張琪　李勝　靳娟　何建　楊曉艷　辛有全　柏吉祥　周奎章　張曉璐　蔣可　代瑞霞

摘要：目的? ?應用TaqMan-MGB探針實時熒光定量PCR技術(shù)快速檢測青海省海西州鼠疫自然疫源地鼠疫菌耐鏈霉素基因，為今后該地區(qū)突發(fā)人間鼠疫的精準臨床用藥提供理論依據(jù)。方法 分離培養(yǎng)海西地區(qū)1957—2009年間取自鼠疫患者、媒介昆蟲及中間宿主的代表性鼠疫菌110株，提取其DNA，針對我國鏈霉素耐藥基因rpsl基因設(shè)計引物P-F和P-R和TaqMan-MGB探針Probe1 [FAM]和Probe2[VIC]，利用熒光定量PCR技術(shù)，進行耐藥rpsl基因篩查。結(jié)果 110株被試菌株中FAM檢測均為陽性（RFU峰值>2000）；VIC陽性的為0株（RFU峰值<200）。陽性對照和空白對照成立。結(jié)論 實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，該地區(qū)未檢測出耐鏈霉素菌株。

關(guān)鍵詞：鼠疫菌；TaqMan-MGB探針；熒光定量PCR技術(shù)；耐鏈霉素；青海省海西州

中圖分類號：R978.1文獻標志碼：A

The TaqMan-MGB probe was used in the quantitative real-time PCR technique for rapid detection streptomycin resistance gene of Yersinia pestis，

the natural source of plague in Haixi

Zhang Qi1， Li Sheng1， Jin Juan1， He Jian1， Yang Xiao-yan1， Xin You-quan1， Bai Ji-xiang1， Zhou Kui-zhang2，

Zhang Xiao-lu1， Jiang Ke3， and Dai Rui-xia1

（1 Specialized Laboratory of Yersinia pestis，Qinghai Institute for Endemic Disease Prevention and Control， Xi'ning 810021;

2 Department of Plague， Qinghai Institute for Endemic Disease Prevention and Control， Xi'ning 810021;

3 Department of Public Health， Medical School， Qinghai University， Xi'ning 810001）

Abstract Objective To rapidly detect streptomycin resistance genes of Yersinia pestis in the Natural Focus of Plague of Haixi prefecture in Qinghai province by TaqMan MGB probe fluorescence real-time quantitative PCR， and to provide the theoretical basis for precise clinical drug use of plague emergencies in this area. Methods? ? 110 representative strains of Yersinia pestis collected from 1957 to 2009 from plague patients， vector insects and intermediate hosts were isolated and cultured， with their DNA being extracted. Probe1[FAM] and Probe2[VIC]， which were probes of Primers P-F and P-R and TaqMan-MGB， were designed for the rpsl gene， which was a streptomycin resistance gene often found in China， and fluorescence quantitative PCR was utilized to screen the rpsl gene of plague resistance genes. Results? ? In FAM detection， all 110 strains had positive value （RFU peak> 2000）. No strains were positive in VIC detection （RFU peak<200）. The positive control and the blank control proved to be effective. Conclusion? ? Results of real-time quantitative PCR demonstrated that streptomycin resistant strains were not detected in the tested strains in this area.

Key words Yersinia pestis; TaqMan-MGB probe; Fluorescence quantitative PCR technology; Streptomycin resistance; Haixi， Qinghai Province

鼠疫耶爾森菌（Yersinia pestis）（以下簡稱“鼠疫菌”），屬假結(jié)核腸桿菌屬，兼性厭氧革蘭陰性桿菌，是鼠疫病原體和潛在的致命性生物武器，嚴重威脅著人類健康[1-3]。1928年，Alexander Fleming偶然間發(fā)現(xiàn)了青霉素，至此人類開啟了醫(yī)學新時代，抗生素是現(xiàn)代醫(yī)學的主要支柱，被稱為是20世紀的最偉大成就[4-5]。鏈霉素作為治療鼠疫的首選藥物，顯著提高了鼠疫患者的治愈率，死亡率也由之前的50%～90%降低到5%以下[6-7]。但是耐藥株的出現(xiàn)給臨床治療帶來了新的挑戰(zhàn)[8-9]。

海西州地處青海省西部，疫源面積大，宿主多樣。1956年判定為喜馬拉雅旱獺鼠疫自然疫源地[10]，該地區(qū)分離鼠疫菌毒力強，近年來海西州喜馬拉雅旱獺疫源地動物疫情異?；钴S，是青海省鼠疫較為活躍和危害嚴重的地區(qū)之一[11-12]。因此對該地區(qū)分離鼠疫菌的耐鏈霉素基因篩查很有意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗用菌株

從分離1957—2009年青海省海西州自然疫源地內(nèi)的鼠疫菌株，選擇不同地點、不同時間、不同宿主及媒介的代表性鼠疫菌株共110株作為實驗菌株，以上菌株由青海省地方病預防控制所保存。

1.1.2 實驗菌株培養(yǎng)及DNA提取

將被受試菌株接種于赫氏瓊脂培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)24 h，同時做鼠疫菌特異性噬菌體裂解實驗，培養(yǎng)結(jié)果為純鼠疫菌時，采用傳統(tǒng)的苯酚-氯仿混合抽提法提取菌株DNA[13]，以保證DNA的純度。

1.1.3 主要試劑及儀器

TransStart Probe qPCR SuperMix 購自全式金生物技術(shù)有限公司，PCR產(chǎn)物純化試劑盒購自北京諾博萊德科技有限公司。Real-time Thermal Cycler購自美國賽默飛世爾科技有限公司（型號：5100）。MGB熒光探針及引物由上海輝睿生物科技有限公司合成，引物序列見表1。

1.2 方法

1.2.1 TaqMan-MGB熒光探針法

PCR 體系含DNA（濃度2 ng/μL）模板1 μL， TransStart Probe qPCR SuperMix 10 μL、上游引物和下游引物各1 μL，濃度均為0.1 μmol/L ，0.1 μmol/L rpsL Probe1 [FAM]和Probe2 [VIC]探針各1 μL，去離子水5 μL，每個反應總體積為20 μL。反應條件：94 ℃預變性5 min；95 ℃變性15 s，58 ℃ 延伸30 s，擴增40個循環(huán)。陽性對照模板為文獻[21]中S19960127菌株DNA。

2 結(jié)果

110株被試菌株中Probe2[VIC]陽性的為0株，對應檢測rpsl（128：G），RFU峰值＜200，陽性＞1000。Probe2 [FAM]陽性的為110株，對應檢測rpsl （128：A），RFU峰值>2000，陰性<200；如圖1～2所示。結(jié)果顯示，該地區(qū)未檢測出耐鏈霉素菌株。

3 討論

細菌耐藥性主要是由于細菌的自然選擇、及抗生素過度應用、濫用所導致[14]。自40年代開始采用鏈霉素治療鼠疫后，便陸續(xù)出現(xiàn)了耐鏈霉素菌株。目前，我國仍以鏈霉素作為治療鼠疫患者的首選特效藥物，2003年戴瑞霞等[15]對青海各鼠疫自然疫源地不同宿主的鼠疫菌，包括海西地區(qū)分離鼠疫菌，應用鏈霉素紙片擴散法進行了鏈霉素耐藥性監(jiān)測，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)耐鏈霉素菌株。2018年何建等[16]針對耐鏈霉素strA和strB基因設(shè)計引物，對分離自海西州鼠疫自然疫源地鼠疫菌的DNA進行PCR擴增，也未發(fā)現(xiàn)鏈霉素抗藥菌株。2020年何建等[17]又利用鼠疫菌最低抑菌（minimum inhibitory concentration，MIC）方法測定12種抗菌藥物對分離自青海鼠疫自然疫源地的328株鼠疫菌株的體外抑菌活性，其中包括鏈霉素，結(jié)果發(fā)現(xiàn)均對鏈霉素敏感。法國科學家Galimand等[18]研究證實，耐鏈霉素鼠疫菌通過接合轉(zhuǎn)移其他細菌的耐藥質(zhì)粒作用于氨基糖的特定羥基，使其磷酸化，導致了耐藥。但隨著研究的不斷深入，2020和2021年相繼報道了中國和馬達加斯加耐鏈霉素鼠疫菌耐藥新機制，即通過編輯核糖體蛋白S12的rpsL基因點突變（A→G）后引起的氨基酸43位點（K43R）的替換獲得耐基因突變，導致鏈霉素不能與S12蛋白結(jié)合而表現(xiàn)出鏈霉素抗性[19-21]。由于TaqMan-MGB探針實時熒光定量PCR技術(shù)，特點是對AT含量高的序列探針的設(shè)計有很大幫助[22]，尤其在細菌耐藥基因檢測方面，具有快速且靈敏的優(yōu)勢[23-24]，能快速檢測rpsL基因點突變導致鏈霉素耐藥鼠疫菌。因此，本研究應用TaqMan-MGB探針實時熒光定量PCR技術(shù)，針對我國鏈霉素耐藥基因rpsl基因設(shè)計引物和TaqMan-MGB探針，快速篩檢海西州鼠疫自然疫源地鼠疫菌耐鏈霉素基因，以此掌握當?shù)氐氖笠呔昴退幥闆r，這將對突發(fā)人間鼠疫的精準治療及提高患者的生存率意義重大。

本研究結(jié)果顯示，該地區(qū)110株分離鼠疫菌中FAM檢測均為陽性（RFU峰值>2000）；VIC陽性的為0株（RFU峰值<200），所有被測菌株未檢測出耐鏈霉素菌株。實驗結(jié)果說明該地區(qū)今后仍以鏈霉素作為首選藥物治療鼠疫患者是合理的。但鏈霉素的使用劑量要適當，既要避免過大劑量的應用造成藥物毒副反應出現(xiàn)，又要注意由于劑量不足或聯(lián)合用藥不當而造成耐藥，替代傳統(tǒng)抗生素的新藥研發(fā)也是今后的重要研究方向之一。

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收稿日期：2022-12-12

基金項目：國家自然科學基金項目（No. 82260401）

作者簡介：張琪，女，生于1988年，在讀碩士研究生，主管醫(yī)師，主要從事鼠疫防治及鼠疫菌種鑒定，E-mail： 449132626@qq.com

*通信作者，E-mail： drx200907@163.com