生存率及總生存率(分別為100.00%、85.71%、68.18%和54.55%),差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。CREPT高表達(dá)組胃癌患者的術(shù)后1、3、5年累積生存率及總生存率分別為69.70%、46.97%、22.73%和19.70%,均明顯低于CREPT低表達(dá)組胃癌患者的術(shù)后1、3、5年累積生存率及總生存率(分別為100.00%、83.33%、70.73%和62.50%),差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05),詳見表3、圖2和圖3。

表3 胃癌組織中DCTN2和CREPT表達(dá)水平對患者生存率的影響[n(%)]

圖2 胃癌組織中DCTN2表達(dá)水平對患者總生存期的影響

圖3 胃癌組織中CREPT水平對患者總生存期的影響

5.影響胃癌患者預(yù)后的單因素和多因素COX回歸分析:單因素COX回歸分析結(jié)果顯示,DCTN2表達(dá)水平、CREPT表達(dá)水平、年齡、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是影響患者預(yù)后的重要因素(P<0.05),詳見表4。將上述結(jié)果中差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)的預(yù)后因子進(jìn)一步納入多因素COX比例風(fēng)險回歸模型,結(jié)果顯示,DCTN2表達(dá)水平、CREPT表達(dá)水平、TNM分期及有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是影響胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險因素,即DCTN2高表達(dá)、CREPT高表達(dá)、TNM高分期(Ⅲ～Ⅳ期)及有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的胃癌患者的死亡風(fēng)險分別是DCTN2低表達(dá)、CREPT低表達(dá)、TNM低分期(Ⅰ～Ⅱ期)及無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的胃癌患者的4.790、4.516、4.647、10.517倍,詳見表5。

表4 影響胃癌患者預(yù)后的單因素COX回歸分析

表5 影響胃癌患者預(yù)后的多因素COX回歸分析

討 論

胃癌是一種分子和表型高度異質(zhì)的疾病,在全球惡性腫瘤中居第5位,是第三大常見癌癥死亡原因,幽門螺桿菌感染、年齡、高鹽及低水果和蔬菜飲食是其主要的危險因素[11]。盡管手術(shù)、化療、靶向治療、放療、免疫治療等治療手段不斷進(jìn)步,其預(yù)后仍不理想。因此,早期診斷胃癌及尋找新的治療靶點(diǎn),是目前研究的重點(diǎn)。

細(xì)胞質(zhì)動力蛋白是一種以腺苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)為能量將化學(xué)能轉(zhuǎn)化為機(jī)械能的蛋白質(zhì),為真核細(xì)胞中分子貨物向微管負(fù)端運(yùn)輸提供動力[12]。DCTN可與動力蛋白尾部結(jié)合,激活其產(chǎn)生生物學(xué)活性[13],此過程需要尖端蛋白Arp11、p62、p25和p27等協(xié)助,再通過結(jié)合不同接頭蛋白,如Bicaudal-D2(BICD2)、HookA組成沿著微管移動輸送貨物的運(yùn)輸機(jī)器[14,15]。DCTN蛋白是由DCTN家族基因(DCTN1～6)編碼的多亞基蛋白質(zhì),具有參與激活動力蛋白、細(xì)胞有絲分裂、細(xì)胞骨架重新組裝和細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)茸饔肹4]。DCTN2基因位于染色體12q13～q15上,該區(qū)域在多種癌癥中穩(wěn)定擴(kuò)增。DCTN2在人皮膚黑色素瘤、結(jié)腸癌、低級別膠質(zhì)瘤等多種腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)[5,6,16,17]。

近年來研究表明,DCTN2與動力蛋白依賴性自噬體聚集和自噬成熟有關(guān)[18]。除此以外,DCTN2通過調(diào)控腫瘤血管的異常生成,促進(jìn)腫瘤的細(xì)胞增殖及侵襲。本研究發(fā)現(xiàn),胃癌組織中DCTN2呈高表達(dá)狀態(tài),分化程度越低、TNM分期越高(Ⅲ～Ⅳ期)、浸潤深度越深(T3～T4)、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌患者更容易出現(xiàn)DCTN2高表達(dá),且DCTN2高表達(dá)胃癌患者的術(shù)后1、3、5年累積生存率及總生存率均顯著低于DCTN2低表達(dá)的胃癌患者,此外,DCTN2的表達(dá)水平是影響胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素,這些提示DCTN2可能與胃癌的發(fā)生與進(jìn)展有關(guān),DCTN2的高表達(dá)是胃癌患者預(yù)后不佳的影響因素之一。

CREPT是酵母Rtt103的人類同源物,定位于20號染色體,是含有C末端結(jié)構(gòu)域、相互作用結(jié)構(gòu)域的含核前mRNA結(jié)構(gòu)域的調(diào)節(jié)蛋白,主要參與DNA損傷修復(fù)和終止RNA轉(zhuǎn)錄,細(xì)胞周期轉(zhuǎn)變失控以及細(xì)胞周期相關(guān)基因和蛋白表達(dá)改變促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生[19,20]。2012年,我國研究者報道了人類腫瘤相關(guān)的一個新基因--CREPT,并提出CREPT通過增強(qiáng)RNA聚合酶Ⅱ(RNAPⅡ)向CyclinD1啟動子區(qū)域募集,促進(jìn)染色質(zhì)環(huán)形成并阻RNAPⅡ讀取基因3′末端終止位點(diǎn),從而增加CyclinD1的轉(zhuǎn)錄,加速細(xì)胞周期G1/S期轉(zhuǎn)變,從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖,加速腫瘤生長[7]。同時CREPT調(diào)控細(xì)胞周期蛋白B1促進(jìn)細(xì)胞周期G2/M期轉(zhuǎn)變[20]。此外,CREPT還可以誘導(dǎo)CDNK1、CDK6和C-MY等細(xì)胞周期相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄,最終加速細(xì)胞周期,促進(jìn)細(xì)胞增殖。

近年來,研究表明,CREPT可通過與p300相互作用促進(jìn)Wnt/β-連環(huán)蛋白途徑,從而促進(jìn)癌癥生長,也可增強(qiáng)STAT3轉(zhuǎn)錄活性,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、集落形成,從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[21,22]。CREPT在非小細(xì)胞肺癌、結(jié)腸癌、腎癌、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌等多種腫瘤中高表達(dá),且與不良預(yù)后密切相關(guān)[8～10,23,24]。在本研究中,胃癌組織中CREPT表達(dá)水平顯著高于癌旁組織,CREPT表達(dá)水平與胃癌的分化程度、TNM分期、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),進(jìn)一步說明CREPT高表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移。此外,本研究的預(yù)后分析結(jié)果顯示,CREPT高表達(dá)的胃癌患者術(shù)后5年生存率及總生存率顯著低于CREPT低表達(dá)者,CREPT表達(dá)水平是影響胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素。

綜上所述,DCTN2和CREPT有望成為胃癌診斷的新型標(biāo)志物及治療新靶點(diǎn),并有助于判斷胃癌患者的預(yù)后。但本研究樣本量較小,未能深入研究DCTN2和CREPT在胃癌發(fā)病機(jī)制中的相互作用,需擴(kuò)大樣本量以及進(jìn)一步對兩者之間的相互作用關(guān)系及致癌機(jī)制進(jìn)行深入研究。