王保貴　王娜娜　周思緒　陳俊羽　吳秋云　徐榮　胡文　陳春林

摘要：目的 探究多西環(huán)素聯(lián)合利福平對耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae， CRKP）體內(nèi)外抗菌活性。方法 收集宜春市人民醫(yī)院臨床分離的非重復(fù)CRKP，測定多種常用抗菌藥物對其最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration， MIC）。通過棋盤稀釋法進行聯(lián)合藥敏試驗，計算部分抑菌濃度指數(shù)（fractional inhibitory concentration index， FIC）判定聯(lián)合效果。體外時間-殺菌曲線觀察聯(lián)合殺菌作用。采用結(jié)晶紫染色法測定兩藥聯(lián)用對生物膜形成的抑制作用及清除作用。鼻腔滴注法建立小鼠肺部肺炎克雷伯菌感染模型，檢測鼠肺部細(xì)菌濃度變化、血清C-反應(yīng)蛋白（CRP）、IL-6水平。HE染色觀察肺組織病理形態(tài)學(xué)改變。結(jié)果 棋盤法顯示多西環(huán)素聯(lián)合利福平效果最好，兩藥聯(lián)用時多西環(huán)素的MIC值從（4～256 μg/mL）下降到（2～8 μg/mL），利福平的MIC值從（16～256 μg/mL）下降到（2～16 μg/mL）。時間-殺菌曲線顯示，多西環(huán)素聯(lián)合利福平對細(xì)菌作用24 h內(nèi)，使細(xì)菌數(shù)較初始細(xì)菌數(shù)降低≥2lg CFU/mL，呈現(xiàn)抑菌或殺菌作用。結(jié)晶紫染色法測定，聯(lián)合組對細(xì)菌生物膜抑制生長和破壞作用較對照組差異性明顯（P<0.05）。動物實驗表明，聯(lián)合組小鼠肺部組織細(xì)菌數(shù)、C-反應(yīng)蛋白（CRP）、IL-6水平顯著降低，感染情況明顯改善，肺泡結(jié)構(gòu)清晰，充血減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 體外實驗表明，多西環(huán)素聯(lián)用利福平對CRKP具有協(xié)同抗菌或殺菌作用，動物實驗證實多西環(huán)素聯(lián)用利福平可降低炎性指標(biāo)，有效治療肺組織細(xì)菌感染，有體內(nèi)抗菌作用。此結(jié)果可供臨床參考。

關(guān)鍵詞：碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌；聯(lián)合藥敏；殺菌曲線；生物膜；動物實驗

中圖分類號：R965文獻標(biāo)志碼：A

In vitro and in vivo antibacterial activity of doxycycline combined with rifampicin against carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae

Wang Baogui1， Wang Nana2， Zhou Sixu1， Chen JunYu1， Wu Qiuyun1， Xu Rong3， Hu Wen3， and Chen Chunlin1

（1 School of Chemical and Biological Engineering， Yichun University， Yichun 336000; 2 Lanling People's Hospital， Linyi 276000;

3 Yichun People's Hospital， Yichun 336000）

Abstract Objective To investigate the antibacterial activity of doxycycline combined with rifampicin against carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae （CRKP） in vitro and in vivo. Methods? ? The clinical isolates of non-repetitive CRKP were collected from Yichun People's Hospital， and the minimum inhibitory concentrations of various commonly used antibiotics to them were determined. The checkerboard dilution method was used to perform the combined drug sensitivity test， and the fractional inhibitory concentration index （FICI） was calculated to determine the combined effect. The time-killing curve in vitro was used to observe the bactericidal effect of the combination. Crystal violet staining was used to determine the inhibitory effect of the two drugs on biofilm formation and clearance. A mouse model of Klebsiella pneumoniae infection in the lungs of mice was established by nasal instillation. The changes in lung bacterial concentration and serum levels of C-reactive protein （CRP） and IL-6 were detected. HE staining was used to observe the pathological changes of lung tissue. Results? ? The checkboard test results showed that doxycycline combined with rifampicin had the best effect. When combined， the MIC value of doxycycline decreased from （4～256 μg/mL） to （2～8 μg/mL）; while that of rifampicin decreased from （16～256 μg/mL） to （2～16 μg/mL）.

The time-killing curve showed that doxycycline combined with rifampicin could reduce the number of bacteria by ≥2lg CFU/mL within 24 hours compared with the initial bacterial count， indicating an antibacterial or bactericidal effect. Crystal violet staining showed that the growth inhibition and destruction of bacterial biofilm in the combined group were significantly different from those in the control group （P＜0.05）. Animal experiments showed that the number of bacteria， CRP， and IL-6 levels in the lung tissue of mice in the combination group were significantly reduced， the infection situation was significantly improved， the alveolar structure was clear， and the congestion was reduced. The differences were statistically significant （P＜0.05）. Conclusion? ? Doxycycline combined with rifampicin has synergistic antibacterial or bactericidal effect against CRKP in vitro. Animal experiments have confirmed that doxycycline combined with rifampicin can reduce inflammatory markers， effectively treat lung tissue bacterial infection， and have antibacterial effect in vivo. The results can be used as clinical references.

Key words Carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae; Combined drμg sensitivity; Bactericidal curve;? Biofilm; Animal experiments

碳青霉烯類抗生素被視為治療多重耐藥革蘭陰性菌的最后一道防線[1]。耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae， CRKP）出現(xiàn)后，由于耐藥基因廣泛，預(yù)后差，死亡率高[2]。現(xiàn)有抗菌藥物缺少有效性，給臨床治療帶來極大困擾，亟需尋找新的有效治療方案。

多西環(huán)素屬四環(huán)素類，可特異性與細(xì)菌核糖體30S亞基在A位置結(jié)合，改變細(xì)胞膜通透性，發(fā)揮抑菌作用[3]。對CRKP有較高敏感性，與阿米卡星聯(lián)用時，對CRKP有協(xié)同抑菌作用[4]。多西環(huán)素單用時有“低耐藥潛力”特質(zhì)，幾乎沒有副作用，抗菌潛力有待挖掘[5]。利福平通過抑制細(xì)菌RNA，破壞蛋白質(zhì)合成，且具有穿透生物膜特性[6]。利福平與其他抗菌藥物聯(lián)用對CRKP表現(xiàn)出良好的協(xié)同作用[7-8]。臨床上，多西環(huán)素與利福平聯(lián)用治療布魯菌病時呈現(xiàn)良好協(xié)同效果[9]。

目前，多數(shù)實驗表明藥物聯(lián)用對CRKP抗菌效果更好[10]，臨床上對于CRKP感染的治療效果和預(yù)后聯(lián)合用藥也優(yōu)于單藥治療[11]。CRKP對四環(huán)素類藥物（替加環(huán)素、米諾環(huán)素）一直保持較高敏感度[12]，利福平和其他抗生素聯(lián)用時對CRKP有抗菌效果[13]。本實驗旨在通過體外實驗和動物實驗，評估多西環(huán)素聯(lián)用利福平體內(nèi)外抗菌效果，探索藥物方案合理性，以期為臨床治療CRKP提供新的用藥選擇。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源

宜春市人民醫(yī)院2021年分離的8株非重復(fù)CRKP，來自神經(jīng)外科和ICU感染患者標(biāo)本。分別取自感染患者痰液和腦脊液。8株非重復(fù)肺炎克雷伯菌對亞胺培南、美羅培南的最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）≥4 mg/L，符合CDC對于碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細(xì)菌（CRE）最新定義標(biāo)準(zhǔn)，既全為CRKP[14]。

1.1.2 培養(yǎng)基和抗菌藥物

抗菌藥物多西環(huán)素（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號：D2129050）、利福平（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號：F2116178）、磷霉素（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號：C11480181）、頭孢他啶（海南海靈化學(xué)制藥有限公司，批號：1906212）、左氧氟沙星（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號：F2115338）、美羅培南（?？谑兄扑帍S有限公司，批號：09191105）、亞胺培南（Merck Sharp &Dohme Corp.U.S.A，批號：T008366）。M-H瓊脂、M-H肉湯培養(yǎng)基，由各試劑配制而成（可溶性淀粉（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號：200114）、酸水解酪蛋白（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號：A2213608）、牛肉膏（北京索萊寶生物科技有限公司，批號：NO. 312D051）、瓊脂粉（北京索萊寶生物科技有限公司，批號：NO. 507V025）。

1.1.3 儀器

WGZ-2XJ 細(xì)菌濁度儀（上海昕瑞儀器儀表有限公司），TECAN Infinite 200 PRO全波段酶標(biāo)儀（北京世貿(mào)遠(yuǎn)東科學(xué)儀器有限公司），Phoenix-100全自動細(xì)菌鑒定儀（美國BD公司）。

1.1.4 動物

動物50只ICR種雄性小白鼠，鼠齡8周，體重18～22 g，由湖南斯萊克景達實驗有限公司提供。動物許可證號：SCXK（湘）2019-0004。

1.2 實驗方法

1.2.1 微量稀釋法藥敏實驗

采用微量肉湯稀釋法測定西環(huán)素、利福平、磷霉素、頭孢他啶、左氧氟沙星和美羅培南等12種抗菌藥物對8株CRKP的最低抑菌濃度（MIC），參照美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（Clinical and Laboratory Standards Institute， CLSI）2017年M100s-27th推薦的規(guī)范和折點實施試驗和判讀結(jié)果[15]。

1.2.2 聯(lián)合藥敏實驗

棋盤法測定多西環(huán)素（doxycycline，DOX）分別聯(lián)合利福平（rifampicin，RIF）、磷霉素（fosfomycin，F(xiàn)OS）、頭孢他啶（ceftazidime，CAZ）、左氧氟沙星（levofloxacin，LEV）的4種藥物方案的聯(lián)合藥敏，每個抗生素的藥物濃度測試范圍是0.25～512 mg/L。部分抑菌濃度指數(shù)（fractional inhibitory concentration index，F(xiàn)IC）作為聯(lián)合藥敏試驗結(jié)果的判斷依據(jù)。FIC=MIC甲藥聯(lián)合/MIC甲藥單藥+MIC乙藥聯(lián)合/ MIC乙藥單藥。FIC≤0.5為協(xié)同作用，0.5＜FIC≤1為相加作用，1＜FIC≤2為無關(guān)作用，F(xiàn)IC＞2為拮抗作用[16]。

1.2.3 時間殺菌曲線

使用時間殺傷試驗繪制協(xié)同殺菌曲線。殺傷效果通過標(biāo)準(zhǔn)時間殺傷試驗進行量化，使用棋盤實驗數(shù)據(jù)顯示的有效藥物組合最低抑菌濃度[17]。判斷標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)菌數(shù)較初始細(xì)菌數(shù)降低≥3lg CFU/mL為殺菌效應(yīng)；細(xì)菌數(shù)較初始細(xì)菌數(shù)降低≥2lg CFU/mL為抑菌效應(yīng)；聯(lián)用后細(xì)菌數(shù)較最有效單藥降低>2lg CFU/mL為協(xié)同作用。

1.2.4 抗菌藥物對生物膜的影響

生物膜形成能力檢測：采用結(jié)晶紫染色法檢測生物膜形成能力[18]，以A值（陰性對照的平均A值+3×標(biāo)準(zhǔn)差值）為臨界值。大于該A值則判定為可形成生物膜（A：光密度，可以反映生物膜的黏附能力）。

1.2.5 生物被膜抑制試驗

采用結(jié)晶紫染色法檢測生物膜形成能力[19-20]。本次實驗選取時間殺菌曲線結(jié)果最好的藥物組合，同時考慮兩藥聯(lián)用時使MIC降低的程度和藥物在體內(nèi)可以達到的濃度范圍。實驗在96孔組織培養(yǎng)板上進行，合理選取3孔作為一組，分別為多西環(huán)素組，利福平組，聯(lián)用組，每孔各加入100 μL稀釋后菌液和100 μL藥液。同時設(shè)置只含培養(yǎng)基和菌液的對照組。37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h后拿出，吸出孔中液體，用無菌PBS清洗3次，以便清洗附著細(xì)菌。然后加99%甲醇固定15 min，自然干燥后加入200 μL濃度為0.1%結(jié)晶紫染液，染色15 min，然后用PBS徹底清洗，洗去剩余的結(jié)晶紫染液，室溫晾干20 min后加入的95%乙醇溶解，放置15 min，溶解附著的生物膜。然后用酶標(biāo)儀測定590 nm波長處的生物膜的A值，計算抑制率。

1.2.6 生物被膜清除試驗

此實驗與生物膜抑制實驗稍有不同，首先是細(xì)菌生物膜培養(yǎng)，先于96孔板中加入200 μL菌液，在37 ℃

條件下恒溫箱中培養(yǎng)72 h，使其形成穩(wěn)態(tài)成熟期生物膜。然后照“1.2.5”操作，測定數(shù)值，計算清除率。

1.2.7 小鼠感染模型建立[21]

小鼠麻醉后，鼻腔滴入新鮮配制肺炎克雷伯菌液30 μL（108 CFU/mL），接種后使小鼠保持直立體位20 s，以保證菌液因重力作用而進入肺組織，接種后置于籠中自由取食。將50只老鼠隨機分為模型組、對照組、多西環(huán)素組、利福平組、多西環(huán)素和利福平聯(lián)用組，每組10只。連續(xù)給藥5 d（動物實驗由宜春學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批通過）。

1.2.8 肺組織菌落計數(shù)[22]

給藥5 d后，對老鼠麻醉后，無菌開胸取肺，用無菌生理鹽水沖洗干凈，右肺組織吸干表面水分后稱重，置于1 mL生理鹽水中勻漿并10倍稀釋（1：101～1：105），分別取100 μL用L形玻璃棒均勻涂抹于無藥MH瓊脂平板上，37 ℃孵育24 h，進行細(xì)菌計數(shù)。

1.2.9 血清CPR和炎性因子IL-6指標(biāo)檢測

麻醉小鼠，眼球取血暫存EP管中，3500 r/min，離心10 min，采用酶聯(lián)免疫法檢測血清CRP、和IL-6水平，步驟嚴(yán)格按照試劑說明書要求操作。

1.2.10 肺組織HE染色[23]

切取部分小鼠肺組織，經(jīng)4%多聚甲醛中固定，然后常規(guī)脫水、包埋、切片、HE染色，光鏡下觀察肺組織病理狀態(tài)變化。

1.2.11 統(tǒng)計學(xué)分析

采用GraphPad Prism 8.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析及圖片繪制，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CRKP的藥敏結(jié)果

8株CRKP菌株對多黏菌素（polymyxin，POL）、替加環(huán)素（tigecycline，TGC）敏感率為100%，對多西環(huán)素（DOX）敏感率為12.5%，對頭孢哌酮舒巴坦鈉（sulbactam and cefoperazone，CSL）、哌拉西林/他唑巴坦（piperacillin sodium and tazobactam sodium for injection，TZP）、頭孢他啶（CAZ）、頭孢曲松（ceftriaxone sodium，CRO）、氨曲南（aztreonam，ATM）、亞胺培南（imipenem，IMP）、厄他培南（ertapenem，ETP）、慶大霉素（gentamicin，GEN）、阿米卡星（amikacin，AMK）、環(huán)丙沙星（ciprofloxacin，CIP）、左氧氟沙星（LEV）、磷霉素（FOS）、利福平（RIF）耐藥率為100%，見表1。

2.2 多西環(huán)素與利福平等聯(lián)合藥敏

棋盤法藥敏結(jié)果顯示，多西環(huán)素與利福平藥物聯(lián)用組合對8株CRKP體外抑菌實驗效果最為顯著，4株顯示協(xié)同作用，4株顯示相加作用。多西環(huán)素與左氧氟沙星、頭孢他啶或磷霉素聯(lián)合中，對2株顯示無關(guān)或拮抗作用，其中與頭孢他啶聯(lián)合對另外2株顯示協(xié)同作用，其他4株為相加作用；與左氧氟沙星聯(lián)用，對另1株顯示協(xié)同作用，其他5株為相加作用；與磷霉素聯(lián)用，對另外6株顯示相加作用，見表2～3。

2.3 多西環(huán)素與利福平等聯(lián)合時間殺菌曲線

基于棋盤法聯(lián)合藥敏實驗結(jié)果，選取CRKP2、CRKP8進行體外時間殺菌曲線實驗，觀察多西環(huán)素與利福平等藥物聯(lián)合后殺菌作用。依據(jù)FIC值和藥物在體內(nèi)可達到血藥濃度，合理選取藥物濃度。結(jié)果顯示，多西環(huán)素與磷霉素和左氧氟沙星的藥物組合，兩藥聯(lián)合均有相加作用，但對細(xì)菌沒有起到殺菌或抑菌作用。多西環(huán)素與利福平聯(lián)用對CRKP2在（t+24）時達到殺菌效果，曲線呈下行趨勢。多西環(huán)素和利福平聯(lián)用對CRKP8在（t+9）時達到殺菌效果，之后細(xì)菌呈增長趨勢，見圖1。

2.4 結(jié)晶紫染色法檢測生物膜成膜能力

于96孔板對生物膜進行72 h培養(yǎng)后定量可知，CRKP2成膜能力最強，見圖2。

2.5 多西環(huán)素與利福平聯(lián)合對生物膜的抑制作用

基于殺菌曲線結(jié)果和細(xì)菌成膜能力的比較，實驗選取CRKP2分為4組（多西環(huán)素組、利福平組、聯(lián)合組、對照組）進行生物膜抑制作用實驗，生物膜生長情況和生物膜抑制率，見圖3。

多西環(huán)素組抑制率為64%，利福平組抑制率為47%，聯(lián)合組抑制率91%，聯(lián)合組與多西環(huán)素組和利福平組相比較抑制率分別提高了27%，44%（P<0.001，具有統(tǒng)計學(xué)意義）。

2.6 多西環(huán)素與利福平等聯(lián)合對生物膜清除作用

基于殺菌曲線結(jié)果和細(xì)菌成膜能力的比較，實驗選取CRKP2分為4組（多西環(huán)素組、利福平組、聯(lián)合組和對照組）進行生物膜清除作用實驗，各組生物膜生長情況和藥物對生物膜清除率見圖4。

多西環(huán)素組清除率為28%，利福平組清除率為23%，聯(lián)合組清除率為65%，聯(lián)合組與多西環(huán)素組和利福平組相比較抑制率分別提高了37%和42%（P<0.001，具有統(tǒng)計學(xué)意義）。

2.7 各組小鼠肺組織菌落計數(shù)

由實驗結(jié)果可見，模型組菌落數(shù)明顯高于正常組，感染嚴(yán)重。聯(lián)合組小鼠肺組織菌落數(shù)數(shù)量明顯低于模型組和單藥組，趨近于正常組。聯(lián)合組與各組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001），見圖5。

2.8 血清CPR和炎性因子IL-6的指標(biāo)變化

由實驗結(jié)果可見，與正常組相比，模型組血清中CRP和IL-6的數(shù)值明顯升高，與模型組相比，聯(lián)合組血清中CRP和IL-6的水平顯著下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖6。

2.9 各組小鼠肺組織HE染色情況

由實驗結(jié)果可見，正常組肺臟組織表面被覆一層光滑的漿膜，無明顯異常；肺臟實質(zhì)為肺內(nèi)支氣管各級分支及其終末的大量肺泡，各級支氣管結(jié)構(gòu)無明顯異常，肺泡壁由單層上皮組成，結(jié)構(gòu)清晰；間質(zhì)包括肺內(nèi)結(jié)締組織及血管等，均無明顯異常；未見明顯的炎性改變。與正常組相比，模型組大面積的肺泡壁輕度增厚，肺泡間距增寬，并伴有少量的粒細(xì)胞浸潤（藍(lán)色箭頭）。肺泡腔內(nèi)浸潤大量炎性細(xì)胞，肺泡結(jié)構(gòu)模糊（黃色箭頭）。與正常組相比，大面積的肺泡壁輕度增厚，肺泡間距增寬，結(jié)構(gòu)相對清晰（藍(lán)色箭頭）；局部血管周圍輕度出血，可見少量的紅細(xì)胞（黃色箭頭），見圖7。

通過HE染色，對肺組織炎癥細(xì)胞計數(shù)，與正常組相比，模型組數(shù)據(jù)顯著升高，與模型組相比，聯(lián)合組數(shù)據(jù)明顯下降。與模型組、單藥組相比，差異性顯著，具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001），見圖8。

3 討論

肺炎克雷伯菌為革蘭陰性桿菌，可致人體多個部位感染，是醫(yī)院常見條件致病菌[24]。因為抗生素不合理應(yīng)用，肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類藥物耐藥率越來越高，檢出率越來越高，2018年CHINET細(xì)菌耐藥性監(jiān)測結(jié)果顯示：肺炎克雷伯菌對亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別從2005年的3.0%和2.9%上升到了2018年的25.0%和26.3%，耐藥率上升幅度超過8倍，且在革蘭陰性桿菌中的檢出率占比亦在上升[25]，可選擇治療藥物越來越少，治療難度逐漸增大，成為一個亟需解決的臨床感染治療難題。

此次實驗中，多西環(huán)素聯(lián)用利福平對8株CRKP表現(xiàn)出最有效協(xié)同作用，兩藥聯(lián)用時MIC值較單藥下降明顯，藥物濃度均在可達到的正常范圍內(nèi)。時間殺菌曲線實驗中，多西環(huán)素（4 mg/L）+利福平（8 mg/L）、多西環(huán)素（8 mg/L）+利福平（8 mg/L）分別對CRKP2/CRKP8在24 h內(nèi)呈現(xiàn)出殺菌效果，提示臨床上兩藥聯(lián)用對治療CRKP感染可能會有協(xié)同殺菌作用。兩藥屬于濃度依賴性抗生素，在耐受安全的情況下，更高劑量的藥物濃度可能有更好治療效果。研究發(fā)現(xiàn)[26]，生物膜能增強細(xì)菌的耐藥性，與超過65%的院內(nèi)感染有關(guān)。CRKP有較強生物膜形成能力，形成生物膜后治療起來更難，死亡率更高[27]。生物膜實驗證明，多西環(huán)素聯(lián)合利福平可有效抑制早期生物膜的形成，抑制率高達91%，對成熟生物膜的清除率也可達到65%，能有效降低細(xì)菌生物膜耐藥性，增強抗菌效果。動物實驗中，聯(lián)合組小鼠CRP、血清炎性因子指標(biāo)（IL-6）、肺組織菌落數(shù)和炎癥細(xì)胞較模型組水平均下降明顯（P<0.05）[28-29]，具有統(tǒng)計學(xué)意義。聯(lián)合組小鼠肺部感染狀況得到明顯改善，證明多西環(huán)素聯(lián)合利福平在體內(nèi)有明顯抗感染作用，與體外實驗結(jié)論一致。

體外實驗與動物實驗均證明多西環(huán)素聯(lián)合利福平對CRKP有抗菌作用，這可能為臨床治療CRKP感染提供新的用藥參考。

參 考 文 獻

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收稿日期：2022-12-26

作者簡介：王保貴，男，生于1993年，在讀碩士研究生，主要研究方向為臨床藥學(xué)，E-mail： wy71897@163.com

*通信作者，E-mail： chenchunlinycxy@163.com