李欣淼，張子敬，張格陽(yáng)，張志浩，閔 佳，王香南，朱進(jìn)華，施巧婷，祁興山，祁興磊，張志鵬，徐美芳，高留濤，李若璽，黃永震，王二耀*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西西安 712100；2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，河南鄭州 450002；3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河南鄭州 450002；4.河南省動(dòng)物檢疫總站，河南鄭州 450008；5.泌陽(yáng)縣夏南牛科技開(kāi)發(fā)有限公司，河南泌陽(yáng) 463700）；6.河南省鼎元種牛育種有限公司，河南鄭州 451454）

結(jié)締組織最主要的細(xì)胞成分為成纖維細(xì)胞（Fibroblasts，F(xiàn)bs），對(duì)于分泌細(xì)胞外基質(zhì)成分、構(gòu)建細(xì)胞外基質(zhì)及組織創(chuàng)傷修復(fù)發(fā)揮了十分重要的作用，也被稱為纖維母細(xì)胞[1,2]。典型的Fbs 形狀為細(xì)長(zhǎng)狀或梭形，當(dāng)細(xì)胞貼壁后主要呈現(xiàn)為梭形，細(xì)胞之間松散排列，細(xì)胞形態(tài)隨培養(yǎng)基和培養(yǎng)密度的改變而有所改變[3]。作為最易培養(yǎng)的細(xì)胞之一，F(xiàn)bs 的增殖能力很強(qiáng)，生長(zhǎng)速度快[4]。動(dòng)物的Fbs 來(lái)源廣泛，包括皮膚、腺體和睪丸組織等[5-10]。近年來(lái)，隨著Fbs 體外分離培養(yǎng)技術(shù)的不斷完善，F(xiàn)bs 在人[11]、豬[12]、綿羊[13]、牛[14]和犬[15]等不同動(dòng)物上均在體外成功分離培養(yǎng)[16]。由于Fbs體積大、數(shù)量多，增殖分裂能力強(qiáng)，易獲取，在關(guān)于疾病研究的相關(guān)模型的建立、功能研究、胚胎等多個(gè)方面被廣泛應(yīng)用[1,2,10,17-20]。

目前，在資源保護(hù)、轉(zhuǎn)基因技術(shù)以及動(dòng)物模型等方面體細(xì)胞核移植（Somatic cell nuclear transfer，SCNT）技術(shù)被廣泛應(yīng)用，被認(rèn)為是良種快速擴(kuò)繁的最直接的手段之一[2]。通過(guò)體細(xì)胞核移植技術(shù)獲得的重組胚能完整地繼承親本性狀，相對(duì)于體外受精技術(shù)來(lái)說(shuō)，實(shí)驗(yàn)周期短，將體細(xì)胞的細(xì)胞核注入去核卵母細(xì)胞中獲得重構(gòu)胚，并通過(guò)胚胎移植技術(shù)將重構(gòu)胚胎移植到受體母畜的子宮，經(jīng)發(fā)育可獲得與供體動(dòng)物遺傳信息一致的克隆子代[21]。到目前為止，SCNT 的相關(guān)技術(shù)已較為成熟，在品種資源保護(hù)及醫(yī)學(xué)方面都獲得了很好的成果[2,22]。目前已有研究表明，移植能否成功的關(guān)鍵取決于供體細(xì)胞的質(zhì)量，供體細(xì)胞的最佳選擇之一為成年牛的耳緣Fbs[2,23]，因此，移植前期的工作重點(diǎn)是如何分離培養(yǎng)Fbs。在培養(yǎng)過(guò)程中，由于原代細(xì)胞不斷地進(jìn)行復(fù)制和分裂，細(xì)胞不可避免地會(huì)發(fā)生衰老，不能在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中實(shí)現(xiàn)無(wú)限培養(yǎng)和使用。因此，需要不斷地進(jìn)行技術(shù)比較和更新，從而快速獲得細(xì)胞，延長(zhǎng)細(xì)胞的使用壽命[24-26]。本試驗(yàn)通過(guò)組織貼壁法培養(yǎng)細(xì)胞以及組織貼壁+雙酶消化法（胰蛋白酶+膠原酶Ⅱ）分離細(xì)胞，比較兩種培養(yǎng)方法的目的是在短時(shí)間可以分離出成纖維細(xì)胞，且分離出的細(xì)胞存活率高，狀態(tài)良好，同時(shí)也為提高牛體細(xì)胞核移植效率提供前期試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)動(dòng)物選自鼎元種牛育種有限公司，取10頭生產(chǎn)性能好的成年種公牛的耳緣組織。

1.2 主要試劑

胎牛血清（FBS）、DMEM 培養(yǎng)基均購(gòu)自Gibco。0.25%胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶、DPBS、PBS、雙抗（青鏈霉素混合物，PS）均購(gòu)自索萊寶。

完全培養(yǎng)基為DMEM+15%FBS+2%PS，細(xì)胞消化液（DMEM+025%胰蛋白酶+2%雙抗；DMEM+025%胰蛋白酶+膠原酶Ⅱ），由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所養(yǎng)牛實(shí)驗(yàn)室配制。

1.3 主要儀器

二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo），熒光倒置顯微鏡（Nikon），離心機(jī)（湘儀），搖床（旻泉，MQL-61R）。

2 方法

2.1 耳緣組織獲取及處理細(xì)胞培養(yǎng)

固定好牛后用肥皂水打濕耳朵，清洗，用刮刀逆向?qū)⒍湔吹拿l(fā)刮去，越干凈越好。用75%的酒精棉球?qū)Χ窠?jīng)和血管較少的部位消毒3 遍。用缺耳鉗剪下大小約為1～2cm3的組織塊（每剪下一只需要用75%的酒精對(duì)耳缺鉗進(jìn)行消毒），碘伏止血。將取下的組織先在75%的酒精中清洗兩遍，再在含有1%PS 的DPBS 中清洗2遍。將清洗好的組織塊放在含1%PS 的DPBS 中低溫（4℃）帶回實(shí)驗(yàn)室。在含有1%PS 的DPBS中清洗組織塊，并將剩余毛發(fā)、表皮皮膚和脆骨去除。

2.2 牛耳成纖維細(xì)胞分離培養(yǎng)

2.2.1 組織塊貼壁培養(yǎng)法

在含有1%PS 的DPBS 中將處理好的組織剪成合適大?。?～2mm3）的碎塊。將血清均勻涂于培養(yǎng)皿底部（35mm，1mL），將處理好的組織轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿（60mm）中，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中干涸培養(yǎng)5～8h。干涸培養(yǎng)后小心緩慢的加入1mL 完全培養(yǎng)基。24h 后補(bǔ)加2mL 完全培養(yǎng)基，2～3d 更換一次完全培養(yǎng)基。

2.2.2 雙酶消化法

將處理好的組織塊剪碎（0.5～1mm3），將剪碎的組織轉(zhuǎn)移至15mL 離心管中，1000r/min 離心1min 后棄上清。加入DMEM、1%PS 以及0.25%胰蛋白酶，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，每5min 振搖一次，共20min。振搖后1000r/min 離心5min，棄上清。加入0.25%胰蛋白酶和膠原蛋白酶Ⅱ（3 ∶1），封口膜封口，在37℃搖床210r/min 進(jìn)行消化直至出現(xiàn)白色透明絮狀物（約1h 時(shí)會(huì)出現(xiàn)白色透明絮狀物）。將絮狀物吸至含有完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿（60mm）中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[2]，2～3d 更換完全培養(yǎng)基一次。

2.2.3 細(xì)胞傳代及純化

棄去培養(yǎng)皿中的舊培養(yǎng)基，加入1mL PBS 潤(rùn)洗，棄去PBS。加入2mL 溫好的0.25%胰蛋白酶，于37℃培養(yǎng)箱中消化2～3min，直至細(xì)胞由梭形變?yōu)閳A形。當(dāng)大部分細(xì)胞出現(xiàn)形態(tài)改變后，快速用移液槍吹打，直至細(xì)胞全部脫落，立即向培養(yǎng)皿中加入體積為胰酶2～3 倍的DMEM 進(jìn)行終止[2]。用15mL 離心管收集細(xì)胞懸液，1200r/min 離心3min，只留沉淀物。使用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)皿中，搖勻，放在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第2 天看細(xì)胞是否貼壁；每24h 或48h 進(jìn)行換液，待細(xì)胞匯合到90%左右進(jìn)行傳代。傳代2～3 次即可得到純化的Fbs[2]。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 組織貼壁法對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

由圖1 可知，使用組織貼壁法培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞從組織中遷移出來(lái)的速度較慢，培養(yǎng)至第6 天時(shí)，組織塊邊緣有圓形細(xì)胞游出，培養(yǎng)至第10或11 天時(shí)，可觀察到長(zhǎng)梭形細(xì)胞，F(xiàn)bs 形態(tài)明顯，培養(yǎng)至16d 時(shí)，細(xì)胞形態(tài)密集生長(zhǎng)，呈現(xiàn)渦旋狀。

圖1 不同培養(yǎng)時(shí)間組織塊貼壁法培養(yǎng)的原代牛耳成纖維細(xì)胞（100×）

3.2 組織貼壁+雙酶消化法對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

由圖2 可知，相較于組織貼壁法，組織貼壁+雙酶消化時(shí)細(xì)胞遷移速度較快，第4 天即可觀察到有圓形細(xì)胞從貼壁組織邊緣遷移出來(lái)，第5 天可在組織邊緣看到梭形并伸展的Fbs（極少量），第6 天可以看到大量細(xì)胞遷移貼壁生長(zhǎng)，培養(yǎng)至第10 天時(shí)可見(jiàn)渦旋狀生長(zhǎng)暈。

圖2 不同培養(yǎng)時(shí)間組織塊貼壁+雙酶消化法培養(yǎng)的原代牛耳成纖維細(xì)胞（100×）

3.3 成纖維細(xì)胞傳代及純化

由圖3 可知，傳代后，細(xì)胞的生長(zhǎng)力未受到影響，增殖能力和原代細(xì)胞相差不大。在胰蛋白酶作用后，細(xì)胞呈團(tuán)狀圓形細(xì)胞貼壁。將細(xì)胞進(jìn)行傳代，發(fā)現(xiàn)與原代細(xì)胞相比，傳代細(xì)胞形態(tài)上沒(méi)有明顯改變。當(dāng)細(xì)胞貼壁后可以觀察到細(xì)胞的胞質(zhì)飽滿。

4 討論

Fbs 生長(zhǎng)速度快，且取材方便、快捷、易培養(yǎng)，目前有許多生物技術(shù)的直接材料都來(lái)源于Fbs，并且采集后對(duì)動(dòng)物并不會(huì)產(chǎn)生較大影響[1,2,28]。通過(guò)Fbs 的培養(yǎng)，進(jìn)行體細(xì)胞核移植是保護(hù)稀有、瀕危、優(yōu)良品種和大型物種遺傳物質(zhì)的有效措施[27]。作為核移植（NT）相關(guān)實(shí)驗(yàn)的主要供體細(xì)胞，在良種保護(hù)和快速擴(kuò)繁上能直接影響最終的移植效果[2,29,30]。目前組織貼壁法和酶消化法為細(xì)胞原代體外分離培養(yǎng)的主要方法[2,31,32]。組織貼壁法操作簡(jiǎn)單、操作時(shí)所用時(shí)間短，但是在培養(yǎng)過(guò)程中組織容易貼壁不牢且細(xì)胞遷移速度慢耗時(shí)長(zhǎng)[33]；組織貼壁+雙酶培養(yǎng)法操作時(shí)間長(zhǎng)、成本較高，但在培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞遷移速度快且生長(zhǎng)速度較組織貼壁法快。膠原酶又稱膠原蛋白水解酶（Collagenase），它能在適宜pH 和溫度條件下特異性地水解天然膠原蛋白的三維螺旋結(jié)構(gòu)[34]，而不損傷其他蛋白質(zhì)和組織，對(duì)細(xì)胞的損傷較小，但長(zhǎng)時(shí)間消化后細(xì)胞也仍不能完全脫離盤(pán)底[6]。胰蛋白酶消化細(xì)胞的能力強(qiáng)，但對(duì)細(xì)胞的損傷較大[5]，兩種酶混合后，胰蛋白酶的濃度會(huì)有所降低，對(duì)細(xì)胞損傷也會(huì)減小，能在較短的時(shí)間里獲得大量的細(xì)胞[2]。本試驗(yàn)選取鼎元種牛育種有限公司的10頭優(yōu)質(zhì)種公牛的耳組織，通過(guò)比較2 種培養(yǎng)Fbs的方法以期高效地得到成纖維細(xì)胞。通過(guò)Fbs 的培養(yǎng)和獲取后續(xù)進(jìn)行成纖維體細(xì)胞核移植，能將生產(chǎn)性能良好的種公牛資源進(jìn)行保存。試驗(yàn)結(jié)果表明，使用組織貼壁+雙酶培養(yǎng)能縮短細(xì)胞遷移和培養(yǎng)時(shí)間，且所獲得的細(xì)胞在傳代后生長(zhǎng)狀態(tài)依舊良好。

5 結(jié)論

本試驗(yàn)使用組織塊對(duì)2 種消化方法進(jìn)行比較，最終結(jié)果表明使用組織貼壁+雙酶消化能夠縮短細(xì)胞遷移時(shí)間和培養(yǎng)時(shí)間，傳代后細(xì)胞貼壁較好，活力未受到較大影響，能正常生長(zhǎng)。該方法是一種快速有效獲得牛耳成纖維細(xì)胞的方法，能夠作為在體細(xì)胞核移植技術(shù)中提供供體細(xì)胞的有效方法。