申世凱 曾婷 喬興華 陳力 任杰群 周彥

摘? ? 要：【目的】柑橘衰退病由柑橘衰退病毒（citrus tristeza virus，CTV）引起，是一種世界性的重要柑橘病害。為實(shí)現(xiàn)CTV的田間快速檢測(cè)，建立一種準(zhǔn)確、快速且可視化的檢測(cè)方法?！痉椒ā恳訡TV外殼蛋白（CP）的保守區(qū)域?yàn)榘袠?biāo)，設(shè)計(jì)3對(duì)特異性引物和探針，通過(guò)引物篩選，以及優(yōu)化引物濃度、反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度等條件，建立CTV的反轉(zhuǎn)錄－重組酶聚合酶擴(kuò)增－側(cè)流層析試紙條（RT-RPA-LFD）快速檢測(cè)方法，明確其靈敏度，并用于田間疑似樣品的檢測(cè)?！窘Y(jié)果】建立了CTV的RT-RPA-LFD檢測(cè)方法：最佳檢測(cè)引物為RPA-1F/R，對(duì)應(yīng)探針為RPA-P，最佳反應(yīng)條件為40 ℃，25 min，且與其他5種柑橘病毒無(wú)交叉反應(yīng)。該方法的靈敏度是RT-PCR的100倍，最低可檢測(cè)到2.12×101 拷貝·μL-1的CTV核酸，與RT-qPCR相當(dāng)。采用RT-RPA-LFD法在67份田間樣品中檢測(cè)出CTV陽(yáng)性樣品41份，與RT-PCR法檢測(cè)結(jié)果一致?！窘Y(jié)論】建立的CTV RT-RPA-LFD法具有操作簡(jiǎn)單、快速、結(jié)果可視等優(yōu)點(diǎn)，適合基層植保工作者對(duì)田間樣品開(kāi)展快速檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：柑橘；柑橘衰退病毒；反轉(zhuǎn)錄-重組酶聚合酶擴(kuò)增－側(cè)流層析試紙條；快速檢測(cè)

中圖分類號(hào)：S666 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1009-9980（2023）12-2652-09

收稿日期：2023-07-28 接受日期：2023-10-20

基金項(xiàng)目：財(cái)政部和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-26-05B）

作者簡(jiǎn)介：申世凱，女，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)橹参锊±韺W(xué)。E-mail：1091893469@qq.com

*通信作者 Author for correspondence. E-mail：zybook1@163.com

Establishment and application of RT-RPA-LFD visualization assay for rapid detection of citrus tristeza virus

SHEN Shikai1， ZENG Ting1， QIAO Xinghua2， CHEN Li2， REN Jiequn3， ZHOU Yan1*

（1Southwest University， National Citrus Engineering Research Center， Chongqing 400712， China; 2Plant Protection and Fruit Technology Extension Station of Wanzhou District， Chongqing 400712， China; 3Chongqing Three Gorges Academy of Agricultural Sciences， Chongqing 400712， China）

Abstract： 【Objective】 Tristeza caused by citrus tristeza virus （CTV） is one of the most destructive citrus diseases in the world， which is mainly spread by several aphid species and bud-grafting. Severe CTV isolates could cause quick decline of sour orange rootstock， and stem pitting of susceptible cultivars. In recent years， stunted， severe stem pitting and reduced fruit quality were observed in Newhall navel orange and some tangor cultivars， causing severe economic losses in major citrus-growing provinces of China， especially in Hunan， Jiangxi， Yunnan， Sichuan provinces. Prompt and accurate CTV detection in the nursery and field samples is necessary to control CTV. To date， serological techniques， reverse transcription PCR （RT-PCR）， RT- real-time PCR （RT-qPCR） and other methods have been used to detect CTV. However， these traditional detection techniques are generally flawed. The purpose of this study was to establish a reliable， accurate， convenient and visual reverse transcription-recombinase polymerase amplification （RT-RPA） combined with lateral flow dipstick （LFD） method for CTV detection. 【Methods】 Three pairs of primers and a specific probe used for CTV detection were designed according to the conservative sequence of the coat protein （CP） gene of CTV isolates （NCBI number MH558665.1， MH558666.1， JX266712.1， JQ911664.1 and JQ061137.1） from China. By detecting CTV-infected citrus samples， primers with the best specificity and amplification efficiency were selected to establish the RT-RPA-LFD for CTV detection. The total RNAs were extracted from 100 mg CTV-infected citrus leaf samples using RNAiso Plus and used for CTV detection. The reverse transcription was performed using a C1000 Thermal Cycler in a 20 μL reaction mix containing 1 μL of Oligo dT Primer， 1 μL of 10 μmol·L-1 dNTP Mixture， 1 μL of RNA template， 4 μL of PrimeScript Buffer， 0.5 μL of RNase Inhibitor， and 1 μL of PrimeScript RTase. The reaction was carried out for 45 min at 42 ℃ and 5 min at 95 ℃. RT-RPA-LFD reaction system was optimized with respect to the primer concentration （1， 2.5， 5， 10， 20， and 50 nmol·L-1）， reaction time （5， 10， 15， 20， 25， 30， 35 and 40 min）， and reaction gradient temperature （10， 15， 20， 25， 30， 35， 40， 45 and 50 ℃）. For visual detection， LFD strips from the AmplifyRP × RT Discovery Kit were added to the RT-RPA products. The reactions should be allowed to incubate for no more than 30 min. The two visual bands of the test and control lines suggested that the tested sample was CTV-positive， and only one band on the control line indicated a negative result. The optimized reaction conditions were determined through the colour density of the test line. The specificity of the established RT-RPA-LFD was evaluated by detecting the samples infected with CTV， citrus yellow vein clearing virus （CYVCV）， Citrus tatter leaf virus （CTLV）， citrus exocortis viroid （CEVd）， citrus psorosis virus （CPV）， citrus chlorotic dwarf-associated virus （CCDaV）， and the virus-free citrus plants， respectively. To evaluate the detection range of the optimized RT-RPA-LFD， eight CTV genotypes and eleven CTV isolates from different countries were used. A series of 10-fold dilutions （2.12×106-2.12×10-1 copies·μL-1） of CTV samples were used to test the sensitivity of the RT-RPA-LFD assay， and the sensitivity was compared with the conventional RT-PCR and RT-qPCR. Furthermore， the leaves of 67 CTV-suspected different tangor cultivar samples were randomly collected from Chongqing， Sichuan and Guangxi provinces， and used for RT-PCR and RT-RPA-LFD detection. 【Results】 A RT-RPA-LFD assay for rapid visual detection of CTV was established， with primer pairs RPA-1F （5-CTTGCTGGCGTCCCTTGTTTCTGTTCTTGTCTT-3） and RPA-1R （5-ATTCTGTTTCCTT TCCTAGCCGGGCTTCTTCAC-3）， and RPA-P probe （5-GGCGAAAAATCTTTTCGTCTACT TGGTTTTCACTCGCGAAG GCA-3）. It could specifically amplify the target fragment of CTV with a size of 156 bp. The optimal reaction conditions for the determination of RT-RPA-LFD assay were determined as 10 μmol·L-1 primer concentration， 25 min reaction time and 40 ℃ incubation temperature. This method has high specificity to CTV， and no test line was observed when total nucleic acid extracts from CTLV， CYVCV， CEVd， CPV， CCDaV， or healthy citrus plants were tested. This method could also detect different genotypes and origin of CTV. In the sensitivity detection， 2.12×101 copies·μL-1 was the lowest detection sensitivity of RT-RPA-LFD and RT-qPCR. The limit of detection of RT-PCR was 2.12×103 copies·μL-1， indicating that the RT-RPA-LFD method would be 100 times more sensitive than RT-PCR， which was consistent with that of RT-qPCR. Furthermore， the RT-RPA-LFD detection of CTV required shorter detection time （approximately 30 min） than RT-PCR and RT-qPCR. Among 67 citrus samples randomly collected from the field， CTV was detected from 41 samples using RT-RPA-LFD and RT-PCR assay showed the same results. These results suggested that the RT-RPA-LFD method would be suitable for CTV detection in the field. 【Conclusion】 In this study， a visual RT-RPA-LFD method for CTV detection was developed and the optimal reaction conditions for the RT-RPA-LFD assay were determined. The new RT-RPA-LFD method would be more effective and sensitive for the precise quantification of CTV than RT-PCR. It could be applied to on-site rapid detection for the plant protection and quarantine station.

Key words： Citrus; Citrus tristeza virus （CTV）; Reverse transcription-recombinase polymerase amplification-lateral flow dipstick test strip; Rapid detection

柑橘衰退病是危害柑橘產(chǎn)業(yè)的重要病害之一，其病原為柑橘衰退病毒（citrus tristeza virus，CTV），主要通過(guò)感病接穗、苗木和多種蚜蟲(chóng)進(jìn)行傳播，廣泛分布于世界各柑橘產(chǎn)區(qū)[1]。CTV是長(zhǎng)線性病毒科（Closteroviridae）長(zhǎng)線性病毒屬（Closterovirus）的正義單鏈RNA病毒，基因組全長(zhǎng)19.8 kb，含12個(gè)開(kāi)放閱讀框（ORF），可編碼兩個(gè)外殼蛋白（CP和CPm），其中CP在CTV基因組中高度保守[2]。CTV在田間存在復(fù)雜的株系分化現(xiàn)象，除導(dǎo)致酸橙及其作砧木植株的快速死亡外，還導(dǎo)致葡萄柚、梾檬和部分甜橙、柚類、雜柑等敏感品種的莖陷點(diǎn)癥狀，以及酸橙、尤力克檸檬和葡萄柚實(shí)生苗的矮縮、黃化，CTV弱毒株在植株上不會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的癥狀[3]。根據(jù)CTV的生物學(xué)特性及其基因組變異，CTV被分為T36、VT、T30、T3、RB、T68、HA16-5和S1等多個(gè)基因型，且其基因型的種類還在不斷增加[4-5]。

我國(guó)由于長(zhǎng)期使用枳、香橙、酸柚等抗速衰型衰退病砧木，莖陷點(diǎn)型衰退病是我國(guó)衰退病危害的主要類型[6-7]。近年來(lái)，由于莖陷點(diǎn)型衰退病隨苗木流通，其發(fā)生范圍不斷擴(kuò)大，已在湖南、江西、云南等柑橘主產(chǎn)區(qū)造成了嚴(yán)重的危害[8-10]。目前采用無(wú)毒繁殖材料是防治CTV最有效的手段，而這依賴于高效快速的檢測(cè)方法。

目前常用血清學(xué)[11]、RT-PCR[12]以及RT-qPCR[13-14]等方法檢測(cè)CTV。這些技術(shù)雖然靈敏度高、特異性強(qiáng)，但難以實(shí)現(xiàn)田間現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。因此為滿足果園、苗圃現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的需要，亟待研發(fā)一種準(zhǔn)確、快捷、簡(jiǎn)便的CTV檢測(cè)方法。重組酶聚合酶擴(kuò)增（Recombinase polymerase amplification，RPA）模擬T4噬菌體核酸復(fù)制機(jī)制，在體外實(shí)現(xiàn)恒溫?cái)U(kuò)增[15]。通過(guò)結(jié)合側(cè)流層析試紙條（lateral flow dipstick，LFD），從而實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)結(jié)果的可視化。由于RT-RPA-LFD檢測(cè)技術(shù)具有快速、靈敏和簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，尤其適用于普通工作人員開(kāi)展田間檢測(cè)，目前已成功應(yīng)用于柑橘碎葉病毒（citrus tatter leaf virus，CTLV）、櫻桃病毒A（cherry virus A，CVA）、李矮縮病毒（prune dwarf virus，PDV）、李痘病毒（plum pox virus，PPV）等多種植物病毒的檢測(cè)[16-19]。筆者在本研究中以CTV保守的CP基因?yàn)榘袠?biāo)設(shè)計(jì)特異性引物和探針，建立、優(yōu)化了CTV的RT-RPA-LFD檢測(cè)技術(shù)，為CTV的快速檢測(cè)提供了新的選擇。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

單一感染CTV、柑橘黃脈病毒（citrus yellow vein clearing virus，CYVCV）、柑橘碎葉病毒、柑橘裂皮病類病毒（CEVd）、柑橘鱗皮病毒（citrus psorosis virus，CPV）和柑橘褪綠矮縮病毒（citrus chlorotic dwarf-associated virus，CCDaV）的病株，無(wú)病毒柑橘植株；核酸濃度為2.12×106 拷貝·μL-1的CTV陽(yáng)性樣品。以上材料均為西南大學(xué)柑桔研究所保存提供。

1.2 主要試劑

RPA擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自美國(guó)Agdia公司；PlantGen DNA Kit購(gòu)自中國(guó)康為世紀(jì)；RNAiso Plus試劑盒購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；All-In-One 5× RT MasterMix，2 × Taq Master Mix購(gòu)自諾唯贊公司。

1.3 總核酸提取和cDNA合成

使用PlantGen DNA Kit和RNAiso Plus提取總核酸，并于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩? μL Oligo dT Primer，1 μL dNTP Mixture（10 μmol·L-1），1 μL總RNA模板，7 μL ddH2O混合后，65 ℃ 5 min；冰上冷卻后加入4 μL PrimeScript Buffer，0.5 μL RNase Inhibitor（40 U·μL-1），1 μL PrimeScript RTase（200 U·μL-1，TaKaRa），加ddH2O至總體積為20 μL。42 ℃ 45 min，95 ℃ 5 min。

1.4 RT-RPA-LFD的引物和探針設(shè)計(jì)

比對(duì)分析NCBI中已報(bào)道的5個(gè)中國(guó)莖陷點(diǎn)型CTV CP基因序列（GenBank：MH558665.1、MH558666.1、JX266712.1、JQ911664.1和JQ061137.1），以及Amplify Discovery Kits中引物和探針設(shè)計(jì)要求，使用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)特異性引物和探針（表1），所用引物和探針均由北京擎科生物技術(shù)有限公司合成。

1.5 RT-RPA-LFD反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化

使用AmplifyRP × RT Discovery Kit進(jìn)行RPA擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)體系包括5.9 μL Rehydration Buffer，0.42 μL RPA-F/R（設(shè)6個(gè)濃度梯度：1.0、2.5、5.0、10.0、20.0、50.0 μmol·L-1）、10 μmol·L-1 RPA-P 0.12 μL、1 μL cDNA、1.64 μL ddH2O。反應(yīng)液與固體反應(yīng)物混勻后加入0.5 μL 280 mmol·L-1 MgOAc進(jìn)行孵育（分別設(shè)置8個(gè)反應(yīng)時(shí)間5、10、15、20、25、30、35、40 min和9個(gè)溫度梯度10、15、20、25、30、35、40、45、50 ℃）。孵育結(jié)束后，放入試紙條，室溫放置10～20 min后觀察結(jié)果。以質(zhì)控線（Control line）和測(cè)試線（Test line）顯示清晰，判斷結(jié)果為陽(yáng)性；質(zhì)控線顯示清晰，測(cè)試線無(wú)條帶時(shí)，結(jié)果為陰性；質(zhì)控線未出現(xiàn)條帶時(shí)，結(jié)果無(wú)效。

1.6 特異性分析

以單一感染CTV、CYVCV、CTLV、CEVd、CPV和CCDaV陽(yáng)性樣品，以及無(wú)病毒柑橘樣品的核酸為模板，使用建立的RT-RPA-LFD體系進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)價(jià)其特異性。此外，為了驗(yàn)證該方法是否可檢測(cè)不同基因型或來(lái)源的CTV毒株，按上述方法對(duì)T36、T30、VT、T3（由美國(guó)佛羅里達(dá)大學(xué)柑橘研究與教育中心William Dawson教授贈(zèng)送）、S1、RB、L1、M1基因型毒株，以及來(lái)自澳大利亞的PB61，PB135（由巴西Centrode Citricultrua Sylvio Moreira 研究所Marcos A Machado博士贈(zèng)送），來(lái)自巴西的PerIAC（由澳大利亞EMAI實(shí)驗(yàn)室Patricia Barkley研究員贈(zèng)送），來(lái)自巴基斯坦的CT-Pak1，以及來(lái)自中國(guó)不同產(chǎn)區(qū)的CT3、CT9、CT14、CT15、CT30、CT31和CT68毒株（表2）進(jìn)行檢測(cè)。

1.7 RT-RPA-LFD檢測(cè)靈敏性分析

將CTV陽(yáng)性樣品RNA按10倍梯度稀釋得到2.12×10-1～2.12×106拷貝·μL-1稀釋液作為模板，按照所建立的RT-RPA-LFD，以及Gillings等[12]和Yokomi等[13]的方法進(jìn)行RT-PCR和RT-qPCR平行檢測(cè)，比較3種方法的靈敏度。15 μL PCR反應(yīng)體系：cDNA模板1.0 μL，PrimeScript I step Enzyme Mix 0.5 μL，2×I Step Buffer 7.5 μL，CP1/CP3（10 μmol·L-1）0.3 μL。反應(yīng)程序：45 ℃ 30 s；95 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，36個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。25 μL RT-qPCR反應(yīng)體系：2 × RT-PCR reaction mix for probe 12.5 μL，P25-F/P25-R（10 μmol·L-1）0.5 μL，CTV-CY5（10 μmol·L-1） 0.2 μL，RNA模板2 μL，iScript reverse transcriptase for one-step RT-PCR 0.5 μL。反應(yīng)程序：55 ℃，2 min；95 ℃，5 min；95 ℃ 15 s，59 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。引物序列見(jiàn)1.4。

1.8 田間樣品檢測(cè)

將67份田間樣品按照1.3的方法提取總核酸后，分別采取RT-PCR和優(yōu)化后的RT-RPA-LFD反應(yīng)體系進(jìn)行檢測(cè)，比較檢測(cè)效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選

以CTV陽(yáng)性樣品的總核酸為模板，分別使用設(shè)計(jì)的3對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果顯示，RPA-1F/R擴(kuò)增條帶單一、明亮。所擴(kuò)增產(chǎn)物與CTV毒株CT11A（JQ911664.1）相應(yīng)序列的相似性為100%。引物RPA-2F/R無(wú)擴(kuò)增條帶、RPA-3F/R存在非特異性擴(kuò)增（圖1）。

2.2 RT-RPA-LFD引物濃度優(yōu)化

當(dāng)引物濃度為1～10 μmol·L-1時(shí)，測(cè)試線的顏色隨引物濃度的增加逐漸變深。當(dāng)引物濃度高于10 μmol·L-1時(shí)，測(cè)試線無(wú)明顯變化（圖2）。因此選擇10 μmol·L-1作為RT-RPA-LFD反應(yīng)最適的引物濃度。

2.3 反應(yīng)時(shí)間及溫度優(yōu)化

檢測(cè)結(jié)果表明，在推薦溫度37 ℃下反應(yīng)超過(guò)20 min后，試紙條均出現(xiàn)清晰的測(cè)試線，且反應(yīng)超過(guò)25 min后，測(cè)試線顏色不再加深（圖3-A）。反應(yīng)時(shí)間為25 min，反應(yīng)溫度10～40 ℃時(shí)，測(cè)試線顏色逐漸加深；40～45 ℃時(shí)其顏色無(wú)明顯變化，溫度高于50 ℃時(shí)，測(cè)試線不清晰（圖3-B）。綜上，確定引物濃度10 μmol·L-1，反應(yīng)時(shí)間25 min，反應(yīng)溫度40 ℃為最佳反應(yīng)條件。

2.4 RT-RT-RPA-LFD特異性檢測(cè)

利用優(yōu)化后的反應(yīng)體系檢測(cè)分別感染了CTV、CYVCV、CTLV、CEV、CPV、CCDaV的樣品，以及無(wú)病毒柑橘樣品。結(jié)果顯示，僅感染CTV樣品的檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性，其余樣品的檢測(cè)結(jié)果均為陰性，且能檢測(cè)出來(lái)自不同國(guó)家的19個(gè)CTV毒株。表明該反應(yīng)體系與其他主要柑橘病毒無(wú)交叉反應(yīng)，特異性強(qiáng)，且適用于對(duì)不同基因型或來(lái)源CTV毒株的檢測(cè)。

2.5 RT-RPA-LFD靈敏性檢測(cè)

將已知濃度的CTV陽(yáng)性樣品按10倍梯度稀釋得到2.12×10-1～2.12×106拷貝·μL-1的稀釋液作為模板，進(jìn)行RT-PCR、RT-qPCR和RT-RPA-LFD檢測(cè)（圖4）。結(jié)果表明，RT-qPCR和RT-RPA-LFD均能檢測(cè)出2.12×101拷貝·μL-1稀釋液中的CTV，而RT-PCR僅檢測(cè)出2.12×103拷貝·μL-1稀釋液中的CTV。以上結(jié)果表明RT-RPA-LFD檢測(cè)法與RT-qPCR相當(dāng)，且比RT-PCR的靈敏度提高了100倍。

2.6 RT-RPA-LFD田間樣品檢測(cè)

田間樣品的檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)隨機(jī)選取的67份田間樣品進(jìn)行RT-PCR和RT-RPA-LFD檢測(cè)，其結(jié)果一致，均能從沃柑、紅美人、W·默科特等雜柑品種中檢測(cè)出41份CTV陽(yáng)性樣品，檢出率為61.19%，經(jīng)進(jìn)一步驗(yàn)證，其中包括T36、T30、VT、T3、T68、RB等多種基因型毒株，表明建立的RT-RPA-LFD檢測(cè)方法穩(wěn)定可靠（表3，圖5）。

3 討 論

近年來(lái)，隨著我國(guó)柑橘產(chǎn)業(yè)的迅猛發(fā)展，柑橘衰退病隨苗木和蚜蟲(chóng)傳播的速度加快，造成其在我國(guó)的發(fā)生區(qū)域不斷擴(kuò)大，損失加劇[8-10]。因此準(zhǔn)確、靈敏、便捷的病害檢測(cè)技術(shù)對(duì)于監(jiān)測(cè)和防治柑橘衰退病具有重要意義。目前，CTV檢測(cè)中常用的血清學(xué)方法在檢測(cè)柚類等柑橘類型時(shí)檢出率較低[20]，且基于RT-PCR的檢測(cè)方法往往依賴于多種特殊儀器設(shè)備，檢測(cè)過(guò)程復(fù)雜，專業(yè)性強(qiáng)。此外，雖然環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）靈敏度高，且操作較為簡(jiǎn)便，但其引物設(shè)計(jì)復(fù)雜，且容易出現(xiàn)假陽(yáng)性[21]。

筆者在本研究中根據(jù)CTV CP基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物和探針，并通過(guò)優(yōu)化引物濃度、反應(yīng)溫度和時(shí)間，建立、優(yōu)化了CTV的RT-RPA-LFD檢測(cè)方法，其操作簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)。與常規(guī)RT-PCR法相比，靈敏度提高了100倍，與RT-qPCR法相當(dāng)。在檢測(cè)田間樣品時(shí)，RT-RPA-LFD檢測(cè)方法與常規(guī)RT-PCR法的檢測(cè)結(jié)果相同，反應(yīng)時(shí)間縮短了1 h，且不需要PCR儀、凝膠成像儀等復(fù)雜儀器。由于檢測(cè)通過(guò)試紙條呈現(xiàn)，因此更加直觀、簡(jiǎn)捷，可以快速準(zhǔn)確地檢測(cè)田間樣品，有助于及時(shí)清除病株，從而最大限度地降低CTV傳播擴(kuò)散的風(fēng)險(xiǎn)。此外，因?yàn)镽T-RPA-LFD反應(yīng)在單一管中進(jìn)行，部分反應(yīng)組分以凍干粉的形式保存，使得檢測(cè)過(guò)程不易發(fā)生污染。筆者在本研究中針對(duì)目前我國(guó)柑橘產(chǎn)業(yè)中較被追捧的多個(gè)雜柑品種進(jìn)行檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)，沃柑、紅美人、W·默科特等品種中CTV的檢出率較高，因此今后在引種上述品種時(shí)需要加大CTV的檢測(cè)力度。雖然Crannell等[22]的報(bào)道僅靠體溫就能完成RT-RPA-LFD反應(yīng)，但在本研究中其反應(yīng)仍受溫度限制，今后可進(jìn)一步優(yōu)化反應(yīng)體系，降低反應(yīng)溫度，實(shí)現(xiàn)在常溫下進(jìn)行檢測(cè)。

4 結(jié) 論

CTV RT-RPA-LFD法特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便、靈敏度高，適用于低濃度樣品檢測(cè)，且部分反應(yīng)組分以凍干粉的形式保存，不易發(fā)生污染。此外，該檢測(cè)方法較RT-PCR法反應(yīng)時(shí)間縮短了1 h，且不需要PCR儀、凝膠成像儀等復(fù)雜儀器，因此尤其適用于基層植保人員開(kāi)展田間大規(guī)模CTV檢測(cè)。

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