孫 銳, 包家茜, 曹建國, 戴錫玲,①, 衛(wèi) 勤

(1. 上海師范大學生命科學學院, 上海 200234; 2. 上海市奉賢區(qū)農(nóng)業(yè)技術推廣中心, 上海 201400)

卵細胞發(fā)育是蕨類植物有性生殖的重要階段。曹建國等[1-2]在水蕨〔Ceratopteristhalictroides(Linn.) Brongn.〕卵細胞發(fā)育過程中發(fā)現(xiàn)了受精孔,精子通過受精孔進入卵細胞,完成受精過程。隨后,學者們對部分薄囊蕨類的卵細胞發(fā)育過程進行了研究,結(jié)果表明:蕨類植物的卵細胞發(fā)育過程基本都經(jīng)過幼卵、發(fā)育卵和成熟卵3個時期,但發(fā)育過程中的一些細節(jié)有所不同,如分離腔的形成方式、卵膜的有無和結(jié)構(gòu)、受精孔的有無和位置以及是否形成核外突等。核心薄囊蕨類的卵細胞成熟后均能夠形成受精孔,且卵細胞表面出現(xiàn)較厚的卵膜[3-4];而在薄囊蕨類紫萁(OsmundajaponicaThunb.)的卵細胞發(fā)育過程中并未觀察到受精孔和典型的卵膜結(jié)構(gòu)[5],在海金沙〔Lygodiumjaponicum(Thunb.) Sw.〕的卵細胞發(fā)育過程中僅觀察到孔區(qū),但未觀察到受精孔和卵膜[6]。從卵膜和受精孔的有無來看,海金沙可能是介于紫萁和核心薄囊蕨類之間的過渡種類。研究認為,蕨類植物的受精孔和卵膜的演化過程可能從無到有、從簡單到復雜[7],并且,成熟卵細胞產(chǎn)生核外突是蕨類植物有性生殖過程中較為進化的特征[3]。因此,研究不同蕨類植物卵細胞發(fā)育過程中上述結(jié)構(gòu)的有無和特征差異對于完善蕨類植物分類系統(tǒng)及探究蕨類植物進化方向具有重要意義。

鱗始蕨科(Lindsaeaceae)是蕨類植物的一個特殊類群,在蕨類植物的分類歷史上長期歸屬于骨碎補科(Davalliaceae),在形態(tài)分類上曾作為碗蕨科(Dennstaedtiaceae)的一個亞科,而在分子系統(tǒng)(PPG I)中則被置于水龍骨科(Polyposiaceae)[8]。迄今為止,鱗始蕨科的演化地位仍未確定,亟待研究。

烏蕨〔Odontosoriachinensis(Linn.) J. Sm.〕是鱗始蕨科的代表種[9-10]。包家茜等[11]發(fā)現(xiàn)烏蕨頸卵器的發(fā)育需經(jīng)過原始細胞、初生細胞、中央細胞、卵細胞形成及卵細胞逐漸發(fā)育成熟等過程,其分離腔形成采取由兩側(cè)向中央逐漸擴大的方式,并發(fā)現(xiàn)了受精孔和卵膜,但關于卵膜具體結(jié)構(gòu)、受精孔位置、卵細胞有無核外突以及卵細胞內(nèi)細胞器和物質(zhì)變化等詳細特征均未知,因此,無法確定烏蕨的演化地位。鑒于此,筆者對烏蕨卵細胞發(fā)育過程進行了透射電鏡觀察,以期闡明烏蕨卵細胞發(fā)育的詳細過程及細胞學機制,并對烏蕨與其他蕨類植物的卵細胞發(fā)育特征進行比較,為鱗始蕨科植物的生殖生物學研究提供基礎資料,為鱗始蕨科植物演化地位確定提供有性生殖證據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試烏蕨孢子為黃褐色的成熟孢子,于2012年8月采自湖北省恩施市鳳凰山國家森林公園,并保存在4 ℃冰箱中。憑證標本保存于上海師范大學植物標本館,標本號為2012081501。

1.2 方法

1.2.1 孢子消毒及培養(yǎng) 采用陳倩等[12]的方法處理并培養(yǎng)孢子。具體操作如下:將成熟孢子用體積分數(shù)5%NaClO溶液消毒3 min;用無菌超純水清洗3次,每次3 min;隨后將孢子接種到改良的Knop’s固體培養(yǎng)基(瓊脂質(zhì)量濃度10 g·L-1,pH 7.0)上,并置于ZRX-300E型智能人工氣候培養(yǎng)箱(杭州錢江儀器設備有限公司)中培養(yǎng),培養(yǎng)條件為光照度2 000 lx、光照時間18 h·d-1、晝溫25 ℃、夜溫20 ℃。

1.2.2 卵細胞超微結(jié)構(gòu)觀察 待頸卵器開始發(fā)育(即接種40～50 d),使用SMZ1500解剖鏡(日本Nikon公司)觀察配子體發(fā)育情況。選取不同發(fā)育階段的頸卵器,先用體積分數(shù)3%戊二醛溶液固定6 h,再用濃度0.1 mol·L-1磷酸緩沖液(pH 7.4)沖洗3次,每次30 min;然后,用體積分數(shù)2%鋨酸溶液固定2 h,再用上述磷酸緩沖液沖洗3次,每次20 min;接著,依次用體積分數(shù)50%、70%、90%、100%丙酮溶液脫水10 min;用Spurr’s樹脂進行滲透包埋,于73 ℃聚合9 h以上,得到包埋塊;經(jīng)半薄切片(厚度500 nm)定位,選擇不同發(fā)育階段的卵細胞進行超微結(jié)構(gòu)觀察;超薄切片(厚度70 nm)經(jīng)飽和乙酸鈾溶液染色30 min及飽和檸檬酸鉛染色20 min后,使用Hitachi-600透射電鏡(日本Hitachi公司)觀察和拍照。

2 結(jié)果和分析

2.1 性器官形成

觀察發(fā)現(xiàn),烏蕨孢子在接種后約12 d開始萌發(fā),經(jīng)絲狀體、片狀體階段(共約25 d)長出原葉體(圖版Ⅰ-1),再經(jīng)15 d左右長出精子器和頸卵器,二者長在同一原葉體上且距離較近(圖版Ⅰ-2)。其中,頸卵器通常長在生長點下方,在配子體上呈放射狀分布,幼嫩頸卵器的頸部較長且直立,成熟頸卵器的頸部向基部彎曲;精子器呈圓球形,通常沿著中肋分布。

2.2 卵細胞發(fā)育過程

2.2.1 幼卵時期 烏蕨頸卵器原始細胞經(jīng)多次分裂最終形成1個幼卵細胞、1個腹溝細胞和1個雙核頸溝細胞,且3個細胞緊貼著頸卵器周圍的壁細胞(圖版Ⅰ-3)。隨后,雙核頸溝細胞明顯伸長,胞內(nèi)2個細胞核大、基本為圓形,且距離較近;細胞核周圍質(zhì)體和囊泡豐富,質(zhì)體內(nèi)淀粉粒豐富,并存在片層結(jié)構(gòu);頸溝細胞通過胞間連絲與腹溝細胞相連(圖版Ⅰ-4)。腹溝細胞內(nèi)高爾基體較多,與卵細胞通過發(fā)達的胞間連絲相連,且在胞間連絲附近的線粒體較為發(fā)達(圖版Ⅰ-5)。卵細胞位于頸卵器底部,近橢圓形,細胞核大,核仁明顯;細胞核周圍質(zhì)體和囊泡豐富,囊泡內(nèi)存在嗜鋨性物質(zhì),質(zhì)體內(nèi)含有淀粉粒和片層結(jié)構(gòu),線粒體發(fā)達,卵細胞與周圍壁細胞之間無胞間連絲,僅通過加厚的細胞壁相連(圖版Ⅰ-6)。

2.2.2 發(fā)育卵時期

2.2.2.1 分離腔和孔區(qū)的形成 在發(fā)育卵時期,卵細胞開始略向下凹陷,呈月牙形,且卵細胞與腹溝細胞連接處兩側(cè)的邊緣細胞壁加厚,胞間連絲逐漸消失,開始向下凹陷形成分離腔(圖版Ⅰ-7)。分離腔內(nèi)存在絮狀物,腔下方的卵細胞內(nèi)細胞器豐富,可見大量的線粒體、高爾基體及嗜鋨性囊泡(圖版Ⅰ-8)。隨后,分離腔由兩側(cè)向中間逐漸擴大,內(nèi)部充滿不定形物質(zhì),中央具直徑2～3 μm的孔區(qū),孔區(qū)連接腹溝細胞和卵細胞,分離腔下方聚有囊泡,且孔區(qū)囊泡較多。此時,腹溝細胞出現(xiàn)2個細胞核(圖版Ⅱ-1),頸溝細胞出現(xiàn)4個細胞核且縱向排列(圖版Ⅱ-2)。

隨著分離腔的形成,卵細胞繼續(xù)下陷,細胞核略有凸起和凹陷,細胞器開始發(fā)生改變,但初期變化不明顯,在細胞核上方聚有大量線粒體,且線粒體較大,在分離腔形成位置產(chǎn)生許多小泡。卵細胞下部和兩側(cè)的細胞器(如高爾基體、線粒體等)數(shù)量較多且分布較密集,質(zhì)體內(nèi)仍有淀粉粒存在,但主要分布在細胞核的周圍(圖版Ⅱ-3)。

2.2.2.2 卵膜和受精孔的形成 隨著分離腔從兩側(cè)向中間的凹陷擴大,腔內(nèi)不定形物質(zhì)不斷積累,導致卵細胞上方質(zhì)膜的染色逐漸加深,特別是孔區(qū)的嗜鋨性明顯增強(圖版Ⅱ-4),并在卵細胞表面、分離腔下方產(chǎn)生網(wǎng)狀卵膜,孔區(qū)及分離腔內(nèi)胞間連絲消失,孔區(qū)下方聚有囊泡,還存在部分高爾基體等膜性細胞器。卵膜形成后,分離腔內(nèi)的不定形物質(zhì)開始減少;卵細胞和細胞核變?yōu)橥胄?分離腔上方、腹溝細胞下部加厚的細胞壁開始分解,卵細胞上方的質(zhì)膜釋放出小泡(圖版Ⅱ-5)。卵膜形成時,孔區(qū)無卵膜覆蓋,僅有質(zhì)膜,隨后卵細胞與腹溝細胞在孔區(qū)分離,形成受精孔。受精孔位于卵細胞中間,受精孔正下方有大量囊泡,受精孔附近的卵膜有2～3層囊泡堆疊。卵細胞內(nèi)細胞核上部的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等膜性細胞器增加;有質(zhì)體,但淀粉粒含量減少。腹溝細胞中囊泡數(shù)量增多,仍有部分質(zhì)體存在,腹溝細胞開始退化(圖版Ⅱ-6)。

2.2.3 成熟卵時期 卵細胞成熟時,腹溝細胞與卵細胞在受精孔處完全分離,分離腔內(nèi)的不定形物質(zhì)逐漸消失,且未見到核外突(圖版Ⅱ-7);卵膜為網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),卵膜下方的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體明顯,存在大量高爾基小泡,線粒體發(fā)達,卵膜染色淺且具有大小不一的腔(圖版Ⅱ-8)。卵成熟后,腹溝細胞和頸溝細胞完全退化,內(nèi)部物質(zhì)排出,為精子進入卵細胞完成受精過程提供了通道;卵細胞與周圍壁細胞分離,卵細胞中間凹陷、兩端隆起,上部和邊緣仍有部分囊泡,內(nèi)部細胞器已退化,淀粉粒消失(圖版Ⅱ-9)。

3 討論和結(jié)論

超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果表明:烏蕨卵細胞發(fā)育過程主要包括幼卵、發(fā)育卵和成熟卵3個時期,其中發(fā)育卵過程中分離腔和孔區(qū)的形成、卵膜和受精孔的形成,以及整個卵細胞發(fā)育過程中頸卵器的變化最為重要。

3.1 分離腔和孔區(qū)的形成

在發(fā)育卵時期,卵細胞與腹溝細胞之間形成分離腔,而分離腔的形成是蕨類植物發(fā)育卵階段的一個明顯特征。蕨類植物的分離腔有2種形成模式:一種是較為進化的方式,即隨著卵細胞的發(fā)育,分離腔由卵細胞與腹溝細胞連接的外側(cè)逐漸向中央擴大延伸,腹溝細胞和卵細胞之間起初有一處相連,使兩邊細胞形成漏斗狀,相連的位置即孔區(qū),如水蕨[1-2]、闊鱗瘤蕨〔Phymatosorushainanensis(Noot.) S. G. Lu〕[3]等;另一種是較為原始的方式,即隨著腹溝細胞與卵細胞之間細胞壁的不斷加厚,胞間連絲被阻斷,在卵細胞上方,腹溝細胞與卵細胞的連接處幾乎同時分離,形成分離腔,如紫萁[5]。本研究發(fā)現(xiàn),烏蕨的分離腔是從腹溝細胞和卵細胞連接的邊緣開始向內(nèi)擴展,并在中央連接處形成孔區(qū),胞間連絲在卵細胞發(fā)育近成熟后斷裂,據(jù)此認為烏蕨的分離腔形成方式較為進化。

3.2 卵膜和受精孔的形成

Bell等[13]首次發(fā)現(xiàn)了蕨類植物卵膜的存在,之后的研究發(fā)現(xiàn),蕨類植物的卵膜是由分離腔內(nèi)絮狀不定形物質(zhì)沉積在卵細胞上表面,與嗜鋨性囊泡共同作用形成[3],并且,卵膜位于質(zhì)膜外,主要由脂類物質(zhì)組成[14]。本研究發(fā)現(xiàn),烏蕨在卵細胞發(fā)育過程中形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的卵膜,與系統(tǒng)演化上較為進化的種類闊鱗瘤蕨[3]、栗蕨〔Histiopterisincisa(Thunb.) J. Sm.〕[15]和華東安蕨〔Anisocampiumsheareri(Bak.) Ching〕[16]等的卵膜結(jié)構(gòu)相同。研究發(fā)現(xiàn),水蕨[17]和扇葉鐵線蕨(AdiantumflabellulatumLinn.)[18]等的卵膜是在卵細胞質(zhì)膜內(nèi)附著內(nèi)質(zhì)網(wǎng)而形成的多層結(jié)構(gòu),紫萁[5]沒有卵膜形成,而海金沙[6]在卵細胞發(fā)育過程中僅出現(xiàn)孔區(qū),并未形成卵膜。Cao等[19]認為,卵膜從無到有、從簡單多層結(jié)構(gòu)到復雜網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),對于阻止蕨類植物多精受精、保護卵細胞可能均起到重要作用。因此,從卵膜結(jié)構(gòu)來看,烏蕨表現(xiàn)出進化特性。

受精孔是精子進入卵細胞形成受精卵的重要通道。從受精孔的形成位置看,闊鱗瘤蕨[3]、華東安蕨[16]和扇葉鐵線蕨[18]等受精孔的形成均有腹溝細胞參與,與腹溝細胞相連的孔區(qū)位置并不在分離腔的中心,因而,形成的受精孔位于卵細胞上方偏離中心的位置,致使受精過程中精子對受精孔的直接撞擊可能會減少,從而阻止多精受精[3,15-19]。而金毛狗〔Cibotiumbarometz(Linn.) J. Sm.〕[4]和烏蕨的受精孔則位于卵細胞的中央,在受精孔位置上表現(xiàn)出原始特性。

3.3 頸卵器的發(fā)育

淀粉粒是頸卵器發(fā)育過程中變化最明顯的結(jié)構(gòu)。比較發(fā)現(xiàn),烏蕨頸卵器發(fā)育過程中淀粉粒的變化與紫萁[5]等蕨類植物相同,隨著頸卵器的發(fā)育進程,質(zhì)體逐漸變大,淀粉粒含量也隨之增加[11]。卵細胞發(fā)育成熟后,中間凹陷、兩端隆起,呈現(xiàn)不規(guī)則的杯狀,質(zhì)體內(nèi)的淀粉粒逐漸變小,直至消失。然而,水蕨[1-2]等蕨類植物成熟卵細胞的質(zhì)體內(nèi)仍有淀粉粒存在。由此判斷,烏蕨在頸卵器發(fā)育上表現(xiàn)出原始特征。

Nishida等[20]在比較原始的同型孢子蕨類植物中觀察到含有2個頸溝細胞或2個腹溝細胞的異常頸卵器,而在系統(tǒng)分類上較為進化的真蕨類植物的頸卵器發(fā)育往往只形成1個雙核頸溝細胞和1個腹溝細胞。本研究發(fā)現(xiàn),在烏蕨頸卵器發(fā)育過程中,雖然頸溝細胞和腹溝細胞各只有1個,但會出現(xiàn)腹溝細胞具有2個細胞核、頸溝細胞具有4個細胞核的現(xiàn)象。Cao等在桂皮紫萁(Osmundacinnamomeavar.asiaticaFernald)頸卵器發(fā)育過程中觀察到2個頸溝細胞同時存在[21];在問荊(EquisetumarvenseLinn.)頸卵器發(fā)育過程中也觀察到2個腹溝細胞同時存在的情況,但出現(xiàn)這種情況的幾率較小[22];在地錢(MarchantiapolymorphaLinn.)[23]頸卵器發(fā)育過程中會出現(xiàn)頸溝細胞分裂形成4個頸溝細胞的現(xiàn)象。進一步說明烏蕨在系統(tǒng)演化上表現(xiàn)出原始性。

核外突的產(chǎn)生被認為是性細胞發(fā)生過程中一種核質(zhì)之間的交流[24]。卵細胞發(fā)育成熟時產(chǎn)生核外突是蕨類植物有性生殖中較為進化的特征,如闊鱗瘤蕨[3]和扇葉鐵線蕨[18]等在卵細胞近成熟時會產(chǎn)生囊狀核外突,且蕨類植物的核外突內(nèi)部常具有嗜鋨性物質(zhì)[3,18],華東安蕨的囊狀核外突具有大量褶皺[16]。然而,部分蕨類植物在卵細胞發(fā)育過程中不會產(chǎn)生核外突,如紫萁[5]和烏蕨。由此可見,從核外突上看,烏蕨屬于無核外突類型,在系統(tǒng)演化上較為原始。

3.4 結(jié)論

卵細胞發(fā)育觀察結(jié)果表明:烏蕨的分離腔形成方式為從兩邊向中間擴展,屬于較為進化的分離腔形成方式;烏蕨的卵膜具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),屬于進化特征;烏蕨有受精孔,且受精孔位于卵細胞的中央,受精孔位置較為原始;卵細胞發(fā)育成熟時烏蕨的淀粉粒消失,卵細胞發(fā)育過程中腹溝細胞出現(xiàn)2個細胞核,頸溝細胞出現(xiàn)4個細胞核,且未出現(xiàn)核外突,均表現(xiàn)出原始性。綜上所述,從有性生殖角度看,烏蕨的演化地位較為進化,但有一定的原始性。因此,關于烏蕨的確切演化地位仍需結(jié)合多方面的研究證據(jù)進行全面的研究和探討。

圖版說明 Explanation of Plates

圖版Ⅰ1: 原葉體; 2: 頸卵器和精子器; 3: 頸卵器縱切面; 4: 雙核頸溝細胞; 5: 卵細胞和腹溝細胞間的胞間連絲; 6: 發(fā)育早期的卵細胞; 7: 分離腔形成; 8: 分離腔擴展.

PlateⅠ 1: Prothallus; 2: Archegonium and antheridium; 3: Longitudinal section of archegonium; 4: Neck canal cell with two nuclei; 5: Plasmodesmata between egg and ventral canal cell; 6: Egg at early development stage; 7: Formation of separation cavity; 8: Expansion of separation cavity.

圖版Ⅱ1: 具2個細胞核的腹溝細胞; 2: 具4個細胞核的頸溝細胞; 3: 卵細胞內(nèi)的細胞核和細胞器; 4: 孔區(qū); 5: 質(zhì)膜釋放的小泡狀物(如箭頭所示); 6: 卵膜和受精孔形成; 7: 腹溝細胞和卵細胞分離; 8: 成熟卵的卵膜; 9: 成熟卵.

PlateⅡ 1: Ventral canal cell with two nuclei; 2: Neck canal cell with four nuclei; 3: Nucleus and organelles in egg; 4: Pore region; 5: Small vesicles released by plasma membrane (as shown by the arrows); 6: Formation of egg envelope and fertilization pore; 7: Separation of ventral canal cell and egg; 8: Egg envelope of mature egg; 9: Mature egg.

An: 精子器Antheridium; Ar: 頸卵器Archegonium; E: 卵細胞Egg; VCC: 腹溝細胞Ventral canal cell; NCC: 頸溝細胞Neck canal cell; N: 細胞核Nucleus; P: 質(zhì)體Plastid; Pd: 胞間連絲Plasmodesmata; M: 線粒體Mitochondrion; W: 細胞壁Cell Wall; SC: 分離腔Separation cavity; G: 高爾基體Golgi body; Ve: 囊泡Vesicle; PR: 孔區(qū)Pore region; EE: 卵膜Egg envelope; FP: 受精孔Fertilization pore.

孫 銳, 等: 烏蕨卵細胞發(fā)育的超微結(jié)構(gòu)觀察

圖版Ⅰ

SUN Rui, et al.: Ultrastructural observation on egg development of

Odontosoriachinensis

Plate Ⅰ

圖版說明見文末See the plate explanation at the end of the text

孫 銳, 等: 烏蕨卵細胞發(fā)育的超微結(jié)構(gòu)觀察

圖版Ⅱ

SUN Rui, et al.: Ultrastructural observation on egg development of

Odontosoriachinensis

Plate Ⅱ

圖版說明見文末See the plate explanation at the end of the text