趙宗偉，馬啟祿，王鶴童，李翠萍

1.濮陽(yáng)縣子岸鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)服務(wù)中心，河南濮陽(yáng) 457100；2.安陽(yáng)市殷都區(qū)畜牧服務(wù)中心，河南安陽(yáng) 455000；3.平輿縣農(nóng)業(yè)綜合行政執(zhí)法大隊(duì)，河南平輿 463400；4.商丘市動(dòng)物檢疫和疫病預(yù)防控制中心，河南商丘 476000）

水禽細(xì)小病毒病是一種急性、高傳染性疾病，可引起雛鵝和番鴨較高的發(fā)病率和病死率，給水禽養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。根據(jù)遺傳特征、中和試驗(yàn)結(jié)果和宿主范圍可將水禽細(xì)小病毒分為鵝細(xì)小病毒（goose parvovirus，GPV）相關(guān)類(lèi)群和番鴨細(xì)小病毒（muscovy duck parvovirus，MDPV）相關(guān)類(lèi)群[1-2]。近年來(lái)，一種新型鵝細(xì)小病毒（novel goose parvovirus，NGPV）被報(bào)道，已有的研究證明該病毒為GPV的衍生株[3]。MDPV僅感染番鴨，可導(dǎo)致3周齡以下番鴨出現(xiàn)心包積液、肝臟病變、胰腺壞死等組織病理學(xué)變化[4-5]，臨床表現(xiàn)為發(fā)育遲緩，足虛弱、氣喘、腹瀉和死亡[6-7]。MDPV在器官中可以多階段復(fù)制[7-10]。盡管疫苗接種能夠降低MDPV感染風(fēng)險(xiǎn)，但這種急性傳染病仍然對(duì)水禽產(chǎn)業(yè)的發(fā)展構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。本文從MDPV感染的病原學(xué)、流行病學(xué)、診斷技術(shù)和綜合防控等方面進(jìn)行了闡述，以期為從業(yè)者學(xué)習(xí)和了解該病毒提供較為系統(tǒng)的內(nèi)容，也為番鴨細(xì)小病毒病防控提供參考資料。

1 病原學(xué)

MDPV屬于細(xì)小病毒亞科依賴(lài)病毒屬，是一種無(wú)囊膜、單鏈DNA病毒，病毒粒子為球形，呈正二十面體對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)，直徑為20～25 nm。MDPV基因組全長(zhǎng)約5.1 kb，包括2個(gè)開(kāi)放閱讀框（open reading frame，ORF）。左側(cè)ORF編碼的2個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1和NS2）主要參與病毒復(fù)制和調(diào)節(jié)，又稱(chēng)為調(diào)節(jié)蛋白（regulatory protein，REP）；右側(cè)ORF編碼的3個(gè)衣殼蛋白（VP1、VP2和VP3）是細(xì)小病毒嗜性、致病性和宿主范圍的重要決定因素[11]。VP1、VP2和VP3在3'端具有相同的基因序列和終止密碼子，但其起始密碼子位于序列的不同位置。VP3是MDPV主要的衣殼蛋白和保護(hù)性抗原，其含有的抗原表位能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，并對(duì)其他水禽細(xì)小病毒提供保護(hù)性的交叉免疫。此外，在MDPV基因組的兩端還存在著約456 bp的倒置末端重復(fù)序列（inverted terminal repeat，ITR）、1個(gè)末端解析位點(diǎn)（terminal resolution site，TRS）、Rep蛋白結(jié)合位點(diǎn)（rep binding elements，RBSs）和其他轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)等，均與基因復(fù)制和轉(zhuǎn)錄等密切相關(guān)。ITR外部可以自行折疊形成回文發(fā)卡結(jié)構(gòu)，而其內(nèi)部則與3'ITR的序列反向互補(bǔ)，使整個(gè)病毒基因組形成更大范圍的回文結(jié)構(gòu)[12-13]。

重組和變異在細(xì)小病毒快速進(jìn)化中起著重要作用。研究者在我國(guó)多個(gè)省份的鴨群中分離到一種新的重組MDPV（rMDPV），該病毒感染的小鴨腸道發(fā)生栓塞，死亡率高。分析結(jié)果顯示，該病毒由經(jīng)典MDPV與經(jīng)典GPVs交換了部分VP3基因序列后重組而來(lái)[14-15]。與GPV相比，rMDPV ITRs與經(jīng)典MDPV具有更高的同源性，其Rep蛋白也與經(jīng)典MDPV同源性很高。rMDPV ITRs和Rep蛋白之間的相互作用不受重組影響[16]。

2 流行病學(xué)

番鴨細(xì)小病毒病最早由我國(guó)發(fā)現(xiàn)，隨后法國(guó)和日本等國(guó)家也陸續(xù)報(bào)道該病[6，17-19]。我國(guó)臺(tái)灣地區(qū)發(fā)生了2起水禽細(xì)小病毒感染事件[20]。第1次疫情與GPV相關(guān)，影響了鵝和番鴨；第2次疫情與MDPV相關(guān)，該次疫情中許多品種的鴨受影響，但鵝幸免于難。1997—1998年，美國(guó)加利福尼亞州商品番鴨出現(xiàn)身體虛弱，無(wú)法行走且死亡率高的情況，剖檢發(fā)現(xiàn)患病鴨腿部肌肉和心肌蒼白，肝臟有纖維蛋白滲出物，經(jīng)鑒定證實(shí)病原為MDPV[6]。2011年我國(guó)在廣西商品番鴨中檢測(cè)到MDPV，患病鴨主要臨床表現(xiàn)為水樣腹瀉和運(yùn)動(dòng)功能障礙[21]。MDPV只感染番鴨，在雞、鵝、麻鴨、半番鴨和櫻桃谷鴨等中暫無(wú)臨床發(fā)病的報(bào)道，且人工感染不發(fā)病[15，22]。MDPV對(duì)鵝沒(méi)有致病性，而GPV不僅對(duì)雛鵝具有致病性，而且對(duì)番小鴨也具有致病性[7，19]。番鴨細(xì)小病毒病的流行無(wú)明顯季節(jié)性，但由于冬春季節(jié)氣溫較低，育雛室因控溫導(dǎo)致空氣流通不夠，空氣質(zhì)量較差，從而導(dǎo)致該病的發(fā)病率和病死率相對(duì)更高。MDPV主要通過(guò)呼吸道和消化道傳播，如可通過(guò)患病鴨的排泄物再經(jīng)飼料、飲水及飼養(yǎng)設(shè)施進(jìn)行傳播[23]，還可污染種蛋及孵化室，造成雛鴨批量發(fā)病。

MDPV感染的潛伏期通常為4～9 d，病程為2～7 d。根據(jù)感染雛鴨的日齡不同，MDPV感染的死亡率也存在一定差異，死亡率最高可達(dá)80%。雖然3周齡后鴨子感染的死亡率要低得多，但感染治愈后會(huì)出現(xiàn)骨骼肌退化和生長(zhǎng)遲緩的癥狀，且生產(chǎn)性能降低，不再具備經(jīng)濟(jì)價(jià)值。發(fā)病鴨通常表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)功能障礙、生長(zhǎng)發(fā)育遲緩、水樣腹瀉和死亡。剖檢可見(jiàn)患病鴨心臟呈圓形，心臟壁松弛，肝臟腫脹脆弱，胰腺內(nèi)有白色壞死斑點(diǎn)，腸黏膜有炎癥、出血，腸內(nèi)容物中有脫落的腸黏膜，部分還可見(jiàn)身體骨骼肌質(zhì)量減少和腿部骨骼肌蒼白[24-25]。

3 診斷技術(shù)

3.1 病毒分離培養(yǎng)

病毒分離培養(yǎng)是一種常用的診斷技術(shù)，在病毒性疾病防控中起著重要作用。將MDPV感染病料經(jīng)尿囊腔接種10日齡番鴨胚，培養(yǎng)5 d，盲傳5代，可發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組番鴨胚死亡且較對(duì)照組鴨胚小，絨毛尿囊膜增厚，胚胎充血并出現(xiàn)溶血現(xiàn)象[23]。MDPV還可以在番鴨胚腎（MDEK）和番鴨胚成纖維細(xì)胞（MDEF）中增殖。Poonia等[26]將病料組織勻漿液接種番鴨胚后的尿囊液在MDEF中連續(xù)傳代6次后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞出現(xiàn)病變，隨后利用透射電子顯微鏡和PCR方法證明MDPV被成功分離。黃瑜[27]將番鴨胚傳代的MDPV接種到原代鴨胚成纖維細(xì)胞（DEF）中，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞狀態(tài)變差，出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變（變細(xì)、變長(zhǎng)），利用免疫熒光試驗(yàn)（IFA）可檢測(cè)到免疫熒光信號(hào)。目前SPF級(jí)別的番鴨胚獲取難度較大，病毒分離容易受母源抗體干擾。然而MDPV接種細(xì)胞后需要適應(yīng)細(xì)胞環(huán)境，傳代次數(shù)較多，因此番鴨胚依然是進(jìn)行MDPV分離的首要選擇。

3.2 血清學(xué)診斷

血清學(xué)診斷主要是利用抗原、抗體在體內(nèi)或體外發(fā)生的特異性結(jié)合反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)檢測(cè)目的的方法。目前，針對(duì)MDPV常用的血清學(xué)診斷方法有免疫熒光IFA、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）以及瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)（AGP）等。

3.2.1 IFA IFA最早于1942年被首次報(bào)道，并在1950年被完善，借助熒光顯微鏡，可以觀察到組織或者細(xì)胞的特異性免疫反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)特定抗原的定位和定性分析[28]。IFA特異性強(qiáng)、敏感性高，已被廣泛應(yīng)用于科學(xué)研究和臨床診斷。Le Gall-Reculé等[29]利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)克隆了MDPV衣殼蛋白VP2和VP3的編碼基因，使其在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)，并通過(guò)IFA技術(shù)在昆蟲(chóng)細(xì)胞的細(xì)胞核中發(fā)現(xiàn)了重組蛋白。Yin等[30]借助IFA技術(shù)測(cè)定并評(píng)估了單克隆抗體對(duì)GPV和MDPV VP3蛋白天然結(jié)構(gòu)的識(shí)別情況，不僅發(fā)現(xiàn)單克隆抗體與VP3蛋白發(fā)生了結(jié)合，還確認(rèn)該蛋白主要存在于細(xì)胞核中，很少在感染細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。Woolcock等[6]從1～4周齡商品番鴨中分離到MDPV，并利用IFA對(duì)其抗體進(jìn)行了檢測(cè)。

3.2.2 ELISA ELISA方法是最早由瑞典科學(xué)家Engvall和Perlmann[31]以及荷蘭科學(xué)家Schuurs和Van Weemen[32]構(gòu)思出來(lái)的一種免疫酶技術(shù)，它取代了原有的放射免疫檢測(cè)，降低了放射免疫檢測(cè)中放射性標(biāo)記抗原或抗體帶來(lái)的危害。目前ELISA方法已經(jīng)在MDPV抗體檢測(cè)中得到較為廣泛的應(yīng)用。

3.2.3 AGP AGP方法中，可溶性抗原與相應(yīng)抗體（抗血清）在瓊脂凝膠中向四周擴(kuò)散，如果抗原和抗體相對(duì)應(yīng)，則會(huì)在適當(dāng)比例處形成肉眼可見(jiàn)的白色沉淀線，從而用于抗原或抗體的定性檢測(cè)[33]。何海蓉等[34]將MDPV M91毒株接種鵝胚，收獲鵝胚尿囊液濃縮后制備了AGP抗原，與抗MDPV免疫血清組合建立了AGP方法。該方法可用于MDPV疫苗的免疫檢測(cè)，但它與GPV存在交叉反應(yīng)，特異性效果不理想。

3.3 分子生物學(xué)診斷

3.3.1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR） PCR是一種功能強(qiáng)大的擴(kuò)增技術(shù)，可以從少量起始材料（即DNA模板或目標(biāo)序列）中生成充足的特定DNA片段，已成為病毒檢測(cè)和分型不可缺少的工具。Wan等[35]建立了可以實(shí)現(xiàn)MDPV和GPV鑒別診斷的雙重PCR方法，最低檢測(cè)限可達(dá)103copies/μL。饒?bào)w宇等[36]建立了針對(duì)鴨瘟病毒、GPV和MDPV的三重PCR檢測(cè)方法，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)3種病原的鑒別診斷，最低檢測(cè)限分別為237.30、22.45和204.60 pg。

3.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR） qPCR是在傳統(tǒng)PCR的基礎(chǔ)上引入熒光探針，在提高檢測(cè)特異性和靈敏度的同時(shí)，實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)結(jié)果的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，已被廣泛用于病毒發(fā)病機(jī)制研究和流行病學(xué)監(jiān)測(cè)。謝麗基等[37]參考GenBank中MDPVREP基因序列，設(shè)計(jì)了特異性引物及探針，建立了檢測(cè)MDPV的qPCR方法，擴(kuò)增時(shí)間僅需30 min，敏感性可達(dá)20 copies/μL，較常規(guī)PCR敏感100倍。在此基礎(chǔ)上，謝麗基等[38]又建立了可以同時(shí)檢測(cè)鴨I型肝炎病毒和MDPV的雙重qPCR方法。吳雙等[39]建立了鴨坦布蘇病毒（DTMUV）、鴨腸炎病毒（DEV）和MDPV的TaqMan三重qPCR診斷方法，可以檢測(cè)到101copies/μL的MDPV陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒。林甦等[40]基于SYBR Green I方法，建立了一種可以同時(shí)檢測(cè)GPV和MDPV的qPCR方法，能夠?qū)崿F(xiàn)兩種疾病的鑒別診斷。謝守玉等[41]建立了GPV、MDPV和鴨圓環(huán)病毒的多重TaqMan qPCR方法，對(duì)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)限可達(dá)7.5×101copies/μL。

3.3.3 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）技術(shù) LAMP是一種可以在恒溫條件下實(shí)現(xiàn)核酸快速擴(kuò)增的技術(shù)。該技術(shù)靈敏性、特異性均較好，操作簡(jiǎn)單，避免了傳統(tǒng)PCR方法溫度循環(huán)的種種不便，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于病原微生物和傳染病診斷等多個(gè)領(lǐng)域。Ji等[42]針對(duì)MDPVVP3基因的6個(gè)特異性靶基因片段設(shè)計(jì)了引物，建立了LAMP檢測(cè)方法，可用于MDPV與其他鴨源病原，特別是GPV的鑒別診斷，其靈敏性較PCR方法提高了10倍。該方法對(duì)儀器要求較低，適用于沒(méi)有精確溫度控制器以及電泳和凝膠成像設(shè)備的現(xiàn)場(chǎng)或小規(guī)模實(shí)驗(yàn)室。

3.3.4 重組酶介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（RAA） RAA是近年來(lái)新開(kāi)發(fā)的恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)。在恒溫條件下（37～42 ℃），重組酶、引物和單鏈結(jié)合蛋白形成復(fù)合物，當(dāng)引物搜索到配對(duì)的DNA模板時(shí)，在DNA聚合酶的作用下合成新DNA鏈，僅需30 min即可完成對(duì)目的片段的快速擴(kuò)增[43]。黃俊霖[44]針對(duì)MDPVVP1基因保守區(qū)域序列設(shè)計(jì)特異性引物，建立了基礎(chǔ)型RAA檢測(cè)方法，該方法特異性較好，靈敏度與PCR一致，耗時(shí)短、操作簡(jiǎn)便，但較易造成氣溶膠污染，可能出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。

3.3.5 斑點(diǎn)雜交 斑點(diǎn)雜交是將待測(cè)DNA變性后點(diǎn)加在硝酸纖維素膜或尼龍膜上，經(jīng)標(biāo)記的探針雜交后，通過(guò)顯影斑點(diǎn)的有無(wú)以及深淺判斷結(jié)果的檢測(cè)方法。該方法操作簡(jiǎn)單，結(jié)果無(wú)需電泳或者轉(zhuǎn)印，可以直接在膜上顯示結(jié)果，是目前常用的分子生物學(xué)診斷技術(shù)。Le等[3]將使用與堿性磷酸酶綴合的抗地高辛抗體Fab片段，通過(guò)免疫酶反應(yīng)檢測(cè)雜交的MDPV DNA探針，并通過(guò)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)觀察結(jié)果。該方法特異性及靈敏性均較好，最低檢測(cè)限可達(dá)3 fg。

4 疫苗

目前針對(duì)MDPV感染主要以疫苗預(yù)防為主，MDPV疫苗主要分為弱毒疫苗和滅活疫苗。其中，弱毒疫苗在使用過(guò)程中可能會(huì)出現(xiàn)毒力增強(qiáng)的現(xiàn)象，相比之下滅活疫苗或基因工程疫苗安全性更高。做好現(xiàn)有疫苗的優(yōu)化和新型疫苗的研發(fā)工作對(duì)于該病的防控尤為重要。陳少鶯等[45]將能使MDEF產(chǎn)生病變的GPV疫苗株和MDPV疫苗株按適當(dāng)比例混合，制成了MDPV-GPV二聯(lián)弱毒疫苗，有效免疫期超過(guò)60 d，可以實(shí)現(xiàn)較好的免疫保護(hù)。程曉霞等[46]以MDPV弱毒株（MPV-P1株）和番鴨源GPV弱毒株（MDGPV-D株）為種毒，制備了MPV-GPV二聯(lián)活疫苗，可誘導(dǎo)雛番鴨產(chǎn)生良好的免疫應(yīng)答，并在免疫后7 d能抵御強(qiáng)毒株攻擊。董嘉文等[47]將VP3基因和免疫刺激基序（CpG）克隆至真核表達(dá)質(zhì)粒pIRES-d IL2中，構(gòu)建了MDPV疫苗質(zhì)粒，并成功在BHK-21細(xì)胞中表達(dá)，為MDPV核酸疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。

5 綜合防控

針對(duì)番鴨細(xì)小病毒病的防控，一是注重養(yǎng)殖場(chǎng)的生物安全防控體系建設(shè)。孵化、育雛、育成等各個(gè)區(qū)域需保持一定安全距離。引進(jìn)種群需了解其健康狀況和疫苗免疫情況，并提前調(diào)查了解來(lái)源地鴨病的流行狀況。新入鴨群需隔離飼養(yǎng)，可對(duì)常見(jiàn)病進(jìn)行抽檢，保證健康后可集中進(jìn)行飼養(yǎng)或混養(yǎng)。二是保證環(huán)境衛(wèi)生，提高飼養(yǎng)管理水平。養(yǎng)殖場(chǎng)應(yīng)保證圈舍及周?chē)h(huán)境的衛(wèi)生，做好定期消毒。需對(duì)人員和車(chē)輛出入進(jìn)行嚴(yán)格把控，在大門(mén)口和養(yǎng)殖的不同區(qū)域設(shè)置相應(yīng)消毒區(qū)，嚴(yán)格禁止閑雜人員進(jìn)入養(yǎng)殖場(chǎng)。提高飼養(yǎng)管理水平，保證營(yíng)養(yǎng)供給全面，避免出現(xiàn)飼料霉變和蟲(chóng)鼠污染等情況。三是重視野鳥(niǎo)在疫病傳播中的作用。我國(guó)存在3條野鳥(niǎo)遷徙路線，野鳥(niǎo)在家禽疫病的傳播和流行中發(fā)揮著重要作用。姚雨欣[48]在大雁、白鷺、鶴類(lèi)和雀類(lèi)的腸道中均檢測(cè)到細(xì)小病毒科病毒，這提示要做好場(chǎng)舍的密閉式管理，減少養(yǎng)殖動(dòng)物與野生鳥(niǎo)類(lèi)接觸的機(jī)會(huì)。四是做好洗消工作。應(yīng)特別注意孵化環(huán)節(jié)，尤其是冬春季節(jié)，在利用生石灰和雙氧水分別進(jìn)行地面和環(huán)境及部分儀器消毒的同時(shí)，應(yīng)注意環(huán)境通風(fēng)，保證空氣新鮮。五是做好疫病監(jiān)測(cè)，推進(jìn)疫病凈化工作。在做好免疫的同時(shí)，定期進(jìn)行病毒檢測(cè)，尤其是祖代種群，應(yīng)淘汰病原陽(yáng)性個(gè)體，實(shí)現(xiàn)病原凈化。