孫艷杰　趙磊　李正剛　王路宏

【摘 要】 目的：建立免疫親和柱凈化柱后光化學(xué)衍生高效液相色譜-熒光檢測(cè)法同時(shí)測(cè)定制馬腎中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的含量。方法：樣品采用70％甲醇作為提取溶劑，經(jīng)免疫親和柱凈化、高效液相色譜分離、光化學(xué)柱后衍生后，通過(guò)熒光檢測(cè)器測(cè)定其中黃曲霉毒素的含量。結(jié)果：黃曲霉毒素B1的線性范圍為0.0104～0.0520 ng（r=0.999 9）、黃曲霉毒素B2的線性范圍為0.0038～0.0190 ng（r=0.999 8）、黃曲霉毒素G1的線性范圍為0.0108～0.0540 ng（r=0.999 8）、黃曲霉毒素G2的線性范圍為0.0038～0.0190 ng（r=0.9998），線性關(guān)系良好，回收率在89.68%～101.44％之間，RSD≤3.5%。結(jié)論：該方法操作簡(jiǎn)便，靈敏度高、重復(fù)性好、結(jié)果準(zhǔn)確，可用于制馬腎中黃曲霉毒素的測(cè)定。

【關(guān)鍵詞】 制馬腎；免疫親和柱；光化學(xué)衍生；高效液相色譜-熒光檢測(cè)器；黃曲霉毒素

【中圖分類(lèi)號(hào)】R284.1 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517（2023）23-0019-04

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2023.23.zgmzmjyyzz202323005

Simultaneous Determination of Content of Four Aflatoxins in EQUI PENIS ET TESTIVULUS by Mmunoaffinity Column Clean-up and HPLC-FLD with Post-column Photochemical Derivatization

SUN Yanjie ZHAO Lei LI Zhenggang WANG Luhong*

Siping Institute for Food and Drug Control，Siping 13600，China

Abstract：Objective To establish the contamination method of aflatoxin B1，B2，G1 and G2 in EQUI PENIS ET TESTIVULUS by immunoaffinity column clean-up and HPLC-FLD with post-column photochemical derivatization．Methods? After extraction with 70% Methanol and purification by immunoaffinity columns，aflatoxin B1，B2，G1 and G2 in samples were anlyzed by HPLC-FLD with post-column photochemical derivatization.Results The linearity of Aflatoxin B1 was at 0.0104-0.0520 ng（r=0.9999）， Aflatoxin B2 was at 0.0038-0.0190 ng（r=0.9998）， Aflatoxin G1 was at 0.0108-0.0540 ng（r=0.9998）， Aflatoxin G2 was at 0.0038～0.0190 ng（r=0.9998）， The average recoveries were within 89.68%-101.44% with RSD≤3.5%. Conclusion The above method has demonstrated convenient operation，good repeatability，highsensitity and accuracy.This method is suitable for the determination of AF in Renshenguipi pills.

Keywords：Equi Penis Et Testivulus；Immunoaffinity Column；Photochemical Derivation；HPLC-FLD；Aflatoxi

馬腎藥材標(biāo)準(zhǔn)收載在《吉林省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》第二冊(cè)2019版［1］，為馬科動(dòng)物成年馬Equus caballus Linnaeus雄性的干燥陰莖及睪丸。制馬腎為馬腎經(jīng)過(guò)滑石粉炒，祛除其腥味，便于保存和臨床應(yīng)用［2］。黃曲霉素（aflatoxins，AF）屬真菌毒素，是黃曲霉和寄生曲霉產(chǎn)生的雙呋喃環(huán)類(lèi)毒素的次級(jí)代謝產(chǎn)物，以AF B1、B2、G1、G2較常見(jiàn)。AF的強(qiáng)致癌性，特別是AFB1，其毒性比氰化物、砷化物和有機(jī)農(nóng)藥等的毒性更大，已被世界衛(wèi)生組織癌癥研究機(jī)構(gòu)列為Ⅰ類(lèi)致癌物質(zhì)［3-7］。黃曲霉性喜濕熱，中藥材及飲片潮濕季節(jié)，保存不當(dāng)，容易造成黃曲霉毒素污染，特別是含蛋白質(zhì)，油脂類(lèi)的動(dòng)物類(lèi)藥材更容易黃曲霉毒素超標(biāo)?！吨袊?guó)藥典》2020版一部中有較多動(dòng)物類(lèi)藥材和飲片品種進(jìn)行了AF的限量控制，如地龍、蜂房、土鱉蟲(chóng)等［8-10］。經(jīng)查閱文獻(xiàn)，未發(fā)現(xiàn)有關(guān)于馬腎相關(guān)真菌毒素的研究報(bào)道。為保證制馬腎的用藥安全，本次研究采用檢測(cè)靈敏度較高的免疫親和柱，柱后光化學(xué)衍生，高效液相色譜-熒光檢測(cè)法同時(shí)測(cè)定制馬腎中AF B1、B2、G1、G2的含量，并進(jìn)行了方法考察研究，驗(yàn)證測(cè)定方法的可靠性，為臨床用藥安全提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 BT125D型電子天平（北京賽多利斯儀器天平有限公司），Agilent LC 1260型高效液相色譜儀（配Agilent LC1260II型熒光檢測(cè)器，安捷倫科技有限公司），KRC-25型光化學(xué)柱后衍生器（青島普瑞邦生物工程有限公司），TDL-5-A型離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.2 試驗(yàn)材料 黃曲霉混合對(duì)照品溶液（AF B1、B2、G1、G2標(biāo)示濃度分別為（1.04 μg/mL、0.38 μg/mL、1.08 μg/mL、0.38 μg/mL，批號(hào)：610001-202006，中國(guó)食品藥品檢定研究院）。10批制馬腎來(lái)源于炮制中式樣品。免疫親和柱（青島普瑞邦生物工程有限公司）。甲醇和乙腈（Flsher Scientific，色譜純），純化水為自制，其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 黃曲霉混合對(duì)照品工作溶液的制備 精密量取黃曲霉混合對(duì)照品溶液0.5 mL，置10 mL量瓶中，用70%甲醇稀釋至刻度，作為貯備溶液。精密量取貯備溶液1 mL，置25 mL量瓶中，用70%甲醇稀釋至刻度，即得黃曲霉混合對(duì)照品工作溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取供試品約15 g（剪碎），精密稱定，置于均質(zhì)瓶中，加入氯化鈉3 g，精密加入70%甲醇溶液75 mL，12000 r/min高速攪拌2 min，4500 r/min離心5 min，精密量取上清液15 mL，置50 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，4500 r/min離心10 min，精密量取續(xù)濾液10.0 mL，通過(guò)免疫親合柱，流速每分鐘3 mL，用水20 mL洗脫，洗脫液棄去，使空氣進(jìn)入，將水?dāng)D出免疫親合柱，再用適量甲醇洗脫，收集洗脫液，置2 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.22 μm）濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2 色譜條件及測(cè)定方法 采用Agilent ZORBAX SB-C18，5 μm，250 mm×4.6 mm；流動(dòng)相為：甲醇-乙腈-水（40∶18∶42）；流速為1.0 mL/min；柱溫為25 ℃；采用柱后光化學(xué)衍生法（254 nm），以熒光檢測(cè)器檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)λex = 360 nm，發(fā)射波長(zhǎng)λex = 450 nm。分別精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下黃曲霉混合對(duì)照品工作溶液5 μL、10 μL、15 μL、20 μL、25 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。另精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液20 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品中AF B1、B2、G1、G2的量，進(jìn)行計(jì)算。AF B1、B2、G1、G2的色譜峰與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，且無(wú)雜質(zhì)干擾峰。結(jié)果如圖1所示。

2.3 線性范圍和檢出限 分別精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液5 μL、10 μL、15 μL、20 μL、25 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，以進(jìn)樣量（ng）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果見(jiàn)表1。

取不含黃曲霉的樣品15g，加入適當(dāng)稀釋的黃曲霉混合對(duì)照品溶液，同供試品溶液制備、測(cè)定，以信噪比（S/N）為3作為4種黃曲霉毒素的檢出限（limit of detection，LOD）。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.4 精密度考察 取黃曲霉混合對(duì)照品工作溶液20 μL，注入液相色譜儀，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，分別計(jì)算黃曲霉B1、B2、G1、G2峰面積的RSD（n=6）分別為1.15%、1.08%、1.07%、1.31%。結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.6”項(xiàng)下供試品溶液，分別于0 h、4 h、8 h、16 h、18 h、24 h，按“2.2”色譜條件，進(jìn)樣20 μL，記錄所測(cè)各組分峰面積，黃曲霉 B1、B2、G1、G2峰面積的RSD（n=6）分別為1.82％、2.01％、1.91％、1.93％，結(jié)果表明對(duì)照品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)及回收率試驗(yàn) 經(jīng)考察10批制馬腎中均未檢出黃曲霉B1、B2、G1、G2，故本次實(shí)驗(yàn)重復(fù)性在加樣回收的6個(gè)平行試驗(yàn)的同時(shí)進(jìn)行考察。取不含黃曲霉的供試品粉末約15 g，各6份，精密稱定，分別置于均質(zhì)瓶中，精密加入黃曲霉混合對(duì)照品儲(chǔ)備液75 μL，按“2.1.2”項(xiàng)下操作，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表２。結(jié)果表明方法的重復(fù)性良好，準(zhǔn)確度達(dá)到方法要求。

2.7 樣品測(cè)定 取10批次制馬腎樣品，按照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果均未檢出AF B1、B2、G1、G2。

3 討論

3.1 樣品提取方法考察 本實(shí)驗(yàn)分別采用勻質(zhì)法和超聲提取法進(jìn)行了制馬腎樣品中黃曲毒素的提取處理，結(jié)果勻質(zhì)提取法AF B1、B2、G1、G2平均回收率分別為96.1%、95.2%、93.8%、94.4%，超聲提取法AF B1、B2、G1、G2平均回收率分別為90.5%、89.1%、91.1%、90.6%?；厥章蕜蛸|(zhì)法優(yōu)于超聲提取法。且樣品的提取采用勻質(zhì)法，12000 r/min 高速攪拌2 min即可完成操作，而超聲提取法需要超聲30 min，提取效率較勻質(zhì)法低。故本次采用勻質(zhì)法進(jìn)行制馬腎樣品中黃曲霉毒素的提取。

3.2 色譜條件的考察 以甲醇-乙腈-水（40∶18∶42）；流速為1.0 mL/min-1；柱溫為25 ℃為色譜條件，分別考察了Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、YMC-Hydrosphere-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），3個(gè)不同品牌的色譜柱的測(cè)定效果。結(jié)果，AF B1、B2、G1、G2的分離度均達(dá)到2.0以上，塔板數(shù)均高于8000，表明方法的適用性較好。

3.3 黃曲霉檢測(cè)方法選擇 黃曲霉毒素有多種檢測(cè)分析方法，包括酶聯(lián)免疫吸附法、高效液相色譜-熒光法、膠體金快速定量法、實(shí)時(shí)熒光PCR方法、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等［11-13］。其中高效液相色譜-熒光法檢測(cè)應(yīng)用最為廣泛。在4種黃曲霉毒素中，AF B1和G1遇水熒光猝滅，需要先進(jìn)行柱后衍生化，來(lái)提高AF B1和G1的熒光強(qiáng)度，增強(qiáng)其靈敏度。柱后衍生法有碘衍生法和光化學(xué)衍生法兩種。碘衍生化法需要配制碘飽和溶液，且衍生劑有一定的腐蝕作用，也會(huì)造成基線的漂移，設(shè)備成本高。而光化學(xué)衍生操作簡(jiǎn)便、不需要衍生劑與衍生溫度，延長(zhǎng)檢測(cè)器壽命，購(gòu)置成本低，儀器配制簡(jiǎn)單，并且可以通過(guò)開(kāi)關(guān)光化學(xué)衍生器，AF B1和G1的信號(hào)響應(yīng)值變化來(lái)鑒別AF B1和G1假陽(yáng)性反應(yīng)，適用性更好。

本研究進(jìn)行了免疫親和柱凈化柱后光化學(xué)衍生高效液相色譜-熒光檢測(cè)法同時(shí)測(cè)定中藥飲片制馬腎中AF B1、B2、G1、G2 4種黃曲霉毒素含量，并進(jìn)行了方法學(xué)各項(xiàng)指標(biāo)驗(yàn)證，均滿足分析測(cè)定的要求。由于本次僅收集了10個(gè)批次樣品，雖然均未檢測(cè)出黃曲霉毒素，但馬腎為動(dòng)物類(lèi)藥，蛋白質(zhì)含量高，濕熱環(huán)境下非常容易感染黃曲霉毒素，存儲(chǔ)溫度控制不好，會(huì)存在非常大的安全風(fēng)險(xiǎn)，故對(duì)其進(jìn)行AF的更多批次樣本和持續(xù)監(jiān)控檢測(cè)仍然具有非常大的意義［14-16］。

參考文獻(xiàn)

［1］吉林省藥品監(jiān)督管理局．吉林省中藥材標(biāo)準(zhǔn)（第二冊(cè)）［S］．長(zhǎng)春：吉林科學(xué)技術(shù)出版社，2020：21．

［2］衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑·第十三冊(cè)［S］.1991：9.

［3］黃曉靜，王少敏，毛丹，等.曲霉屬真菌毒素的毒性研究進(jìn)展［J］.食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2017，8（5）：1679-1687.

［4］羅自生，秦雨，徐艷群，等.黃曲霉毒素的生物合成、代謝和毒性研究進(jìn)展［J］.食品科學(xué)，2015，36（3）：250-257.

［5］陳宗良，周玲娜，趙靜芳，等.自動(dòng)固相萃取-HPLC-在線柱后光化學(xué)衍生法測(cè)定藿香正氣水中黃曲霉毒素［J］.中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2021，38（10）：1218-1221.

［6］譚靜玲，丁曉萍，姜濤，等.安神益腦丸中黃曲霉毒素殘留量測(cè)定及LC-QQQ/MS確證［J］.中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2021，41（7）：687-691.

［7］張瑋瑋，張志鵬，董雪，等.遠(yuǎn)志產(chǎn)地初加工過(guò)程中黃曲霉污染調(diào)查及病發(fā)規(guī)律研究［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2021，32（3）：603-606.

［8］國(guó)家藥典委員會(huì)．中華人民共和國(guó)藥典（四部）［S］．北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2020：127.

［9］國(guó)家藥典委員會(huì)．中華人民共和國(guó)藥典（四部）［S］．北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2020：373.

［10］許曉輝，李晨曦.QuEChERS-分散固相萃取-液質(zhì)聯(lián)用法快速測(cè)定地龍中黃曲霉毒素［J］.分析測(cè)試技術(shù)與儀器，2021，27（1）：18-23.

［11］于鵬浩，張磊.免疫親和柱凈化光化學(xué)衍生高效液相色譜-熒光檢測(cè)法同時(shí)測(cè)定土鱉蟲(chóng)中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2［J］.中國(guó)中藥雜志，2019，44（23）：5083-5087.

［12］袁京磊.黃曲霉毒素檢測(cè)方法的研究進(jìn)展［J］.現(xiàn)代食品，2022，28（1）：14.

［13］戴煌，黃周梅，李占明，等.免疫法在食品黃曲霉毒素檢測(cè)中的應(yīng)用［J］.中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2021，21（10）：287.

［14］范妙璇，傅欣彤，陳奕菲，等.三線定量膠體金免疫親和試紙法定量中藥飲片中黃曲霉毒素B1及B1、B2、G1、G2總量的研究［J］.中草藥，2021，52（17）：5275.

［15］葉萍，張慧娥，李光，等.質(zhì)譜技術(shù)在黃曲霉毒素檢測(cè)中的研究進(jìn)展［J］.食品與機(jī)械，2021，37（10）：227.

［16］趙曉野，王儒，王婷，等.黃曲霉毒素的危害及檢測(cè)方法研究進(jìn)展［J］.食品安全導(dǎo)刊，2022（3）：155.

［17］王振峰，王文萍，夏小明.黃曲霉毒素檢測(cè)方法及其應(yīng)用［J］.食品安全導(dǎo)刊，2021（3）：163.

（收稿日期：2023-03-02 編輯：劉 斌）

基金項(xiàng)目：吉林省地方中藥炮制規(guī)范項(xiàng)目（JLPZGF-2020-066）。

作者簡(jiǎn)介：孫艷杰（1980—），女，漢族，學(xué)士，副主任藥師，研究方向?yàn)樗幤焚|(zhì)量檢驗(yàn)。E-mail：383816269@qq.com

通信作者：王路宏（1965—），女，漢族，學(xué)士，主任藥師，研究方向?yàn)樗幤焚|(zhì)量檢驗(yàn)。E-mail：517677231@qq.com