解曉敏，馬夢(mèng)君，韋華琴，武 陽(yáng)，晏 彪，湯 民，楊 旭，馬 萍*

1. 湖北科技學(xué)院 藥學(xué)院，湖北 咸寧 437100；2. 湖北省智慧康養(yǎng)產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，湖北 咸寧 437100；3. 咸寧市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，湖北 咸寧 437100；4. 湖北科技學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院/咸寧市健康環(huán)境工程技術(shù)研究中心，湖北 咸寧 437100

近年來(lái)，肥胖癥的發(fā)病率大幅度增加，然而更重要的是肥胖癥患者合并的多種其他疾病如糖尿病、高血壓、心血管疾病及心理健康等危險(xiǎn)程度已超過(guò)肥胖本身，且亞洲人患糖尿病和高血壓的絕對(duì)風(fēng)險(xiǎn)都高于其他人群[1,2]。當(dāng)患有慢性疾病如糖尿病和心血管疾病時(shí)，與僅僅患有肥胖癥相比，殘疾率和死亡率都會(huì)顯著提高。因此，肥胖癥及其相關(guān)的代謝性疾病已成為影響人類(lèi)生活質(zhì)量的主要因素。

氧化應(yīng)激是由體內(nèi)氧化與抗氧化作用之間不平衡引起的，最近越來(lái)越多的研究集中在中藥對(duì)抗氧化應(yīng)激的作用上[3]。據(jù)報(bào)道，決明子的各種提取物具有很強(qiáng)的抗氧化潛力。一種從決明子中分離出來(lái)的蒽醌衍生物Obtusin 具有顯著的抗氧化活性[4]。有研究報(bào)道，決明子在小鼠巨噬細(xì)胞中表現(xiàn)出抗炎和抗氧化作用[5]。有研究確定荷葉潛在的黃酮類(lèi)生物活性成分并通過(guò)細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)其抗氧化和抗炎作用，為荷葉的食用和藥用價(jià)值提供參考[6]。茯苓是一種重要的真菌，具有很高的藥用和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[7]。有報(bào)道，茯苓激活肝FXR，可激活PPARa，抑制SREBP-1c，減少脂質(zhì)沉積[8]。絞股藍(lán)，也被稱(chēng)為“絞股蘭”，是亞洲國(guó)家的傳統(tǒng)藥物和涼茶[9]。決明子、荷葉、茯苓和絞股藍(lán)都具有一定的調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝與降血脂的作用，并且決明子、荷葉及茯苓等都具有抗炎作用。

茶作為天然飲料，具有多種藥理與保健功效[10,11]。青磚茶的減肥效果已被證明[12]。青磚茶中茶多酚、茶多糖含量較多，是青磚茶發(fā)揮藥理功效的主要化學(xué)物質(zhì)組分。有許多研究證明，茶多酚和茶多糖具有抗氧化及抗炎作用[13]。有研究表明，貯存年限會(huì)影響黑茶的品質(zhì)，黑茶越陳越好[14]。本試驗(yàn)通過(guò)將十年青磚陳茶與一年新茶作對(duì)照，研究?jī)?chǔ)存年限對(duì)青磚茶品質(zhì)的影響。同時(shí)將青磚茶與決明子、荷葉、絞股藍(lán)和茯苓按3 ∶2 ∶2 ∶1 ∶2（質(zhì)量比）比例混勻制成青磚茶特色中藥減肥茶飲，探究青磚茶中藥特色茶飲緩解氧化應(yīng)激和炎癥效果，為中藥茶飲的開(kāi)發(fā)利用提供思路與參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與試劑

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

5 周齡SPF 級(jí)雄性C57BL/6J 小鼠48 只，批號(hào)SCXK（遼）20200001，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司，飼養(yǎng)于湖北科技學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物房。小鼠購(gòu)入后先適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，試驗(yàn)期間小鼠均在室溫（24 ± 2）℃、相對(duì)濕度（50 ± 5）%、光/暗周期12 h/12 h 的環(huán)境下喂養(yǎng)，并按試驗(yàn)動(dòng)物使用的3 R原則給予人道關(guān)懷。

1.1.2 藥品與試劑

2012 年青磚茶（執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)GB/T 9833.9—2002）、2022 年青磚茶（執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)GB/T 9833.9—2002）、茯苓（執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)《中國(guó)藥典》2020 年版第一部）、決明子（執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)《中國(guó)藥典》2020 年版）、荷葉（執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)《中國(guó)藥典》2020 年版）、絞股藍(lán)（執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)《中國(guó)藥典》2020 年版）及高脂飼料[許可證號(hào)SCXK（京）2008—0006，小黍有泰（北京）生物科技有限公司]。硫代巴比妥酸（批號(hào)20160226）、三氯乙酸（批號(hào)20180112）、氫氧化鈉（批號(hào)C14465746）等，均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；LDL 試劑盒（批號(hào)202203）、HDL試劑盒（批號(hào)202203）、TG 試劑盒（批號(hào)202203）、TC 試劑盒（批號(hào)202203）、8-OHdG 試劑盒（批號(hào)202203）、IL-6 試劑盒（批號(hào)202203）、IL-1β 試劑盒（批號(hào)202203），均購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；活性氧ROS檢測(cè)試劑盒（批號(hào)22192211），北京普利萊基因技術(shù)有限公司。

1.1.3 儀器設(shè)備

電子天平（奧豪斯，常州）；5424R 低溫冷凍離心機(jī)（Eppendorf，德國(guó)）；Power wave XS 酶標(biāo)儀、ELx800 熒光酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Tek儀器有限公司）；HH-42 三用電熱恒溫水箱（北京長(zhǎng)源實(shí)驗(yàn)儀器廠）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 小鼠分組及處理

適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，將48 只5 周齡C57BL/6J雄性小鼠隨機(jī)分為4 組：空白對(duì)照組（Control）、肥胖模型組（Obesity）、新茶減肥組（New Tea，NT）和陳茶減肥組（Old Tea，OT），每組12 只。前5 周單純?cè)炷＃o予空白對(duì)照組普通飼料喂養(yǎng)，其他組均給予高脂飼料喂養(yǎng)，期間每周測(cè)量身長(zhǎng)和體重。從第6 周開(kāi)始，NT 組給予灌胃2022 年青磚茶特色中藥茶飲（新茶），OT 組給予灌胃2012 年青磚茶特色中藥茶飲（十年陳茶）。Control 組和Obesity 組給予灌胃生理鹽水為對(duì)照，期間每天監(jiān)測(cè)小鼠體重，每周監(jiān)測(cè)小鼠體長(zhǎng)。第17 周結(jié)束給藥，肥胖模型組體重達(dá)正常對(duì)照組體重的120%，小鼠肥胖模型建立成功（圖1）。

圖1 實(shí)驗(yàn)流程圖Figure 1 Experimental flow chart

1.2.2 青磚茶特色中藥茶飲的配制

分別將2022 年青磚茶、2012 年青磚茶、決明子、荷葉、絞股藍(lán)和茯苓用研磨打粉機(jī)磨成粉末，按照青磚茶、決明子、荷葉、絞股藍(lán)、茯苓的質(zhì)量比3 ∶2 ∶2 ∶1 ∶2 混勻制作成青磚茶特色中藥茶飲配方粉末。根據(jù)人體每天能夠承受的適宜飲茶量，依據(jù)《動(dòng)物與人體的每千克體重劑量折算系數(shù)表》（表1）轉(zhuǎn)換成小鼠每天最大飲茶量。具體方法為已知A 種動(dòng)物每千克體重用藥量，預(yù)估算B 種動(dòng)物每千克體重用藥劑量時(shí)可先通過(guò)表1 找出折算系數(shù)（W），再按下式計(jì)算：B種動(dòng)物的劑量（mg/kg）=W×A 種動(dòng)物的劑量（mg/kg）。已知人體可承受的青磚茶飲用量為17 g/d，需折算為小鼠量。查A 種動(dòng)物為成人，B 種動(dòng)物為小鼠，交叉點(diǎn)為折算系數(shù)W= 9.01，故小鼠每日灌胃青磚茶量應(yīng)為2.56 mg/g。

表1 動(dòng)物與人體體重劑量折算系數(shù)（W）表Table 1 Conversion coefficients (W) of dose per kilogram of body weight for animals and humans

1.2.3 肥胖生化指標(biāo)測(cè)定

造模成功后，將小鼠放入代謝籠中，12 h后將收集的尿液1500 r/min 離心10 min，取上清液分裝放置于-80℃冰箱。留取尿液后用10%水合氯醛麻醉小鼠，剪去小鼠頸部下方皮膚，露出小鼠胸骨柄及肋間，于左側(cè)第二肋間與第三肋間且靠近胸骨柄處用1 mL 注射器緩慢抽取心臟血液0.8 ～ 1.0 mL，再緩慢放入1.5 mL 的EP 管中，室溫下靜置30 min 后，25℃、3 000 r/min 條件下離心15 min，取上清液于新的EP管中放入-80℃冰箱，備用。

小鼠心臟取血結(jié)束后，取完整的肝組織，用PBS（pH 7.5）洗凈，濾紙上吸干水分，稱(chēng)重，冰浴條件下根據(jù)肝組織凈重：PBS = 1 ∶9的體積比制成10%的肝組織勻漿。隨后在4℃、10 000 r/min 的條件下離心15 min，取上清液分裝放置于-80℃冰箱。使用ELISA 試劑盒檢測(cè)TG、TC、LDL 及HDL。操作步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.4 8-OH-dG 的測(cè)定

使用ELISA 試劑盒檢測(cè)8-OH-dG。操作步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.5 炎癥因子的測(cè)定

使用ELISA 試劑盒檢測(cè)IL-6 和IL-1β。操作步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.6 ROS 的測(cè)定

使用DCFH-DA（2,7-dichlorofluorescin diacetate）探針?lè)椒āＳ肞BS : 肝勻漿上清 =9 ∶1 的體積比稀釋肝勻漿上清，并將熒光染料DCFA-DA 按1 ∶1 000 000 稀釋。之后再1 ∶1 加入稀釋勻漿液和稀釋后的DCFA-DA 熒光染料于酶標(biāo)板中，輕微搖勻，室溫下避光靜置5 min，置于酶標(biāo)儀中檢測(cè)吸光度。

1.2.7 MDA 的測(cè)定

取50 μL 肝勻漿上清及200 μL 0.6%TBA 至1.5 mL的EP管中，沸水浴煮15 min，冷水中降溫，10 000 r/min、4℃條件下離心5 min，取上清液100 μL 至酶標(biāo)板上，用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀分別測(cè)量450 nm、532 nm 及600 nm 波長(zhǎng)下的吸光度。MDA濃度（mol·L-1）= 6.45（A532-A600）-0.56×A450。

1.2.8 HE 及油紅O 染色肝臟組織病理學(xué)觀測(cè)

將小鼠肝臟組織分離，切大小合適的塊狀組織，用4%多聚甲醛緩沖液固定48 h，制作病理切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）和油紅O 染色，光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠肝臟組織病理學(xué)變化情況。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)均以平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤差（SEM）表示。日期分析和圖表生成使用GraphPad Prism 9.0 軟件（Origin Lab，Berkeley，CA，USA）進(jìn)行。方差比較后進(jìn)行Tukey-Kramer 檢驗(yàn)。p＜ 0.05被認(rèn)為具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 小鼠體重及身長(zhǎng)

表2 和圖2 分別顯示各組小鼠最后一天體重及Lee’s 指數(shù)情況。與空白對(duì)照組相比，肥胖造模組的體重及Lee’s 指數(shù)明顯升高；與肥胖造模組相比，NT 組和OT 組的體重及Lee’s 指數(shù)均明顯下降。

表2 青磚茶特色中藥茶飲對(duì)肥胖小鼠體重的影響Table 2 Effect of Qing brick tea special Chinese herbal tea on the body weight of obese mice

圖2 不同處理組小鼠最后一天Lee’s 指數(shù)Figure 2 Lee’s index on the last day of mice in different treatment groups

2.2 小鼠血清中TC、TG 含量及勻漿中TC、TG、HDL、LDL 含量

圖3A 顯示各處理組小鼠血清中肥胖指標(biāo)TC、TG 含量的測(cè)定結(jié)果。與空白對(duì)照組相比，肥胖造模組TC 和TG 含量明顯升高；與肥胖造模組相比，NT 組和OT 組的TC 和TG 含量均明顯下降，且OT 組下降更為顯著；與NT 組比較，OT 組血清中TG 含量下降且有顯著性差異。

圖3 小鼠TC、TG、HDL、LDL 含量Figure 3 TC, TG, HDL, LDL content in mice

圖3B 顯示各處理組勻漿中肥胖指標(biāo)TC、TG、HDL 及LDL 含量的測(cè)定結(jié)果。與空白對(duì)照組相比，肥胖造模組TC、TG 及LDL 含量明顯升高；與肥胖造模組相比，NT 組和OT 組的TC、TG 及LDL 含量均明顯下降，且OT 組TC、TG 含量下降更為顯著；與NT 組比較，OT 組勻漿中TC 含量下降且有顯著性差異。

圖3C 為各處理組小鼠肥胖指標(biāo)TC、TG、HDL 及LDL 的氣泡圖，圓圈大小及顏色深淺代表指標(biāo)含量的多少。與空白對(duì)照組相比，肥胖造模組TC、TG 及LDL 的圓圈更大且顏色更深；與肥胖造模組相比，NT 組和OT 組TC、TG 及LDL 的圓圈更小且顏色更淺，且OT 組比NT 組更為顯著。

2.3 小鼠肝組織HE 染色及油紅O 染色

與空白對(duì)照組比較，Obesity 組、NT 及OT組小鼠肝細(xì)胞內(nèi)存在大量脂質(zhì)空泡、氣球樣變性（圖4A，HE 染色），且Obesity 組最為明顯，NT 組次之。

圖4 小鼠肝組織病理切片F(xiàn)igure 4 Histopathological section of mouse liver

與空白對(duì)照組比較，Obesity 組、NT 及OT組小鼠肝細(xì)胞內(nèi)脂滴增多（圖4B，油紅O 染色）。NT 和OT 治療后，油紅染色均顯示肝細(xì)胞內(nèi)脂滴顯著減少且OT 組更為明顯。

2.4 氧化應(yīng)激指標(biāo)

與空白對(duì)照組相比，肥胖造模組ROS 和MDA 含量升高，具有顯著性差異；與肥胖造模組相比，NT 組和OT 組ROS、MDA 及8-OH-dG含量均明顯下降，且OT 組ROS 和MDA 含量下降更為顯著（圖5）。

圖5 氧化應(yīng)激指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果Figure 5 Measurement results of oxidative stress indicators

2.5 炎癥因子變化

如圖6 所示。與空白對(duì)照組相比，肥胖造模組IL-6 及IL-1β 均升高，且具顯著性差異；與肥胖造模組相比，NT 組和OT 組IL-6 含量明顯下降，且OT 組ROS 和MDA 含量下降更為顯著。

圖6 炎癥因子測(cè)定結(jié)果Figure 6 Measurement results of inflammatory factors

3 討論

本研究所建立的肥胖癥模型是指體內(nèi)儲(chǔ)存的脂肪超過(guò)理想體重的20%以上[15]，是一種由遺傳因素、環(huán)境因素等多種原因相互作用引起的慢性代謝性疾病，其發(fā)生機(jī)制是因?yàn)槟芰繑z入超過(guò)能量消耗導(dǎo)致體內(nèi)脂肪過(guò)度蓄積和體重超常。有研究表明，晝夜節(jié)律改變和腸道微生物對(duì)肥胖及其復(fù)雜的相關(guān)性代謝性疾病有關(guān)[14]。在控制肥胖和肥胖相關(guān)的代謝疾病漸漸成為一種全球流行病的趨勢(shì)下，我們主要從飲食方面入手探討青磚茶特色中藥茶飲的減肥效果及機(jī)制。

小鼠日常標(biāo)準(zhǔn)食物的脂肪含量一般在17%左右[16]。為了建立肥胖模型，本試驗(yàn)使用的高脂食物脂肪含量達(dá)60%，幾乎是正常的三倍多。對(duì)野生型小鼠來(lái)說(shuō)，長(zhǎng)期食用高脂食物會(huì)使體重快速增加，導(dǎo)致脂肪肝。目前，肥胖癥的表觀檢測(cè)指標(biāo)主要是體重和體長(zhǎng)，處理組超過(guò)對(duì)照組20%視為肥胖，體長(zhǎng)以Lee’s 指數(shù)判斷。Lee’s[17]越大，則肥胖程度越高。本試驗(yàn)結(jié)果表明，Obesity 組的體重均超過(guò)了空白對(duì)照組平均體重的20%，即造模成功。與Obesity 組相比，NT 組和OT 組的體重及Lee’s 指數(shù)明顯下降，即均具有一定的減肥效果。

進(jìn)一步的試驗(yàn)結(jié)果表明，HE 染色后肝組織的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)分別被染色為藍(lán)色和紅色。與空白對(duì)照組相比，Obesity 模型組的肝臟出現(xiàn)脂肪變性、肝細(xì)胞腫大和細(xì)胞質(zhì)中大量脂肪滴空泡。顯然，NT 和OT 干預(yù)小鼠的肝臟腫大在一定程度上減輕了，細(xì)胞質(zhì)中的脂肪滴液泡減少了。與空白對(duì)照組比較，油紅O 染色后Obesity 組小鼠肝細(xì)胞內(nèi)脂滴增多，同時(shí)NT 組和OT 組相對(duì)不明顯，表明NT 和OT 顯著減輕了高脂飼料誘導(dǎo)的肝組織形態(tài)學(xué)變化且OT 組更明顯。以上病理切片表明，NT 和OT 組的中藥配方可減輕肥胖癥，且十年陳茶的效果更好。

有文獻(xiàn)報(bào)道，在基線時(shí)肥胖與甘油三酯、總膽固醇和高密度脂蛋白膽固醇呈正相關(guān)，與低密度脂蛋白呈負(fù)相關(guān)[18]。研究表明，多項(xiàng)肥胖指標(biāo)顯示出正相關(guān)的HDL-C 濃度，有文獻(xiàn)則表明當(dāng)脂肪攝入量增加時(shí)HDL-C 濃度會(huì)相應(yīng)下降，從而增加患者患上心臟病的危險(xiǎn)性[19]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，Obesity 組小鼠甘油三酯、總膽固醇及低密度脂蛋白顯著升高，NT 和OT 組相對(duì)Obesity 組發(fā)生明顯的下降。

從中醫(yī)的角度來(lái)看，中醫(yī)身體成分在人體成分分類(lèi)中起著核心作用[20]。根據(jù)中醫(yī)理論，肥胖屬于“濁證”范疇，主要是脾臟“升降失調(diào)”所致[21]。磚茶中的茶多酚促進(jìn)脂肪分解和減肥的生物活性受到了較廣泛的關(guān)注[22]。決明子、荷葉、茯苓和絞股藍(lán)等其具有的健脾、益氣、利濕作用，對(duì)于減肥有很大功效[23-26]。

在肥胖癥中，脂肪量與人類(lèi)和動(dòng)物的全身氧化應(yīng)激有關(guān)[27]。在哺乳動(dòng)物中，肥胖和肥胖相關(guān)并發(fā)癥會(huì)影響線粒體代謝，從而有利于ROS 的產(chǎn)生和氧化應(yīng)激的發(fā)展[28]。8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷（8-OH-dG）是一種氧化性DNA 損傷副產(chǎn)物，也是氧化應(yīng)激普遍存在的標(biāo)志物[29]。丙二醛（MDA）是脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程的終產(chǎn)物之一，也是最常見(jiàn)的氧化應(yīng)激生物標(biāo)志物之一[30]。肥胖會(huì)增加氧化應(yīng)激引起的脂質(zhì)過(guò)氧化水平[31]。本研究探討了小鼠灌胃青磚茶特色中藥茶飲降脂是否會(huì)伴隨著氧化應(yīng)激的緩解，結(jié)果表明僅進(jìn)行高脂飼料喂養(yǎng)的小鼠ROS、MDA 及8-OHdG 含量均明顯增強(qiáng)。與Obesity 組相比，NT 組和OT 組的ROS、MDA 及8-OH-dG 含量顯著降低，表明小鼠灌胃青磚茶特色中藥茶飲降脂過(guò)程中伴隨著氧化應(yīng)激的緩解。有研究表明，炎癥是肥胖中氧化應(yīng)激升高的一種表現(xiàn)[32]，同時(shí)，也是另一個(gè)重要來(lái)源[33]。本試驗(yàn)同時(shí)探討了小鼠灌胃青磚茶特色中藥茶飲在降脂過(guò)程中是否伴隨著炎癥因子的產(chǎn)生。試驗(yàn)結(jié)果表明，與空白對(duì)照組比，Obesity 組、NT 組和OT 組的IL-6 含量顯著升高，且NT 組和OT 組相對(duì)于Obesity 組含量有明顯下降趨勢(shì)。說(shuō)明小鼠灌胃青磚茶特色中藥茶飲可以抑制氧化應(yīng)激因子的產(chǎn)生，促進(jìn)炎癥因子的釋放，達(dá)到減肥的效果，且陳茶比新茶更加明顯。

綜上，青磚茶特色中藥配方可通過(guò)促進(jìn)炎癥因子的釋放，抑制氧化應(yīng)激因子的產(chǎn)生，達(dá)到減肥的效果，且陳茶比新茶更加明顯。