壽晨超, 娜仁高娃, 高素蕓, 劉 劍,3, 趙 豐,3

(1. 浙江理工大學 紡織科學與工程學院(國際絲綢學院), 浙江 杭州 310018; 2. 巴音郭楞蒙古自治州博物館,新疆 庫爾勒市 841001; 3. 中國絲綢博物館 紡織品文物保護國家文物局重點科研基地, 浙江 杭州 310012)

天然染料是從植物、動物等天然原料中提取的可用于紡織品著色的色素,其使用在我國具有十分悠久的歷史,《詩經》《齊民要術》《天工開物》等古代文獻中均有記載從植物中萃取染料,并對紡織品進行染色加工[1]。常見的天然染料種類主要有吲哚類、蒽醌類、萘醌類、黃酮類、生物堿類和姜黃素類等。

通過鑒定紡織品文物中的天然染料,可了解其化學屬性、植物來源、產地甚至紡織品文物年代等信息,為保護紡織品文物顏色、避免染料降解提供科學依據;此外,隨著現代人們對綠色發(fā)展的理念越來越重視,篩選出優(yōu)質天然染料應用于現代印染業(yè),符合可持續(xù)發(fā)展需求。目前,用于古代紡織品染料鑒定的技術包括高效液相色譜技術(HPLC)[2]、光纖反射光譜技術(FORS)[3]、三維熒光光譜技術 (3D-EEM)[4]、高效液相色譜-質譜聯用技術(HPLC-MS)[5]、表面增強拉曼光譜技術(SERS)[6]等。其中高效液相色譜-質譜聯用技術(HPLC-MS)是最常用的檢測技術,其具有強大的化合物分離和分子結構分析能力,是鑒別紡織品上天然染料的重要方法之一。然而,面對大量的紡織品文物,在使用光譜或者色譜等分析技術時,僅依靠人工已無法快速鑒別染料化合物[7]。近年來,質譜庫檢索技術逐漸成為研究者們關注的熱點,可做為一種快速有效的鑒定方法。質譜檢索軟件在對未知化合物進行分析時,可將其質譜與數據庫中標準物質的質譜相比對,用質譜的匹配度來衡量相似性,作為定性參考。國內外許多學者根據其實驗室自身條件和檢測分析目的,在農藥[8]、中醫(yī)藥[9]、海洋寡糖[10]、人體代謝產物[11-12]等領域已建立了不同規(guī)模的質譜數據庫,實現了實際樣品中未知質譜的快速鑒別。在天然染料研究領域,Guo等[13]利用UPLC-MS/MS技術初步建立了用于篩選和鑒定紅色天然染料化合物的質譜數據庫,對紅色紡織品文物進行了染料鑒定,然而其建立的質譜數據庫在天然染料品種和數量上有待進一步補充。

目前,可供天然產物質譜檢索匹配的數據庫有美國國家標準技術研究院質譜數據庫 (NIST)、代謝物質譜數據庫 (Metlin)、有機化合物質譜數據庫 (SDBS)、 全球天然產物社區(qū)質譜數據庫 (GNPS)等[14]。其中NIST數據庫的檢索軟件具有檢索結果準確率高和檢索速度快的優(yōu)點[15]。本文通過對68種染料標準品進行HPLC-MS分析,利用該譜庫軟件建立天然染料的多級參考質譜數據庫,成功匹配了2件古代紡織品文物上的染料成分,并鑒別了染料的植物來源。

1 實驗部分

1.1 實驗材料

HPLC級乙腈和甲醇(德國Merck公司);LC-MS級甲酸(美國Thermo Fisher公司);HPLC級吡啶(上海安譜實驗科技股份有限公司);98%草酸(美國Acros有機試劑公司)。18.2 MΩ超純水(由法國Millipore公司Millipore reference 純水儀系統制備)。68種染料標準品,主要購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司、上海源葉生物科技有限公司、美國Sigma-Aldrich公司等,純度均在90%以上,其成分如表1所示。

表1 主要天然染料化合物標準品列表

1.2 實驗儀器及條件

采用 HPLC-MS技術分析古代絲織品上的染料。其中LC20AD液相色譜系統(日本Shimadzu公司)由二元高壓梯度泵、二極管陣列檢測器和自動進樣器組成。質譜檢測器為LTQ-XL線性離子阱質譜儀(美國Thermo Fisher公司),采用Shim-pack XR-ODS C18反相色譜柱(日本Shimadzu公司)進行染料色素分離。

通過前期研究及相關文獻確定對天然染料的檢測分析條件[5,15],高效液相色譜洗脫液A和 B分別為0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸乙腈溶液,流速為0.30 mL/min。質譜數據采集和處理由Xcalibur 2.1軟件完成,質荷比m/z范圍為100～1 000。質譜參數如下:離子噴霧電壓分別為3 kV(正離子模式)和2.5 kV(負離子模式);毛細管溫度為350 ℃;氮氣用作鞘氣和輔氣,壓力分別為241.32、 103.42 kPa;毛細管電壓分別為35 V(正離子模式)和-40 V(負離子模式)。

數據采集和處理軟件:1) Xcalibur 2.1軟件(由美國Thermo Fisher Scientific開發(fā)的質譜分析軟件),用于管理、處理和分析質譜數據。2)NIST MS Search 2.3軟件(由美國國家標準技術研究院開發(fā)的質譜數據庫搜索軟件),用于快速準確地識別和鑒定未知化合物[14]。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準品溶液配制

將染料標準品超聲波溶解于甲醇/水混合溶劑中,配制成質量濃度為20～400 mg/L的標準儲備溶液。分析時,取適量5～10種同類別標準儲備液混合,用氮氣干燥后,以甲醇與水質量比為1∶1溶解至10 mg/L,移取溶液30 μL至微量進樣瓶,進樣15 μL。

1.3.2 文物樣品制備

本文分析的2件古代絲織品分別來自于巴州博物館收藏的漢晉時期紅藍黃三色香囊(BZ:39)和中國絲綢博物館收藏的17世紀法國彩條花卉紋提花緞(2016-18-3)。取樣品紗線0.2～0.6 mg,采用吡啶、水與草酸質量比為95∶95∶10萃取紗線上的染料,于85 ℃恒溫萃取30 min,用氮氣干燥后重復1.3.1節(jié)相應實驗步驟。

1.4 古代紡織品中未知染料質譜識別方法

1.4.1 NIST檢索算法

古代紡織品中未知染料質譜的鑒定是使用NIST MS Search 2.3軟件進行譜庫檢索實現的。該軟件的檢索算法是基于點積函數,將質譜表示為1個有序的峰強度行向量,通過m/z值縮放峰強度值(每個峰值的豐度的平方根乘以m/z值的平方)。點積質譜搜索算法使用余弦相似度法,計算未知質譜向量和庫參考質譜向量之間的角度余弦值來確定相似度[16]。

NIST檢索結果中有正向檢索匹配度(Match)、 反向檢索匹配度(R.Match)和匹配概率(Prob)3個值。正向檢索匹配度為將參考庫的峰與未知譜對照,計算是否存在與未知譜相同的峰。反向檢索匹配度為將未知譜的峰與參考庫對照,計算參考譜中的各質量峰是否出現在未知譜中。在NIST檢索結果中最大匹配度為999,無質譜峰匹配時為0。900及以上為優(yōu)秀匹配;800～900為良好匹配;700～800為中等匹配;低于600為較差匹配。其中Prob的值是假設此化合物存在數據庫中,根據命中列表中鄰近命中的差別得出[16]。

1.4.2 檢索參數設置

根據其它文獻的實驗方法,通過調節(jié)質譜搜索類型、準分子離子和子離子質量容差等搜索參數,確定最佳的譜庫檢索參數[11]。本文采用Simple和 MS/MS 混合搜索方法,準分子離子和子離子質量搜索參數分別設置1.6、0.8m/z的容差,忽略準分子離子附近峰設置為1.6m/z,選擇主譜庫(Mainlib)和自建譜庫(NaturalDye)作為檢索譜庫。

2 結果與分析

在HPLC-MS分析紡織品中染料組分時,采用多級質譜,可以獲得化合物豐富的碎片離子信息,從而能夠推測染料的分子結構。天然染料質譜數據庫的建立,為紡織品文物的染料鑒別提供了一種快速準確的方法。

2.1 天然染料質譜庫的建立

利用線性離子阱質譜儀采集天然染料的標準品多級質譜數據,基于Xcalibur 2.1軟件和NIST MS Search 2.3軟件建立包含68種天然染料化合物的質譜數據庫,相關信息見表2。

表2 天然染料質譜數據庫的相關數據

圖1示出標準品的質譜數據采集過程。首先在Xcalibur 2.1軟件中選中1個色譜峰,導出染料化合物的二級質譜至NIST MS Search 2.3軟件,當化合物的二級質譜碎片信息較少時需要導出其三級質譜。隨后將化合物的其它信息,如名稱、分子式、分子質量、別名、檢測離子模式、保留時間、化學結構式輸入到自建譜庫中,質譜數據庫存儲結構如圖2所示。

圖1 標準品的質譜數據采集過程

圖2 質譜數據庫存儲結構

以茜素為例,在圖1導出第3個色譜峰的二級質譜信息,其相關的參數為:CAS登記號72-48-0,英文名Alizarin,分子式C14H8O4,相對分子質量240,檢測離子模式為負離子模式,保留時間為13.30 min,一級質譜的準分子離子為239,二級質譜中相對強度最大的前10個子離子為m/z211(999)、m/z239(374)、m/z167(288)、m/z210(244)、m/z212(140)、m/z195(103)、m/z219(89)、m/z199(56)、m/z240(35)、m/z168(29)。

2.2 天然染料化合物的碎裂機制

為鑒定染料分子的結構,需獲取MS/MS 碎裂的機制。天然染料中常見的色素多屬于蒽醌類、黃酮類和生物堿類化合物,本文主要分析這3種代表性化合物的碎裂機制。

蒽醌類染料化合物是典型的紅色染料來源,質譜庫中記錄的幾種蒽醌類化合物具有相似的結構和碎裂方式。以茜素(Alizarin)為例[13](如圖3、4所示),主要有茜素準分子離子[M-H]-(m/z239)及中性丟失形成的[M-H-CO]-(m/z211)、[M-H-CO2]-(m/z195)和[M-H-CO2-CO]-(m/z167)碎片離子。

圖3 茜素裂解規(guī)律

圖4 茜素的二級質譜圖

黃酮類化合物是指2個具有酚羥基的芳環(huán)(A和B)通過三碳鏈連結而成的一系列C6—C3—C6化合物,是天然染料中品種最豐富的化合物種類。在多級質譜負離子模式下,易形成黃酮苷和苷元的準分子離子峰,在二級質譜中苷元會進一步裂解,產生一系列的特征性碎片離子,來源于中性丟失和環(huán)的逆狄爾斯-阿爾德裂解反應[17]。

以槲皮素為例[18],圖5、6分別示出槲皮素裂解規(guī)律和二級質譜圖?？梢钥闯?在槲皮素準分子離子[M-H]-(m/z301)中存在[M-H-CO]-(m/z273)、[M-H-CO2]-(m/z257)以及 [M-H-CO2-CO]-(m/z229)碎片。槲皮素[M-H]-體系的 C 環(huán)容易發(fā)生開裂,丟失 CO形成碎片m/z257;還可在 C環(huán)跨環(huán)開裂產生m/z179、151、107 離子。

圖5 槲皮素裂解規(guī)律

圖6 槲皮素的二級質譜圖

以木犀草素為例[19-20],圖7、8分別示出木犀草素裂解規(guī)律和二級質譜圖?？梢钥闯?準分子離子峰[M-H]-(m/z285) 產生豐富的碎片離子,其裂解規(guī)律為m/z285 中性丟失形成[M-H-H2O]-(m/z267)、[M-H-CO]-(m/z257)、[M-H-C2H2O]-(m/z243)、[M-H- CO2]-(m/z241)和[M-H-C3O2]-(m/z217)碎片離子,以及[M-H-CO]-(m/z257)繼續(xù)脫去C5H6O得到m/z175,[M-H-C2H2O]-(m/z243)繼續(xù)脫去CO2得到m/z199。此外,[M-H]-準分子離子較易發(fā)生逆狄爾斯-阿德爾反應(RDA)裂解生成2個碎片離子m/z151和m/z133。

圖7 木犀草素裂解規(guī)律

圖8 木犀草素的二級質譜圖

在常見的天然染料中,小檗堿、巴馬汀和藥根堿這3種原小檗堿類化合物是生物堿類染色植物的主要成分,且它們的裂解規(guī)律也十分相似。以小檗堿為例[21-22],圖9示出其裂解規(guī)律和二級質譜圖。可以看出,小檗堿[M+H]+(m/z336)準分子離子中性丟失形成[M+H-CH3]+·(m/z321)碎片離子,進一步脫去CH3·形成m/z308碎片,或脫去H·形成[M+H-CH3-H]+·(m/z320)碎片,接著再脫去1個CO形成m/z292碎片。

圖9 小檗堿裂解規(guī)律及二級質譜圖

2.3 天然染料質譜數據庫的應用

本文采用HPLC-MS對2件紡織品文物進行染料檢測,利用上述建立的天然染料質譜數據庫進行質譜比對,鑒定染料化合物。

圖10(a)示出巴州紅黃藍三色香囊的紅色絲線樣品碎片。在染料鑒定中,首先將圖10(b)色譜峰1(保留時間為13.38 min)對應的二級質譜導出至NIST MS Search 2.3軟件,如圖10(c)所示點擊“Library Search”按鈕進行質譜庫檢索,檢索結果顯示色譜峰1的質譜與數據庫中茜素質譜的匹配度最高,正向檢索匹配度(Match)為884,反向檢索匹配度(R. Match)為892,匹配概率(Prob)為98.1%。色譜峰2(保留時間為14.44 min)的質譜與茜紫素質譜的匹配度同樣優(yōu)秀,3個匹配項數據Match值為906,R.Match值為911,Prob值為98.6%。結合未知化合物和標準品的保留時間比對,證實了茜素和茜紫素的存在,說明紅色織物碎片由西茜草(rubia tinctorum)染色。

注:圖(c)、(d)中橫坐標為質荷比,縱坐標為相對豐度。

圖11示出巴州紅黃藍三色香囊中黃色絲線碎片文物樣品鑒定結果。在對香囊淡黃色織物碎片的染料鑒定中,質譜庫檢索結果顯示色譜峰1(保留時間為8.47 min)和色譜峰2(保留時間為9.21 min)對應的質譜分別與數據庫中藥根堿和小檗堿的質譜相匹配。檢索結果顯示3個匹配項數據Match值為917、R.Match值為917、Prob值為98.8%和 Match值為843、R.Match值為844、Prob值為99.0%。結合未知化合物和標準品的保留時間對比,確認織物碎片中含有這2種物質,均為小檗屬植物(berberis spp.)的主要色素成分。

注:圖(c)、(d)中橫坐標為質荷比,縱坐標為相對豐度。

圖12示出法國彩條花卉紋提花緞中黃色絲線文物樣品鑒定結果。在對黃色絲線的染料鑒定中,通過質譜庫檢索,色譜峰1(保留時間為10.51 min)

注:圖(c)、(d)中橫坐標為質荷比,縱坐標為相對豐度。

對應的質譜與數據庫中木犀草素的質譜相匹配,3個匹配項數據Match值為829,R.Match值為840, Prob值為98.7%。色譜峰2(保留時間為11.56 min)對應的質譜與芹菜素的質譜相匹配,3個匹配項數據Match值為802,R.Match值為804,Prob值為98.2%。推測黃色絲線由木犀草(reseda luteola)染色。

3 結 論

采用高效液相色譜-質譜聯用技術分析了68種天然染料化合物,建立了常見天然染料的質譜數據庫,應用該數據庫鑒定了2件古代紡織品中的天然染料化合物。巴州紅黃藍三色香囊中的紅色碎片含有茜素和茜紫素,經分析為西茜草染色;黃色碎片含有小檗堿和藥根堿,經分析為小檗屬植物染色。法國彩條花卉紋提花緞黃色紗線中含有木犀草素和芹菜素,經分析為木犀草染色。

本文建立的天然染料質譜庫可在正負離子檢測模式下工作,且在實際文物樣品的檢索結果中正反向檢索匹配度均達到800以上,匹配率達95%以上,實現了紡織品文物染料的快速準確鑒別,減少了對標準品的依賴,降低了實驗室的運行成本,證明了質譜庫檢索技術應用于天然染料鑒定的可行性和潛力。但是,目前建立的天然染料質譜數據庫中染料品種有待擴充,且不能良好匹配不同品牌儀器產生的質譜數據,下一步可結合機器學習繼續(xù)開發(fā)檢索算法,提高譜庫的兼容性和可用性。