宋芳芳，劉春菊，任煒杰，遲田英，王志亮

（中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，山東青島 266032）

非洲豬瘟（ASF）是由非洲豬瘟病毒（ASFV）引起的一種烈性傳染病，是世界動物衛(wèi)生組織公布的法定報告動物疫病之一，是我國的一類動物疫病。世界動物衛(wèi)生組織ASF形勢報告顯示，2020年前ASF就已在全球32個國家流行，感染超100萬頭家豬和超2.8萬頭野豬，給全球生豬產(chǎn)業(yè)帶來了嚴重影響[1-3]。

ASFV為雙鏈DNA病毒，作為非洲豬瘟病毒科（Asfarviridae）家族的唯一成員，有超過150個編碼區(qū)，大小從170 kb到190 kb不等[4]。病毒粒子直徑約為250 nm，由中心類核、內(nèi)脂蛋白膜、二十面體蛋白外衣殼和外脂蛋白包膜組成[5]。ASFV在細胞內(nèi)外均具有傳染性，且在環(huán)境中具有很強的生存能力[6]。作為目前全球生豬產(chǎn)業(yè)發(fā)展最為嚴重的威脅之一[1-2]，ASF至今仍無有效治療手段，也沒有可提供廣泛交叉免疫反應的疫苗，因此開發(fā)一種有效的ASFV疫苗迫在眉睫。

ASFV疫苗可分為減毒活疫苗、滅活疫苗、病毒載體疫苗、哺乳動物表達質(zhì)?；驇追N疫苗的組合。病毒載體疫苗是指將致病微生物的免疫保護性基因插入到載體病毒的非必須區(qū)構建重組病毒，經(jīng)培養(yǎng)后制備的疫苗[3]。病毒載體疫苗能穩(wěn)定誘導抗原特異性的體液免疫和細胞免疫反應，可作為ASF防控技術研發(fā)的重點方向。本文綜述了基于不同病毒載體的ASFV疫苗研究進展，以期為推進ASF病毒載體疫苗研究及進一步研發(fā)具有高度保護潛力的ASFV疫苗提供參考。

1 病毒載體疫苗概述

病毒載體疫苗（Viral vector vaccines）是由Jackson等[7]提出的一種利用基因編輯后沒有毒性的病毒作為載體，遞送免疫原的新型疫苗開發(fā)技術。優(yōu)化后的病毒載體可提高基因組的包裝能力和復制能力，同時增強病毒的細胞趨向性，可用于定制特定的免疫反應[8]?，F(xiàn)已有多種病毒被應用于相關病毒載體疫苗的開發(fā)，如逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、腺病毒、痘病毒、甲病毒、沙粒病毒、皰疹病毒和橫紋肌病毒等[9]，各病毒載體均有其自身優(yōu)缺點，載體病毒不同，其疫苗的具體性質(zhì)也不同。

病毒載體疫苗綜合了DNA疫苗和減毒活疫苗的優(yōu)點，既可像DNA疫苗一樣攜帶DNA進入宿主細胞，誘導抗原蛋白，引發(fā)系列免疫反應，又可像減毒活疫苗一樣在體內(nèi)復制[10]。此外，病毒載體疫苗安全性較高，研發(fā)時可通過使用免疫原基因去除或替換病毒載體中的毒力基因，或者通過破壞病毒載體的復制能力確保安全性。此外病毒載體編碼的免疫原還可作為標記物，用于區(qū)分感染動物與疫苗接種動物。病毒載體同樣具有缺點，如生產(chǎn)過程復雜[11]，可誘導宿主產(chǎn)生針對載體病毒本身的中和抗體[12]及無法使用相同技術重復接種[13]，針對上述問題，現(xiàn)已通過采用相關策略進行克服，如將抗原納入衣殼而產(chǎn)生嵌合載體[14]，或構建共價修飾型和輔助病毒依賴型載體等[15]。因此，病毒載體疫苗仍是一種有著較大發(fā)展?jié)摿η铱蓮V泛適用的疫苗開發(fā)平臺。

2 不同病毒載體疫苗發(fā)展現(xiàn)狀

2.1 桿狀病毒載體

桿狀病毒（BacMam）是桿狀病毒科的雙鏈包膜DNA病毒，是目前研究最多的昆蟲病毒之一，也是最早被用作傳遞靶向基因制造ASF診斷藥物和疫苗的載體[16]。BacMam系統(tǒng)具有包裝容量大且易于生產(chǎn)的優(yōu)勢。

Carrascosa等[17]利用BacMam載體表達p12蛋白免疫家豬，結果發(fā)現(xiàn)純化重組p12免疫的豬并未對ASF產(chǎn)生保護性免疫作用。Ruiz-Gonzalvo等[18]則構建了攜帶ASFV血凝素（HA）基因的重組BacMam疫苗，發(fā)現(xiàn)疫苗接種后可刺激機體產(chǎn)生與ASFV感染恢復期動物體內(nèi)相似的保護性抗體。Gómez-Puertas等[19]利用BacMam載體表達p54和p30蛋白發(fā)現(xiàn)：接種p54或p30 BacMam疫苗的豬并未受到保護，其疾病進程也無顯著變化；但接種了p54/p30融合蛋白BacMam載體疫苗免疫的豬，其疾病進程則發(fā)生了顯著改變。這可能是因為上述疫苗同時刺激了病毒中和的兩種機制。Argilaguet等[20]用BacMam-sHAPQ，即一種編碼p30、p54和分泌性血凝素（sHA）的BacMam結構，對豬先免疫再攻毒，發(fā)現(xiàn)2/3的免疫豬體內(nèi)無病毒，這也證明了T細胞在預防ASF方面的關鍵作用。

BacMam載體在ASFV載體疫苗研究中較為常用，可能與其可獲得良好的黏膜免疫效果相關[21]。Heimerman等[22]還證明了BacMam載體在制備針對p72重組抗原片段單克隆抗體方面的有效性。

2.2 牛痘病毒載體

改良后的安卡拉牛痘病毒（MVA）可編碼一種或多種外源抗原，并可引發(fā)體液免疫和細胞免疫反應，具有固有的佐劑特性。大量臨床試驗已證實了MVA載體疫苗的安全性和有效性[23]。

Lopera-Madrid等[24]通過MVA載體系統(tǒng)，遞送表達ASFV的免疫保護性相關抗原，結果發(fā)現(xiàn)構建的相關亞單位疫苗均可誘導接種豬的T細胞反應并刺激相關抗體的產(chǎn)生。此外，Lopera-Madrid[25]還指出如何通過選擇啟動子獲得相關免疫原性抗原的高表達，這可能是未來開發(fā)以MVA為遞送載體的ASFV亞單位疫苗的研究方向。

由于MVA載體疫苗可使免疫豬穩(wěn)定獲得對ASFV各抗原蛋白的T細胞、B細胞免疫應答，因此利用MVA載體遞呈ASFV抗原復合物，以加強免疫效果，提供穩(wěn)定的保護性免疫能力，使免疫豬可以對抗同源和異源ASFV感染，將是未來開發(fā)ASFV疫苗的候選策略之一[26]。

2.3 甲病毒載體

甲病毒屬于Togaviridae家族的RNA正義單鏈病毒，可在宿主細胞的細胞質(zhì)中復制，作為疫苗載體可消除病毒基因整合到宿主基因組中的可能。甲病毒載體疫苗目前已被用作開發(fā)針對各種病毒、細菌、原生動物和腫瘤抗原疫苗的平臺[27]。被用于疫苗構建的甲病毒載體包括委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒（VEEV）、辛德比斯病毒（SINV）、塞姆利基森林病毒（SFV）以及VEEV-SINV。

現(xiàn)已證實基于甲病毒載體的疫苗對豬的幾種病毒性疫病（包括ASF）安全有效[25]。Murgia等[28]利用甲病毒載體將ASFV抗原復制子顆粒（RP）傳遞給豬并檢測豬Vero細胞中ASF抗原p30（RP-30）、p54（RP-54）和pHA-72（RP-sHA-p72）的表達和免疫原性。結果顯示，p30表達量最高且免疫原性最強，隨后分別是p54和pHA-72，體現(xiàn)出體外蛋白表達與體內(nèi)免疫原性間的相關性。后續(xù)可通過預測RP結構并分析其免疫原性，構建甲病毒載體疫苗，以增強對ASFV表位的識別。

2.4 腺病毒載體

腺病毒是一種具有遺傳多樣性的DNA病毒，可在多種動物以及人類中引起眼、呼吸道或胃腸道上皮的非致命性感染。作為可將基因或抗原遞送到目標宿主組織的優(yōu)良載體，腺病毒載體同樣是最常用的重組疫苗候選載體之一。

Lokhandwala等[29-30]評估了兩種ASFV多抗原混合物活載體疫苗的免疫原性和安全性，其中表達結構抗原（p32、p54、pp62和p72）的腺病毒混合物免疫豬后可誘導IgG、IFN-γ + T細胞和CTL響應，利用腺病毒載體遞呈新型ASFV抗原混合物A151R、B119L、B602L、EP402R1PRR、B438L、K205R和A104R，免疫豬后也得到了相同結果。Goatley等[31]發(fā)現(xiàn)ASFV基因B602L、B646L、CP204L、E183L、E199L、EP153R、F317L和MGF5055R，在使用人腺病毒5（rAd）和Ankara重組修飾疫苗遞呈并接種豬后，可以保護豬抵御致死劑量ASFV的感染。Liu等[32]對小鼠和豬進行肌肉和鼻腔接種攜帶不同抗原的ASFV腺病毒載體疫苗混合物，均取得了較好的免疫效果，且可為養(yǎng)殖豬提供高效的免疫保護，同時未觀察到抗原間的顯著干擾，這進一步證實了ASFV腺病毒載體疫苗的安全性和有效性。

相較于減毒疫苗，相關ASFV腺病毒載體疫苗雖可誘導有效的抗原特異性免疫反應，但其在ASFV強毒感染后顯示出的保護效果可能依舊有限[33]。未來ASFV新的潛在保護性抗原的挖掘?qū)谙俨《据d體ASFV疫苗的開發(fā)和保護性免疫效果的增強至關重要。

2.5 慢病毒載體

慢病毒（LV）表達載體能在細胞中穩(wěn)定持久的表達被轉(zhuǎn)染基因，且表達的相關蛋白能誘導出抗原特異性的免疫應答反應，是常用的病毒載體[34-35]，也是穩(wěn)定轉(zhuǎn)移基因到真核細胞的可靠工具[36]。與來源于腫瘤逆轉(zhuǎn)錄病毒的載體不同，LV表達載體可為原代細胞提供穩(wěn)定的基因遞送，且表現(xiàn)出低免疫原性。此外，在LV系統(tǒng)表達的蛋白泛素偶聯(lián)酶（UBCv1），是目前已知的唯一由病毒編碼的偶聯(lián)酶，可調(diào)節(jié)宿主先天免疫和炎癥信號的傳遞，并在機體抗病毒反應的形成中起重要作用[37]。

在ASF基因工程中使用LV的報道較為有限。De Oliveira等[38]在研究中首次發(fā)現(xiàn)了ASFVI329L基因在LV系統(tǒng)中表達的可能性，該基因可以用于編碼細胞膜及其表面的糖基化蛋白，抑制dsRNA刺激的NFκB和IRF3激活，從而調(diào)節(jié)宿主先天免疫，表明研發(fā)I329L基因缺失苗是研發(fā)ASFV疫苗的候選策略。Zhang等[39]成功在LV系統(tǒng)中表達ASFV DP71L蛋白，證明了DP71L在靜息細胞中可以引起真核翻譯起始因子2α（eIF2α）的去磷酸化，并可增強共轉(zhuǎn)染報告基因的表達。Masujin等[40]利用LV系統(tǒng)將SV40大T抗原（SV40LT）和豬端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（pTERT）基因?qū)朐i腎巨噬細胞，最終獲得了一種具有中晚期巨噬細胞表型特征的永生化細胞系。該細胞系具有抗ASFV感染的能力，并適用于多種ASFV體外檢測。

3 結語

目前已證實，桿狀病毒、腺病毒、甲病毒和牛痘病毒載體均可誘導有效的ASFV抗原特異性反應，但在ASFV感染特別是強毒感染后，基于現(xiàn)有免疫原的病毒載體疫苗顯示出的保護作用仍較為有限。未來可通過繼續(xù)發(fā)掘ASFV新型免疫原，并結合對相關病毒載體的優(yōu)化改造，研發(fā)出防治效果更加優(yōu)異的ASFV疫苗，爭取早日全面戰(zhàn)勝ASF疫情。