孫超?康帥?吳謐?李曉露?高福然

摘要：目的 建立激光散射法測(cè)定非達(dá)霉素原料藥粒度的方法。方法 采用Mastersizer 2000激光粒度儀，干法測(cè)定，標(biāo)準(zhǔn)文丘里管，樣品折射率1.50，顆粒吸收率0.01，分散氣壓0.20 MPa，振動(dòng)進(jìn)樣速度80%，背景和測(cè)定掃描時(shí)間10 s，遮光度范圍0.5%～5.0%，每個(gè)試樣重復(fù)測(cè)定2次。結(jié)果 所建立方法的重復(fù)性、中間精密度、耐用性考察結(jié)果的RSD均小于10%。結(jié)論 該方法準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好，可用于非達(dá)霉素原料藥的粒度測(cè)定。

關(guān)鍵詞：激光散射法；非達(dá)霉素；粒度；分散氣壓；振動(dòng)進(jìn)樣速度

中圖分類(lèi)號(hào)：R917文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Development and verification of laser scattering method for determining the particle size of fidaxomicin

Sun Chao， Kang Shuai， Wu Mi， Li Xiao-lu， and Gao Fu-ran

（1 National Engineering Research Center of Microbial Medicine， Hebei Industrial microbial Metabolic Technology Innovation Center，New Drug Research & Development Company of NCPC， Shijiazhuang 052165）

Abstract Objective To establish a laser diffraction analysis method for the determination of particle size of fidaxomicin. Methods The Mastersizer 2000 laser diffraction particle size analyzers was used with a model of dry determination and standard venture tube. The conditions were as follows： The index of refraction was 1.50， the absorption was 0.01， the dispersing pressure was 0.20 MPa， the feed rate was 80%， the measurement time for background and samples was 10 seconds， the obscuration was 0.5%～5.0%， each sample repeated measurement twice. Results The RSDs of the repeatability， intermediate precision and durability of the determined method were all less than 10%. Conclusion The method has high accuracy and good repeatability， can be used to determine the particle size of fidaxomicin.

Key words Laser diffraction method; Fidaxomicin; Particle size; Dispersing pressure; Feed rate

艱難梭菌（Clostridium difficite）是抗生素相關(guān)性腹瀉和假膜性腸炎的主要病原菌，艱難梭菌感染 （Clostridium difficile infection ，CDI）可導(dǎo)致嚴(yán)重腹瀉、結(jié)腸炎癥，嚴(yán)重感染可導(dǎo)致患者死亡。治療艱難梭菌感染的傳統(tǒng)藥物是甲硝唑和萬(wàn)古霉素，甲硝唑和萬(wàn)古霉素可以有效抑制艱難梭菌，但隨著耐藥菌株的出現(xiàn)，治療效果逐漸降低，同時(shí)長(zhǎng)期應(yīng)用甲硝唑和萬(wàn)古霉素腸道正常菌群環(huán)境遭到破壞，增加艱難梭菌感染復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)[1]。2011年5月27日，F(xiàn)DA 批準(zhǔn)Optime公司新藥非達(dá)霉素（fidaxomicin，商品名 Dificid?）用于治療艱難梭菌感染伴隨的腹瀉，非達(dá)霉素的臨床治愈率高、復(fù)發(fā)率低，是目前理想的抗艱難梭菌藥物。

非達(dá)霉素（fidaxomicin）是1種由放線菌屬發(fā)酵而來(lái)的新型窄譜大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素，分子量為1058.04，分子式為C52H74CL2O18，易溶于甲醇、乙醇、碳酸鈉水溶液等，微溶于苯、丙醇、二氯甲烷、丙酮，不溶于己烷、水、碳酸氫鈉水溶液[2]。經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室測(cè)定非達(dá)霉素在pH1.0、4.5、5.8和6.8的水性介質(zhì)中幾乎不溶，原料藥的粒度決定了原料藥的比表面積，對(duì)口服制劑而言，直接影響制劑的處方、制備工藝、溶出情況，從而影響藥物的療效，對(duì)于液體制劑，也會(huì)影響到其處方及制備工藝，了解原料藥的粒度分布情況，對(duì)于制劑開(kāi)發(fā)非常重要。

粉體粒度測(cè)定常見(jiàn)的分析方法有顯微鏡法、篩分法和激光散射法等[3]。激光散射法具有操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確度高、測(cè)量范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于原料藥粒度分布的質(zhì)量控制[4-5]。

非達(dá)霉素的結(jié)晶形態(tài)為棒狀（圖1），流動(dòng)性差。本文通過(guò)對(duì)進(jìn)樣方式、振動(dòng)進(jìn)樣速度、分散氣壓以及測(cè)量時(shí)間等參數(shù)的考察，建立了激光散射法測(cè)定非達(dá)霉素原料藥粒度分布的方法，用于非達(dá)霉素原料藥的粒度測(cè)定和生產(chǎn)中的粒度質(zhì)量控制。

1 儀器與材料

Mastersizer 2000激光粒度儀（Malvern Panalytical Ltd）；BT-1001智能粉體特性測(cè)試儀（丹東百特儀器有限公司）；BX51顯微鏡（Olympus Ltd）；非達(dá)霉素原料藥（本公司自制，批號(hào)YNFN1810402、YNFN1811401、YNFN1811402、YNFN2204401、YNFN2204402、YNFN2204403）。

2 分析方法的建立

2.1 進(jìn)樣方式選擇

激光粒度儀進(jìn)樣方式分為濕法進(jìn)樣和干法進(jìn)樣兩種。濕法進(jìn)樣測(cè)定重復(fù)性好，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，缺點(diǎn)是樣品測(cè)量時(shí)間長(zhǎng)、樣品池清洗困難，有些樣品很難找到合適的分散劑，同時(shí)使用有機(jī)分散劑會(huì)污染環(huán)境。干法進(jìn)樣測(cè)定簡(jiǎn)單快捷，重復(fù)性略差。

非達(dá)霉素在水中不溶，用水作為分散劑測(cè)量非達(dá)霉素原料藥粒度時(shí)，非達(dá)霉素在水中發(fā)生團(tuán)聚，加入表面活性劑并進(jìn)行超聲后，隨著測(cè)量時(shí)間的延長(zhǎng)，測(cè)量結(jié)果逐漸增大，表示仍有團(tuán)聚現(xiàn)象，難以形成均勻的分散體系，因此本研究選擇干法測(cè)定。

2.2 測(cè)量參數(shù)的選擇

采用干法測(cè)定粒度分布時(shí)，樣品通過(guò)振動(dòng)盤(pán)進(jìn)入系統(tǒng)后被氣流吹散，通過(guò)樣品池產(chǎn)生激光散射信號(hào)，檢測(cè)器不能識(shí)別測(cè)定結(jié)果是測(cè)試樣品單個(gè)顆粒的粒度，還是團(tuán)聚的顆粒粒度。根據(jù)檢測(cè)樣品性質(zhì)的不同，選擇合適的分散氣壓、振動(dòng)進(jìn)樣速度和測(cè)量時(shí)間，確保顆粒分散完全且未被氣流粉碎，是決定干法測(cè)定準(zhǔn)確與否的關(guān)鍵。

2.2.1 分散氣壓的考察

非達(dá)霉素原料藥易團(tuán)聚不易分散，調(diào)高分散氣壓有利于保證進(jìn)樣連續(xù)性，將振動(dòng)進(jìn)樣速度設(shè)為80%，測(cè)量時(shí)間10 s，分散氣壓分別設(shè)置為0.10、0.15、0.20、0.25和0.30 MPa進(jìn)行粒度測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可知，D（0.1）、D（0.5）、D（0.9）在0.20～0.25 MPa時(shí)，粒度測(cè)定結(jié)果變化較為平緩，說(shuō)明顆粒分散狀態(tài)良好，為避免顆粒被分散氣壓破壞，故選擇分散氣壓0.20MPa用于粒度測(cè)定。

2.2.2 振動(dòng)進(jìn)樣速度的考察

分散氣壓設(shè)置為0.20 MPa，測(cè)量時(shí)間10 s，振動(dòng)進(jìn)樣速度分別設(shè)置為70%、80%和90%，進(jìn)行粒度測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可知，本品分散氣壓設(shè)置為0.20 MPa，振動(dòng)進(jìn)樣速度分別為70%、80%和90%時(shí)，對(duì)粒度結(jié)果無(wú)明顯影響，故選擇振動(dòng)進(jìn)樣速度80%用于粒度測(cè)定。

2.2.3 測(cè)量時(shí)間的考察

固定分散氣壓為0.20 MPa、 振動(dòng)進(jìn)樣速度80%，考察測(cè)量時(shí)間分別為5、10和15s（背景時(shí)間與測(cè)量時(shí)間相同）條件下對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可知，本品分散氣壓設(shè)置為0.20 MPa、振動(dòng)進(jìn)樣速度80%，測(cè)量時(shí)間分別為5、10和15 s時(shí)，粒度結(jié)果無(wú)明顯差異，故本品粒度測(cè)定的參數(shù)值初步定為：分散氣壓0.20 MPa、振動(dòng)進(jìn)樣速度80%、測(cè)量時(shí)間10 s。

2.3 測(cè)定方法對(duì)比

2.3.1 機(jī)械篩分法

取本品30 g，置于250 μm孔徑篩中，下層篩網(wǎng)孔徑依次為235、180、150、125、90和75 μm，設(shè)置篩分次數(shù)1000次，篩分頻率100次/min。取各藥篩與接收容器，稱(chēng)定重量，根據(jù)篩分前后的重量差異計(jì)算各藥篩上和接收容器內(nèi)顆粒及粉末所占比例（%）。取與激光粒度法篩分圖中給出的范圍內(nèi)體積（%）進(jìn)行比較。非達(dá)霉素原料藥粒徑較小，顆粒之間有團(tuán)聚作用，樣品粘篩，難以通過(guò)篩孔，前后兩次測(cè)量重量差異大于5%，測(cè)量誤差大，無(wú)法與激光散射法進(jìn)行比較。

2.3.2 顯微鏡法

取少量本品放置于載玻片上，選擇200倍顯微鏡鏡直接觀察，調(diào)整多個(gè)視野統(tǒng)計(jì)計(jì)數(shù)粒子50個(gè)，取平均值作為該樣品的粒度，結(jié)果見(jiàn)表4，與激光粒度法相比，兩種方法測(cè)得的粒度結(jié)果沒(méi)有顯著差異。顯微鏡法雖簡(jiǎn)單快捷，但易受人為因素影響，且取樣量少，代表性不強(qiáng)，只適合粒度分布范圍較窄的樣品。

2.4 測(cè)定方法確定

分析模式：通用模型；干法測(cè)定，標(biāo)準(zhǔn)文丘里管，樣品折射率1.50，顆粒吸收率0.01，分散氣壓0.20 MPa，振動(dòng)進(jìn)樣速度80%，背景和測(cè)定掃描時(shí)間10 s，遮光度范圍0.5%～5.0%，每個(gè)試樣重復(fù)測(cè)定2次，報(bào)告平均結(jié)果。

3 測(cè)定方法驗(yàn)證

根據(jù)ICH指南要求，典型的驗(yàn)證指標(biāo)包括專(zhuān)屬性、線性、范圍、準(zhǔn)確度、精密度、耐用性、檢測(cè)限、定量限。但激光粒度測(cè)試不能區(qū)分樣品中的不同組分，因此ICH定義的專(zhuān)屬性是不適用的。激光粒度測(cè)試沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)品，線性、檢測(cè)限、定量限也不適用于激光粒度測(cè)試。USP<429>也未要求開(kāi)展準(zhǔn)確度驗(yàn)證[6]，因?yàn)閷?duì)于非球形顆粒，不同測(cè)試儀器會(huì)給出不同的結(jié)論。因此，采用激光散射法對(duì)粒度進(jìn)行測(cè)定常規(guī)的驗(yàn)證項(xiàng)目?jī)H包括重復(fù)性、中間精密度、耐用性。

3.1 重復(fù)性試驗(yàn)

取非達(dá)霉素原料藥樣品，連續(xù)測(cè)定6次，統(tǒng)計(jì)樣品的D（0.1）、D（0.5）、D（0.9）的平均值及RSD，結(jié)果見(jiàn)表5。

由表5可知，D（0.1）、D（0.5）、D（0.9）6次測(cè)量結(jié)果的RSD分別為1.25%、0.60%和0.75%，說(shuō)明該方法重復(fù)性良好。

3.2 中間精密度試驗(yàn)

取非達(dá)霉素原料藥樣品，由不同試驗(yàn)人員，在不同時(shí)間，按“2.4”項(xiàng)下儀器參數(shù)進(jìn)行測(cè)定，與“3.1”項(xiàng)下的6組數(shù)據(jù)一起計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果見(jiàn)表6。

由表6可知，12組數(shù)據(jù)D（0.1），D（0.5），D（0.9）的RSD分別為1.14%、0.91%和2.39%，說(shuō)明該方法中間精密度良好。

3.3 耐用性試驗(yàn)

分別考察分散氣壓（0.20±0.02） MPa、振動(dòng)進(jìn)樣速度（80%±4%）微小變化對(duì)非達(dá)霉素原料藥粒度測(cè)定結(jié)果的影響。

（1）在“2.4”項(xiàng)下儀器參數(shù)的基礎(chǔ)上調(diào)整分散氣壓為0.18 MPa和0.22 MPa，分別測(cè)定3次，與“3.1”項(xiàng)下前3組數(shù)據(jù)計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果見(jiàn)表7。

由表7可知，分散氣壓在（0.20±0.02） MPa范圍內(nèi)，9組數(shù)據(jù)D（0.1）、D（0.5）和D（0.9）的RSD分別為7.98%、7.01%和6.27%，說(shuō)明該方法在此條件下耐用性良好。

（2）在“2.4”項(xiàng)下儀器參數(shù)的基礎(chǔ)上調(diào)整振動(dòng)進(jìn)樣速度為76%和84%，分別測(cè)定3次，與“3.1”項(xiàng)下前3組數(shù)據(jù)計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果見(jiàn)表8。

由表8可知，振動(dòng)進(jìn)樣速度在（80%±4%）范圍內(nèi)，9組數(shù)據(jù)D（0.1）、D（0.5）、D（0.9）的RSD分別為1.41%、0.57%和1.88%，說(shuō)明該方法在此條件下耐用性良好。

3.4 樣品測(cè)定

按“2.4”項(xiàng)下確定的方法，測(cè)定6批非達(dá)霉素原料藥的粒度，統(tǒng)計(jì)各批次樣品的D（0.1）、D（0.5）、D（0.9）的平均值及RSD，結(jié)果見(jiàn)表9。

結(jié)果表明，各批次樣品的D（0.1）、D（0.5）、D（0.9） RSD值均小于2.5%，所建立的方法穩(wěn)定可靠，可用于非達(dá)霉素原料藥粒度的測(cè)定。

4 討論

隨著一致性評(píng)價(jià)的開(kāi)展，原料藥的粒度分布越來(lái)越受到制藥業(yè)的重視。原料藥粒度分布的不同，會(huì)導(dǎo)致顆粒流動(dòng)性、可壓性、溶解性的變化，從而導(dǎo)致制劑關(guān)鍵參數(shù)的改變。使用激光散射法測(cè)定樣品粒度分布前，需要采用粒徑分布特征值已知的“標(biāo)準(zhǔn)粒子”對(duì)儀器進(jìn)行評(píng)價(jià)，平行測(cè)定5次“標(biāo)準(zhǔn)粒子”，其D（0.1）、D（0.5）、D（0.9）的均值與其特征值的偏差、RSD應(yīng)符合《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版的要求；樣品加入進(jìn)樣器時(shí)，需進(jìn)行過(guò)篩操作，減少團(tuán)聚對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。每次測(cè)定（尤其是粒度范圍分布較寬的樣品），樣品量不宜過(guò)多，樣品盤(pán)中殘留的粉末過(guò)多，會(huì)導(dǎo)致取樣不均因，影響數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度；測(cè)定結(jié)束后，需要用微晶纖維素或甘露醇對(duì)測(cè)定管路進(jìn)行清洗。

目前我國(guó)藥企多用激光粒度儀對(duì)原料藥粒度進(jìn)行檢測(cè)，但關(guān)于激光散射法測(cè)定藥品粒度的方法驗(yàn)證，文獻(xiàn)報(bào)道較少。USP <429>基于ISO13320-1（1999）標(biāo)準(zhǔn)和9276-1（1998）開(kāi)發(fā)[6]，僅規(guī)定了重復(fù)性、中間精密度的相關(guān)要求。本研究依據(jù)ICH Q2（R1）及馬爾文帕納科公司培訓(xùn)資料，建立了激光散射法測(cè)定非達(dá)霉素粒度的方法，并在重復(fù)性和中間精密度試驗(yàn)的基礎(chǔ)上增加了耐用性試驗(yàn)，使激光粒度測(cè)定方法的驗(yàn)證內(nèi)容更科學(xué)和嚴(yán)謹(jǐn)。同時(shí)根據(jù)USP <429>，將方法學(xué)考察結(jié)果和樣品測(cè)定結(jié)果的RSD標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定為小于10%。

本研究所建立的粒度測(cè)定方法簡(jiǎn)潔易行，可用于非達(dá)霉素原料藥的粒度測(cè)定和生產(chǎn)中的粒度質(zhì)量控制，也可為易團(tuán)聚原料藥粒度測(cè)定方法的開(kāi)發(fā)提供參考。

參 考 文 獻(xiàn)

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收稿日期：2023-01-30

基金項(xiàng)目：河北省科技研發(fā)平臺(tái)建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)（No. 22567651H）

作者簡(jiǎn)介：孫超，男，生于1984年，碩士，工程師，從事藥物制劑開(kāi)發(fā)工作，E-mail： sunchao1984@hotmail.com

*通信作者，E-mail： gfr78@163.com