鄭學(xué)斌 沙莎 楊慧瓊 劉戀

長沙市第四醫(yī)院（湖南師范大學(xué)附屬長沙醫(yī)院）全科醫(yī)學(xué)科（長沙 410006）

心肌梗死（myocardial infarction，MI）是一個重大的公共衛(wèi)生問題，隨著治療策略的改進(jìn)，其病死率正在下降［1］。然而，在沒有建立靶向治療的情況下，與MI相關(guān)的心力衰竭仍然是一個主要問題。心肌梗死后心臟重塑是由左心室形狀和功能的若干變化引起的，最終導(dǎo)致繼發(fā)于心臟纖維化病理變化的心力衰竭［2］。作為真核信使RNA（mRNA）最豐富的化學(xué)修飾，已知N6-甲基腺苷（m6A）通過調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)來影響各種基本的生物過程［3］。m6A水平的改變介導(dǎo)細(xì)胞凋亡、增殖、自我更新和發(fā)育［4］。然而，m6A甲基化在MI進(jìn)展中的潛在作用仍有待進(jìn)一步挖掘。甲基轉(zhuǎn)移酶樣14（methyltransferase-like 14，METTL14）是一種m6A寫入蛋白，廣泛參與了心血管發(fā)病機(jī)制等重大疾病的進(jìn)展［5］。最近研究證實，METTL14在糖尿病性心肌病大鼠心肌組織中下調(diào)，其上調(diào)通過介導(dǎo)m6A修飾活性以NLRP3依賴性方式抑制心肌細(xì)胞焦亡［6］。然而，METTL14介導(dǎo)的m6A修飾是否調(diào)節(jié)MI及其潛在機(jī)制仍然未知。在這項研究中，我們探索了METTL14介導(dǎo)的m6A修飾在MI中的生物學(xué)作用，并揭示了METTL14可以作為一種新的預(yù)測生物標(biāo)志物和治療靶點來阻斷MI的進(jìn)展。

1 材料與方法

1.1 動物和分組處理4周大的雄性C57BL/6小鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。所有小鼠都喂食標(biāo)準(zhǔn)食物和水。實驗小鼠維持在標(biāo)準(zhǔn)條件下［在（22 ± 2）℃ 恒溫和60%濕度的房間內(nèi)］，以12 h的晝夜循環(huán)為小鼠提供自由采食的食物和水。適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，通過永久結(jié)扎左冠狀動脈前降支（left anterior descending，LAD）構(gòu)建MI小鼠模型［7］。假手術(shù)組進(jìn)行相同的手術(shù)，但沒有結(jié)扎LAD。將小鼠用于以下實驗：實驗1考察MI對小鼠心臟組織m6A修飾水平影響。將小鼠隨機(jī)分為4組，每組10只：假手術(shù)組（Sham）、MI誘導(dǎo)后1 d組、4 d組和7 d組。實驗2考察METTL14過表達(dá)對MI小鼠的改善作用。將小鼠隨機(jī)分為4組，每組10只：Sham+AAV9-NC組、Sham+AAV9-METTL14組、MI+AAV9-NC組和MI+AAV9-METTL14組。各組小鼠分別在MI誘導(dǎo)前1周將AAV9-METTL14或AAV9-NC通過尾靜脈注射到小鼠體內(nèi)。MI誘導(dǎo)后4 d，收集心臟組織用于后續(xù)分析。動物實驗經(jīng)長沙市第四醫(yī)院（湖南師范大學(xué)附屬長沙醫(yī)院）動物倫理委員會批準(zhǔn)（批件號：XD-2020-12）。

1.2 AAV9介導(dǎo)的METTL14過表達(dá)AAV9基因組顆粒獲自本元正陽基因技術(shù)有限公司。將METTL14克隆到AAV9載體（AAV9-METTL14）中，然后通過尾靜脈注射到小鼠體內(nèi)，滴度為每g體重0.5 × 1011個載體基因組（vg/g）。以相同的劑量和時間點注射對照AAV9載體（AAV9-NC）。

1.3 超聲心動圖使用帶有MS400換能器的Vevo 2100回波在麻醉小鼠（3.0%異氟醚和1.0 L/min的O2流量）中進(jìn)行二維超聲心動圖。計算了射血分?jǐn)?shù)（%EF） 和縮短百分比（%FS）。

1.4 斑點印跡使用Trizol試劑（美國Invitrogen公司）從心臟樣本和細(xì)胞中提取RNA。NanoDrop（美國Thermo Fisher Scientific公司）用于分析RNA質(zhì)量。將RNA樣品點樣在尼龍膜上。然后將膜放入紫外交聯(lián)劑中交聯(lián)5 min。將膜置于5%脫脂牛奶中密封2 h，加入m6A一抗4 ℃孵育過夜。第2天，應(yīng)用二抗孵育2 h。另一張膜用亞甲藍(lán)染色作為對照。

1.5 心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞（cardiac microvascular endothelial cells，CMECs）分離和分組處理根據(jù)先前的研究［8］，使用CD31偶聯(lián)微珠從小鼠心肌組織中分離CMECs，并在內(nèi)皮培養(yǎng)基（ECM，美國ScienCel公司）中培養(yǎng)。為了在體外刺激缺氧缺血微環(huán)境，對細(xì)胞進(jìn)行去氧葡萄糖（oxygen-glucose deprivation，OGD）處理。CMECs在動態(tài)O2和CO2分室控制器Oxycycler C42（美國Biospherix公司）中于37 ℃下培養(yǎng)24 h，氣體混合物由5% CO2和95% N2組成。將細(xì)胞分為以下兩個實驗：實驗1考察考察OGD處理對CMECs中m6A修飾水平影響，將細(xì)胞分為NC組和OGD組，NC組在正常環(huán)境下培養(yǎng)，OGD組則進(jìn)行OGD處理。實驗2考察METTL14是否通過USP48對OGD誘導(dǎo)的CMECs細(xì)胞起保護(hù)作用，將細(xì)胞分為NC組、OGD組、OGD + SgNC組、OGD + METTL14KO組和OGD +METTL14KO + USP48組。除NC組外，其余組建立OGD模型。OGD + SgNC組、OGD + METTL14KO組和OGD + METTL14KO + USP48組在建立OGD模型前48 h分別用SgNC、METTL14KO或USP48過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

1.6 CRISPR/Cas9技術(shù)敲除CMECs中的METTL14我們設(shè)計了靶向METTL14的單向?qū)NA（METTL14KO） （http：//crispr.mit.edu）：mMETTL14-sgRNA：CGCTTCGCGAGAGATTGCA。sgRNA至少選擇10～15個單克隆進(jìn)行敲除檢測。接下來，設(shè)計引物以擴(kuò)增敲除的目標(biāo)片段并送去測序。使用Lenti-V2-GFP病毒載體構(gòu)建敲除病毒。

1.7 免疫熒光將心臟組織在/Tween-20封閉溶液中孵育1 h。然后將樣品與一抗在4 ℃下孵育過夜，并在室溫下與適當(dāng)?shù)臒晒舛狗跤? h。細(xì)胞核用DAPI染色。用LSM700激光掃描共聚焦顯微鏡（德國Carl Zeiss公司）捕獲圖像。免疫印跡的一抗如下：α-SMA （1∶500，英國Abcam公司）、CD31（1∶500，英國Abcam公司）和VE-Cadherin（1∶500，英國Abcam公司）。

1.8 ROS染色檢測在等密度的6孔培養(yǎng)皿上鋪板的CMECs中測量線粒體ROS水平［9］。細(xì)胞在37 ℃下用線粒體ROS指示劑MitoSOX? Red（2 μmol/L，美國Invitrogen公司）染色15 min。使用LSM700激光掃描共聚焦顯微鏡獲得細(xì)胞圖像。

1.9 RNA-seq和數(shù)據(jù)分析在OGD處理24 h后，收集METTL14敲低細(xì)胞及其對照用于RNA-seq。通過Oligo dT富集總RNA樣品，然后使用KAPA Stranded RNA-Seq Library Prep Kit（美國Illumina公司）構(gòu)建文庫。采用Illumina NovaSeq 6000儀器進(jìn)行測序。根據(jù)Arraystar的標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行小鼠m6AmRNA表觀轉(zhuǎn)錄組微陣列樣品制備和微陣列雜交。

1.10 蛋白質(zhì)印跡將從組織和細(xì)胞中收集的蛋白通過10%～15% SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。將膜與一抗在4 ℃下孵育過夜。次日，將膜與二抗一起孵育1 h，使用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光試劑（美國Millipore Sigma公司）觀察免疫反應(yīng)條帶。研究使用的一抗和二抗購自英國Abcam公司。以β-actin作為內(nèi)源性參考，使用Image J軟件對蛋白質(zhì)進(jìn)行量化。

1.11 統(tǒng)計學(xué)方法所有結(jié)果均以平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。應(yīng)用單向方差分析進(jìn)行多重比較，組間兩兩比較使用Student-Newman-Keuls事后檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MI和OGD誘導(dǎo)m6A修飾異常心臟組織RNA m6A修飾水平在MI誘導(dǎo)后4 d和7 d高于Sham組（圖1A）。MI誘導(dǎo)后1、4、7 d，METTL14表達(dá)降低，METTL3表達(dá)升高；其他酶（KIAA1429、WTAP、ALKBH5和FTO）沒有明顯變化（圖1B），此外，在OGD誘導(dǎo)的CMECs細(xì)胞中檢測到RNA m6A修飾水平高于NC組，并且METTL14表達(dá)降低（圖1C、D）。

圖1 MI和OGD誘導(dǎo)m6A修飾異常Fig.1 Abnormal m6A modification induced by MI and OGD

2.2 METTL14上調(diào)改善MI小鼠的微血管損傷和心臟功能小鼠在接受心肌MI損傷或假手術(shù)前，通過尾靜脈注射AAV9-METTL14上調(diào)心臟組織中METTL14（圖2A）。與Sham+AAV9-NC組相比，MI +AAV9-NC組小鼠心臟組織中血管內(nèi)皮連接蛋白VE-cadherin表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05）。MI+AAV9-METTL14組小鼠心臟組織中VE-cadherin表達(dá)較MI +AAV9-NC組顯著上調(diào)（P＜0.05）（圖2B）。MI+AAV9-METTL14組的射血分?jǐn)?shù)顯著高于MI+AAV9-NC組（P＜0.05），和左心室尺寸低于MI +AAV9-NC組（P＜0.05）（表1）。

表1 MI后各組小鼠超聲心動圖參數(shù)和心臟/體重的差異Tab.1 Differences of Echocardiographic Parameters and Heart/Weight of Mice in Different Groups after MI ±s

表1 MI后各組小鼠超聲心動圖參數(shù)和心臟/體重的差異Tab.1 Differences of Echocardiographic Parameters and Heart/Weight of Mice in Different Groups after MI ±s

注：BW，體重；HW，心臟重量；LVDd，左心室舒張期尺寸；LVDs，左心室收縮尺寸；IVS，室間隔厚度；PW，后壁厚度；PW，后壁厚度；FS，左心室縮短率；HR，心率；與Sham+AAV9-NC組比較，*P＜0.05；與MI +AAV9-NC組比較，#P＜0.05

P值0.632＜0.001＜0.001 0.315＜0.001＜0.001＜0.001 0.426＜0.001＜0.001參數(shù)BW（g）HW（mg）HW/BW（mg/g）HR（次/min）LVDd（mm）LVDs（mm）IVS（mm）PW（mm）FS（%）EF（%）Sham+AAV9-NC組26.0 ± 1.0 156.4 ± 7.8 6.04 ± 0.33 451.7 ± 12.5 3.25 ± 0.14 2.24 ± 0.09 0.82 ± 0.03 0.77 ± 0.05 32.7 ± 1.5 61.3 ± 2.7 Sham+AAV9-METTL14組26.1 ± 0.8 154.2 ± 8.3 5.94 ± 0.58 462.2 ± 14.1 3.31 ± 0.12 2.20 ± 0.11 0.81 ± 0.02 0.76 ± 0.04 33.1 ± 1.2 62.1 ± 2.4 MI +AAV9-NC組25.9 ± 0.7 237.6 ± 1.2*9.27 ± 0.75*477.4 ± 18.1 3.96 ± 0.16*3.15 ± 0.18*0.70 ± 0.03*0.79 ± 0.03 21.3 ± 2.3*44.6 ± 4.8*MI+AAV9-METTL14組25.9 ± 0.9 186.4 ± 9.6#7.15 ± 0.66#465.3 ± 17.4 3.57 ± 0.13#2.56 ± 0.13#0.78 ± 0.04#0.78 ± 0.02 29.4 ± 2.1#58.2 ± 4.5#F值0.89 28.50 8.24 1.75 7.55 20.22 10.77 1.20 17.94 14.65

圖2 METTL14上調(diào)改善MI小鼠的微血管損傷Fig.2 Up-regulation of METTL14 improves microvascular injury in MI mice

2.3 METTL14上調(diào)減輕MI誘導(dǎo)的內(nèi)皮線粒體功能障礙與Sham+AAV9-NC組小鼠相比，在MI+AAV9-NC組小鼠中觀察到線粒體長度顯著縮短（P＜0.05），片段化線粒體的形成顯著增加（P＜0.05），同時伴隨線粒體ROS水平顯著增加（P＜0.05）。AAV9-METTL14抑制了MI誘導(dǎo)的內(nèi)皮線粒體功能障礙（圖3）。

圖3 METTL14上調(diào)減輕MI誘導(dǎo)的內(nèi)皮線粒體功能障礙Fig.3 Up-regulation of METTL14 alleviates MI-induced endothelial mitochondrial dysfunction

2.4 METTL14介導(dǎo)USP48 mRNA的m6A修飾METTL14敲低顯著影響CMECs細(xì)胞基因的表達(dá)（圖4A）。6個轉(zhuǎn)錄本在RNA-seq和表觀轉(zhuǎn)錄組微陣列數(shù)據(jù)中重疊。將這6個轉(zhuǎn)錄本與MI心臟組織的RNA-seq進(jìn)行了比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有USP48降低，m6A甲基化水平受METTL14顯著調(diào)節(jié)并影響其表達(dá)（圖4B）。與Sham+AAV9-NC組相比，MI+AAV9-NC組小鼠心臟組織中USP48表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05）。MI+AAV9-METTL14組小鼠心臟組織中USP48表達(dá)較MI +AAV9-NC組顯著上調(diào)（P＜0.05）（圖4C）。

圖4 METTL14介導(dǎo)的USP48 mRNA的m6A修飾Fig.4 m6A modification of USP48 mRNA mediated by METTL14

2.5 METTL14通過USP48對OGD誘導(dǎo)的CMECs細(xì)胞起保護(hù)作用與NC組相比，在OGD組CMECs細(xì)胞中觀察到線粒體ROS水平顯著增加（P＜0.05），同時伴隨著VE-cadherin表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）和α-SMA水平顯著增加（P＜0.05）。CMECs細(xì)胞中METTL14敲低加劇了這些變化（P＜0.05），當(dāng)加入USP48過表達(dá)質(zhì)粒則逆轉(zhuǎn)了這些變化（P＜0.05）（圖5）。

圖5 METTL14通過USP48對OGD誘導(dǎo)的CMECs細(xì)胞起保護(hù)作用Fig.5 METTL14 protects CMECs cells induced by OGD through USP48

3 討論

MI引起的微血管損傷的分子機(jī)制相對復(fù)雜，因此在心臟MI損傷期間保護(hù)心臟微循環(huán)的藥物很少。m6A修飾是真核mRNA和非編碼RNA中最豐富的修飾，在各種人類疾病中發(fā)揮著重要作用，包括癌癥進(jìn)展、糖尿病、神經(jīng)發(fā)育障礙和缺血性心臟病［10］。最新證據(jù)［11-13］表明m6A修飾與CVD的發(fā)生和進(jìn)展密切相關(guān)，包括心臟肥大、心力衰竭、缺血性心臟病等。然而，METTL14是否與心血管疾病有關(guān)，例如MI，在很大程度上是未知的。在這項研究中，我們證明MI中m6A水平顯著增加是由于甲基轉(zhuǎn)移酶METTL14的下調(diào)。METTL14上調(diào)改善MI小鼠的微血管損傷和心臟功能，與先前研究發(fā)現(xiàn)一致［14-15］。

幾項研究已經(jīng)描述了METTL14在內(nèi)皮損傷中的作用，但是這些報道的結(jié)論并不一致。研究［16］表明，人動脈平滑肌細(xì)胞模型中的METTL14沉默減少了鈣化并增強(qiáng)了血管修復(fù)功能。另一項研究［17］報道，METTL14的表達(dá)降低可以抑制內(nèi)皮炎癥和動脈粥樣硬化的發(fā)展，表明METTL14可能作為動脈粥樣硬化臨床治療的潛在靶點。然而，與m6A水平升高會導(dǎo)致許多心臟病的心臟損傷的證據(jù)相反，PANG等［18］研究發(fā)現(xiàn)，在I/R損傷期間，腺病毒介導(dǎo)的METTL14過表達(dá)顯著減少了梗死面積和內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，并改善了心臟功能。我們的結(jié)果與PANG等［18］發(fā)現(xiàn)一致，功能增益和功能喪失測定結(jié)果顯示，METTL14上調(diào)改善MI小鼠的微血管損傷和心臟功能，METTL14敲低則加劇了OGD誘導(dǎo)的CMECs細(xì)胞損傷。這些數(shù)據(jù)解釋了METTL14介導(dǎo)的m6A修飾對缺血性心臟的保護(hù)作用。

據(jù)報道，線粒體損傷有助于MI誘導(dǎo)的內(nèi)皮損傷［19］。心肌缺血迅速增強(qiáng)線粒體裂變因子誘導(dǎo)的線粒體裂變，導(dǎo)致mtDNA損傷和內(nèi)皮氧化應(yīng)激［19］。此外，心肌缺血通過誘導(dǎo)線粒體膜高滲透性、mPTP開放和細(xì)胞色素c滲漏來激活線粒體凋亡［20］。同樣地，本研究發(fā)現(xiàn)在MI處理的CMECs中線粒體形態(tài)學(xué)發(fā)生改變，氧化應(yīng)激被誘導(dǎo)，而AAV9-METTL14抑制了MI誘導(dǎo)的內(nèi)皮線粒體功能障礙。從機(jī)制上講，CMECs細(xì)胞中降低的METTL14會刺激USP48 mRNA的m6A修飾，導(dǎo)致USP48的穩(wěn)定性降低。先前研究［21］已證實，USP48在肝細(xì)胞癌中的異常表達(dá)與METTL14誘導(dǎo)的m6A修飾有關(guān)，該修飾影響了USP48 mRNA的穩(wěn)定性。此外，代謝是USP48消融改變的最顯著富集的途徑，即USP48的消耗增強(qiáng)了有氧糖酵解的代謝通量，同時增加了線粒體斷裂［22］。在進(jìn)一步研究中，我們發(fā)現(xiàn)USP48過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了OGD對METTL14敲低的CMECs細(xì)胞的損傷作用。這些結(jié)果表明，METTL14可能通過調(diào)節(jié)USP48的m6A修飾參與介導(dǎo)MI內(nèi)皮線粒體功能障礙。

總之，我們的研究結(jié)果首次揭示METTL14在MI中低表達(dá)，并通過增加CMECs細(xì)胞USP48的m6A修飾水平以降低其穩(wěn)定性，從而介導(dǎo)CMECs細(xì)胞線粒體功能障礙。我們的工作揭示了MI的新致病機(jī)制，并為探索有效的MI治療策略開辟了新途徑。然而，m6A穩(wěn)態(tài)是通過m6A甲基化酶復(fù)合物和去甲基化酶的協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)來實現(xiàn)，本研究并未闡明METTL3和METTL14的相互作用關(guān)系，及其對m6A修飾水平的影響，值得在未來的研究中做進(jìn)一步探討。