祝司霞

摘要：目的 分析金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）和銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）混合物種生物膜的形成及不同清洗劑對醫(yī)用硅膠膜表面混合物種生物膜的清除效果。方法 利用醫(yī)用硅膠膜為載體建立SA+PA混合物種體外生物膜模型。采用掃描電子顯微鏡對SA+PA混合物種生物膜的形成過程進行形態(tài)學觀察，使用結(jié)晶紫法半定量檢測生物膜并測定醫(yī)用硅膠膜表面SA+PA混合物種生物膜黏附曲線，采用菌落計數(shù)法定量檢測SA+PA混合物種生物膜。使用Zen生物膜特效清洗劑、Intercept生物膜特效清洗劑、魯沃夫多酶清洗劑（RUHOF）3種清洗劑清洗生物膜，利用上述方法對比分析其對SA+PA混合物種生物膜的清除效果。結(jié)果 培養(yǎng)1 d已有菌體黏附于醫(yī)用硅膠膜表面，3 d時“微菌落”形成，5 d時成熟的SA+PA混合物種生物膜體系形成，且以PA為主要菌種。在3種清洗劑中Zen、Intercept生物膜特效清洗劑對1、3和 5 d的SA+PA混合物種生物膜均有相似的清除作用；RUHOF多酶清洗劑對1和3 d有效，對培養(yǎng)5 d的生物膜清除不佳。結(jié)論 培養(yǎng)5 d醫(yī)用硅膠膜表面形成成熟的SA+PA混合物種生物膜體系，其中PA為優(yōu)勢競爭菌種。Zen、Intercept生物膜特效清洗劑對SA+PA混合物種生物膜的清除效果最佳。

關(guān)鍵詞：生物膜清洗劑；銅綠假單胞菌；金黃色葡萄球菌；生物膜；清除

中圖分類號：R978.1 ?文獻標志碼：A

Scavenging effects of different cleaning agents on mixed biofilms of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa

Zhu Sixia

（School of Basic Medicine， Panzhihua University， Panzhihua 617000）

Abstract Objective To analyze the formation of mixed biofilms of Staphylococcus aureus （SA） and Pseudomonas aeruginosa （PA） and the removal effects of different cleaning agents on mixed biofilms on the surface of medical silica gel membrane. Methods The in vitro biofilm model of SA+PA mixture was established by using the medical silica gel membrane as the carrier. The formation process of SA+PA mixed biofilm was observed by scanning electron microscope. Semi quantitative detection of biofilm by the crystal violet method， and the adhesion curve of SA+PA mixed biofilm on the surface of the medical silicone membrane was measured. The SA+PA mixed biofilm was quantitatively detected by the colony count method. The biofilm was cleaned with Zen biofilm special cleaning agent， Intercept biofilm special cleaning agent， and RUHOF multi enzyme cleaning agent （RUHOF） respectively， and their removal effects on SA+PA mixture biofilm were compared and analyzed by the above methods. Results After one-day culture， bacteria adhered to the surface of the medical silica gel membrane. The “micro colony” was formed after three-day culture. The mature SA+PA mixture biofilm system was formed after five-day culture， and PA was the main strain. Among the three cleaning agents， Zen and Intercept biofilm special cleaning agents had similar scavenging effects on SA+PA mixture biofilm on 1， 3， and 5 d; RUHOF multi enzyme detergent was effective on 1 and 3 d， but it was not good for biofilm removal after five-day culture. Conclusion A mature SA+PA mixed biofilm system was formed on the surface of the medical silica gel membrane after five-day culture， in which PA was the dominant competitive strain. Zen and Intercept special cleaning agents for biofilm had the best removal effects on SA+PA mixed biofilm.

Key words Biofilm cleaner; Pseudomonas aeruginosa; Staphylococcus aureus; Biofilm; Clean up

醫(yī)用硅膠材料廣泛應(yīng)用于靜脈導(dǎo)管、胃管、導(dǎo)尿管、呼吸機管路和人工關(guān)節(jié)等醫(yī)療器械的同時，也導(dǎo)致生物材料植入感染（biomaterial centered infection，BCI）的發(fā)生[1]。定植于機體皮膚、黏膜表面的條件致病菌，常隨醫(yī)用硅膠材料進入機體，醫(yī)用硅膠材料為細菌提供黏附位點，細菌黏附其表面后形成生物膜。由于生物膜是復(fù)雜的多微生物群落，機體免疫系統(tǒng)和抗生素容易殺滅游離的病原菌，卻很難殺滅生物膜群體內(nèi)的病原菌[2]，因此生物材料表面生物膜的存在成為BCI等慢性難治性感染的根源。目前，大多數(shù)研究集中在單種生物膜，但其實混合物種生物膜才是細菌的主要生活方式，生物膜群落的結(jié)構(gòu)、發(fā)育和功能均會受物種間相互作用的影響[3]。因此研究混合物種生物膜更能為解決臨床感染問題奠定基礎(chǔ)。

有研究發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）和銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）引起的臨床混合感染較常見，如姜永廣等[4]在骨傷科感染病灶中檢測到SA＋PA的混合感染（占36.5%），呂柏成等[5]報道在呼吸機相關(guān)性肺炎（VAP）患者中常檢測出PA、鮑曼不動桿菌、SA和肺炎克雷伯菌等的混合感染。然而有關(guān)醫(yī)用硅膠材料引發(fā)的SA+PA混合物種生物膜感染的研究鮮見報道。而且生物材料表面的生物膜黏附力極強，很難用普通清洗方法去除[6]，從而導(dǎo)致植入感染的發(fā)生。因此，本研究通過建立醫(yī)用硅膠膜表面SA+PA混合物種生物膜體外模型，探討混合物種生物膜形成的規(guī)律、特點；通過對比不同清洗劑對生物膜的清除效果，為生物材料植入引發(fā)的生物膜感染的防治提供經(jīng)驗。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源

銅綠假單胞菌ATCC27853標準菌株、金黃色葡萄球菌ATCC29213標準菌株，均來自攀枝花市中心醫(yī)院檢驗科。

1.1.2 主要試劑

Zen生物膜特效清洗劑（楷騰醫(yī)療設(shè)備有限公司）；Intercept生物膜特效清洗劑（Cantel medical company）；魯沃夫（RUHOF）全效型多酶清洗劑（杭州魯沃夫貨物進出口有限公司）；LB營養(yǎng)瓊脂（青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司）；胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）（上海廣銳生物科技有限公司）。

1.1.3 主要儀器

場發(fā)射掃描電子顯微鏡（Sigma 500，美國Sigma）；氣浴恒溫振蕩器（THZ-82B，常州市國旺儀器制造有限公司）；凈化工作臺（SW-CJ-2FD，蘇州博萊爾凈化設(shè)備有限公司）；恒溫恒濕箱（BSC-250，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；醫(yī)用硅膠膜（深圳市嘉杰橡塑有限公司）；酶標儀（RT-6100，南京華東電子集團醫(yī)療裝備有限責任公司）；可見分光光度計（722N，上海菁華科技儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 建立SA+PA混合物種體外生物膜模型

參照夏京津等[7]方法并加以適當改進，將SA標準株和PA標準株分別用TSB稀釋制備成菌懸液，分光光度計測定其A值為0.1（約1×107 CFU/mL）后，兩組菌液1：1混合制成混合菌液（SA+PA），放4 ℃冰箱儲存?zhèn)溆?。設(shè)6個復(fù)孔，每孔菌液2 mL接種于無菌24孔板，用無菌鑷夾取無菌醫(yī)用硅膠膜片（載體）（0.8 cm×0.8 cm）浸入孔板菌液中。37 ℃培養(yǎng)，隔天更換一次培養(yǎng)液，分別培養(yǎng)0.5、1、2、3、4、5和7 d后，觀察或測定生物膜。

1.2.2 掃描電子顯微鏡觀察SA+PA混合物種生物膜

參考張國婧等[8]方法將培養(yǎng)1、3、5和7 d的醫(yī)用硅膠膜片取出，用2 mL PBS輕輕洗3次，加2.5％戊二醛于室溫固定2 h，PBS溶液洗3次。用乙醇梯度脫水，20%、40%、60%、80%、100%、100%和100%梯度各20 min。取出醫(yī)用硅膠膜片自然干燥，真空噴金。在掃描電鏡下觀察醫(yī)用硅膠膜表面SA+PA生物膜形成情況。

1.2.3 結(jié)晶紫半定量法檢測SA+PA混合物種生物膜

參考邵菊芳等[9]方法，吸棄菌液，用PBS清洗醫(yī)用硅膠膜片3次，將2%結(jié)晶紫染液400 μL加入孔板，輕搖使染色均勻，靜置30 min。用PBS清洗載體并取出放入新的孔板。吸取400 μL二甲基亞砜加入孔板，脫色15 min。另取一塊96孔板每孔加入100 μL脫色液，用酶標儀在570 nm處分別測量0.5、1、2、3、4、5和7 d的A值。以培養(yǎng)天數(shù)為橫坐標，A值為縱坐標，繪制SA+PA混合物種生物膜黏附量曲線。

1.2.4 菌落計數(shù)法定量檢測SA+PA混合物種生物膜

參考任偉等[10]方法，無菌PBS緩沖液清洗培養(yǎng)1、3和5 d醫(yī)用硅膠膜片，去除浮游菌，將醫(yī)用硅膠膜片放入含有5 mL PBS的PE管中浸沒，置于試管架上，恒溫振蕩器中22.7 ℃、300 r/min震蕩10 min。吸取1 mL震蕩菌液用PBS系列10倍稀釋，選擇稀釋度為10-1、10-2和10-3的菌液各1 mL加入無菌平皿（每個濃度3個平皿，按菌落報告原則和方法進行菌落計數(shù)），傾注冷卻至45 ℃的LB瓊脂培養(yǎng)液20 mL，在桌面搖勻，37 ℃恒溫恒濕箱培養(yǎng)24 h，進行菌落計數(shù)。實際菌落數(shù)（CFU/cm2）=肉眼可見菌落計數(shù)×稀釋倍數(shù)/面積，取實際菌落計數(shù)的常用對數(shù)（lgCFU/cm2）為標準菌落計數(shù)單位。

1.2.5 SA+PA混合物種生物膜的清洗

參考倪朝榮、任偉等[11-12]方法，選取培養(yǎng)1、3和5 d的細菌進行清洗實驗，從24孔板中取出醫(yī)用硅膠膜片分別放入裝有10 mL不同清洗劑的試管中，實驗分4組，Zen生物膜特效清洗劑組（Zen組）、魯沃夫多酶清洗劑組（RUHOF組）、Intercept生物膜特效清洗劑組（Intercept組）、無菌水組。恒溫振蕩器中22 ℃、100 r/min清洗5 min，取出醫(yī)用硅膠膜片放入新的24孔板，PBS清洗3次，洗去殘余清洗劑，無菌紗布擦干備用。觀察或檢測清洗后的醫(yī)用硅膠膜片表面的生物膜，方法同上（掃描電子顯微鏡法、結(jié)晶紫半定量法、菌落計數(shù)法）。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SPSS 17.0軟件分析數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計量資料以（x±s）表示，兩組計量資料的比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 清洗前及清洗后SA+PA混合物種生物膜形態(tài)

掃描電鏡（SEM）下，1 d少量菌體黏附在醫(yī)用硅膠膜表面，菌體零散分布。3 d“微菌落”形成，菌體分泌胞外多聚物質(zhì)，彼此黏附簇集。5 d“微菌落”增多，菌體被胞外多聚物質(zhì)包裹，形成大片厚厚的生物膜牢固黏附在硅膠膜表面，成熟的生物膜體系已經(jīng)形成，且在整個生物膜體系中PA占有絕對優(yōu)勢，比SA數(shù)量多，SA大多被PA包裹。7 d菌體外面的胞外多聚物質(zhì)基本消失，細菌脫離“微菌落”，散在分布，某些菌體固縮變形。見圖1。

各組清洗劑對1 d生物膜的清洗均較徹底，對3 d生物膜的清洗效果較好，但有少量菌體殘留。Zen、Intercept組清洗劑對5 d的生物膜大部分有破壞，但菌體有崩解變形或殘留。RUHOF組對5 d的生物膜清洗后有較多的菌體殘留。無菌水組雖能部分清除3 d和5 d的生物膜，但與其它清洗劑組相比效果較差。見圖2。

2.2 清洗前SA+PA混合物種生物膜黏附量曲線及清洗后半定量檢測

分析清洗前不同時間點SA+PA生物膜黏附量。與空白組比較，1和7 d無顯著性差異，其余天數(shù)均有顯著性差異。生物膜黏附曲線顯示生物膜產(chǎn)量呈現(xiàn)逐漸遞增的趨勢，5 d達到最大生長量，之后急劇下降。具體情況如下：0.5與1 d之間有顯著性差異，表明從1 d開始，已有菌體黏附于硅膠膜表面。1與2 d、2與3 d之間無顯著性差異。1與3 d之間有顯著性差異，生物膜黏附量曲線呈現(xiàn)上升趨勢，硅膠膜表面黏附的菌體數(shù)量平穩(wěn)增長。3與4 d之間無顯著性差異。4與5 d之間有顯著性差異，菌體數(shù)量劇增。5與7 d之間有顯著性差異，生物膜產(chǎn)量明顯下降。見圖3。

同種清洗劑對培養(yǎng)1、3和5 d SA+PA生物膜清除作用比較。無菌水組1與3、5 d之間有顯著性差異，說明無菌水組只在1 d有效（結(jié)合電鏡結(jié)果）。RUHOF組1與3 d無差異、1和5 d之間有顯著性差異，說明RUHOF組在第1、3 d有效。Intercept組和Zen組1、3 和5 d之間比較無顯著性差異，Intercept組和Zen組對培養(yǎng)1、3和5 d的SA+PA生物膜均有清除作用。

分析相同培養(yǎng)時間各組清洗劑對SA+PA生物膜細菌量的影響。1 d各清洗劑組與無菌水組比較無顯著性差異，說明各組清洗劑還未體現(xiàn)出優(yōu)于無菌水的清洗效果。3 d Zen、Intercept、RUHOF組與無菌水組比較均有顯著性差異，提示清洗劑清洗生物膜效果明顯優(yōu)于無菌水，而3組清洗劑兩兩比較無顯著性差異，說明三者清洗效果相差不大。5 d Intercept、Zen組與無菌水組比較均有顯著性差異，但兩組清洗劑比較無顯著性差異，說明兩者清洗效果均優(yōu)于無菌水組且效果相差不大；RUHOF組對5 d SA+PA生物膜的清除無效。見表1。

2.3 清洗前及清洗后SA+PA混合物種生物膜活菌計數(shù)

通過定量實驗再次驗證，洗前1 d SA+PA混合物種生物膜標準菌落計數(shù)為1.9565±0.2324，3 d為2.0808±0.1191，5 d為2.5645±0.5346，提示生物膜細菌數(shù)量隨培養(yǎng)時間呈現(xiàn)上升趨勢。

1 d各清洗劑組與無菌水組比較及各清洗劑組組間比較，SA+PA生物膜菌落計數(shù)無顯著性差異，說明各組清洗劑對1d的SA+PA生物膜清除效果與無菌水相差不大。

3 d各清洗劑組與無菌水組比較，SA+PA生物膜菌落計數(shù)均有顯著性差異（P＜0.01），說明各組清洗劑對培養(yǎng)3 d的SA+PA生物膜清除效果強于無菌水；但Zen、Intercept、RUHOF組兩兩比較無顯著性差異，提示3組清洗劑對3 d的SA+PA生物膜的清除效果相似。

5 d Zen、Intercept組與無菌水組比較，對SA+PA生物膜清除效果強于無菌水（P＜0.05），但兩組清洗劑之間比較無顯著差異；RUHOF組與無菌水組比較無顯著性差異，說明RUHOF組對5d的生物膜清除效果不佳。見表2。

綜合電鏡觀察、結(jié)晶紫半定量及菌落計數(shù)定量實驗分析，各組清洗劑與無菌水組對1 d的SA+PA生物膜清除均有效。除此之外，Intercept、Zen組對

3 d和5 d的SA+PA生物膜均有清除作用且效果相似，RUHOF組對3 d的生物膜清除有效，但對5 d的生物膜清除無效。

3 討論

本實驗突破傳統(tǒng)的單一菌種生物膜模型，選擇SA+PA混合物種生物膜模型，其原因如下：條件致病性PA菌有單生鞭毛，是生物膜研究的頂尖模式生物之一[13]，廣泛分布在醫(yī)院環(huán)境中，是醫(yī)院內(nèi)感染的重要病原菌之一[14]。此外，近年醫(yī)療活動中SA的檢出率有升高的趨勢，SA可引起皮膚與軟組織感染（SSTIs）、肺炎、敗血癥等多種疾病，是醫(yī)院獲得性感染和社區(qū)感染中最重要的致病菌之一[15-16]。研究還發(fā)現(xiàn)，PA和SA是臨床醫(yī)療中常見的共存生物膜菌，Cendra等[17]發(fā)現(xiàn)PA和SA是肺部或傷口生物膜中共同生長的主要病原菌。Chew等[18]報道PA和SA形成生物膜共同感染囊性纖維化患者的肺部以及糖尿病和慢性傷口，微生物能建立生物膜聯(lián)盟，依靠各種不同的策略與其他物種進行社會互動，并獲取資源優(yōu)化生長。李敏等[19]發(fā)現(xiàn)多種微生物共同作用會表現(xiàn)出與單菌種不同的致病行為。基于以上原因，本實驗選擇SA和PA作為實驗菌株，建立混合物種生物膜模型。

電鏡觀察和生物膜黏附量曲線顯示，SA+PA生物膜黏附量隨培養(yǎng)時間不斷增長，培養(yǎng)5 d成熟的SA+PA生物膜體系形成，生物膜厚度和面積均最大化，牢固黏附于載體。需要特別引起注意的是在整個生物膜體系中PA占有絕對優(yōu)勢，PA數(shù)量多，覆蓋和包裹SA，這與Chew等[18]研究的PA可拮抗SA的生長具有相似性；另有Ozer等[13]在研究生物膜成熟過程中發(fā)現(xiàn)野生型的PA生物膜結(jié)構(gòu)與鞭毛敲除菌株相比，更強一個數(shù)量級，推測鞭毛在生物膜結(jié)構(gòu)中可能具有支架作用；Magalh?es等[20]發(fā)現(xiàn)SA在占主導(dǎo)地位的PA雙物種聯(lián)合體中經(jīng)歷了活的非可培養(yǎng)（Viable but non-culturable，VBNC）狀態(tài)；徐瑞瑞[21]報道在混合生物膜中，PA集中在混合生物膜的上層，SA富集在混合生物膜的底層，最終PA能殺滅生物膜中的SA，但殺滅需要一定的時間。上述報道或許能解釋本實驗中PA為SA+PA混合物種生物膜體系中的優(yōu)勢菌種，但PA如何殺滅或抑制SA需要后續(xù)實驗進一步探索。本實驗還顯示，5 d后生物膜產(chǎn)量明顯下降，至7 d時細菌生物膜已經(jīng)崩解，菌體散在分布，固縮變形（電鏡）。有研究表明[22]，由于細菌被包裹于生物膜內(nèi)，營養(yǎng)吸收受限制，生物膜成熟后其中的細菌繁殖會減慢，細菌數(shù)量亦會相對減少，生物膜也隨之老化，黏附力下降。

生物膜的形成給臨床抗感染帶來諸多不便，李敏等[19]認為頑固生物膜可造成傷口愈合過程中斷，是傷口愈合的主要障礙，為了促進傷口愈合，必須清除或破壞生物膜。李文濤等[23]認為醫(yī)療機構(gòu)中復(fù)用的醫(yī)療器械，因清潔消毒不規(guī)范或因長期使用出現(xiàn)磨損等，生物膜的形成概率更高，極易導(dǎo)致病人難治性感染的發(fā)生，因此如何有效去除生物膜極為重要。近年來醫(yī)療機構(gòu)廣泛關(guān)注生物膜的去除，各種清洗、消毒產(chǎn)品被普遍使用。經(jīng)查閱文獻[24-25]，本實驗選2種生物膜特效清洗劑（Zen和Intercept）和1種多酶清洗劑（RUHOF），比較目前醫(yī)療機構(gòu)常用的這3種內(nèi)鏡清洗劑對生物膜的清除效果，以期對醫(yī)用硅膠膜表面生物膜去除制劑的選擇提供依據(jù)。

根據(jù)上述生物膜形成實驗結(jié)果，本實驗選擇1、3和5 d進行清洗實驗。結(jié)合形態(tài)觀察、半定量和定量實驗結(jié)果，分析如下：各組清洗劑對1 d的SA+PA生物膜清洗均較徹底，可能與1 d生物膜形成少，黏附不牢固有關(guān)；Zen、Intercept、RUHOF組對3 d生物膜清除有效，但細菌有少量殘留，可能由于隨著培養(yǎng)時間延長，細菌繁殖增多，分泌胞外多聚物質(zhì)增多，生物膜逐漸形成，黏附硅膠膜牢固有關(guān)；Zen、Intercept組對5 d生物膜清除有效，而RUHOF清洗劑對5 d生物膜清除效果不佳，仍有大量完整細菌殘留，說明對醫(yī)用硅膠膜表面SA+PA成熟生物膜體系的清除需要更強力的清洗劑。有文獻報道[25]，生物膜特效清洗劑，能迅速滲透、瓦解和剝離污染物，有效去除或抑制植入醫(yī)療器材表面生物膜。而普通多酶清洗劑難以穿透生物膜殺死被黏液性多聚胞外物質(zhì)包裹的細菌，導(dǎo)致清洗和消毒失敗?？傊瑢? d成熟生物膜的清除，選擇生物膜特效清洗劑比多酶清洗劑和無菌水效果更好。

本實驗的局限性及未來研究方向在于：對影響混合物種相互作用和感染的諸多因素知之甚少。對包裹細菌的主要胞外多聚物及其調(diào)節(jié)劑如何促進或抑制種間行為的機制研究欠缺。后續(xù)實驗對混合物種生物膜中的SA與PA需單獨分離定量分析，進一步探究二者競爭的機制。需深入探索穩(wěn)定生物膜中SA+PA體外共存的最佳培養(yǎng)條件和環(huán)境。臨床診療中植入患者體內(nèi)的醫(yī)用硅膠材料表面生物膜的形成比體外實驗要復(fù)雜的多，清除的難易程度自然也會有所不同，因此后續(xù)將繼續(xù)跟進研究提供更多的相關(guān)數(shù)據(jù)。

參 考 文 獻

李民杰. 大腸桿菌運動調(diào)控在生物材料植入感染中的作用研究[D]. 昆明： 昆明醫(yī)科大學， 2021： 1-26.

阮文鵬. 表皮葡萄球菌agrC特異結(jié)合多肽對大鼠中心靜脈插管感染作用研究[D]. 昆明：昆明醫(yī)科大學， 2018： 1-15.

陳萍， 王敬敬， 洪斌， 等. 副溶血性弧菌和單增李斯特菌共培養(yǎng)的混合生物膜的特性//.中國食品科學技術(shù)學會第十六屆年會暨第十屆中美食品業(yè)高層論壇論文摘要集[C]. 武漢， 2019： 55-56.

姜永廣， 劉文良， 王子偉. 探討骨傷科混合感染的常見病原菌的分布和耐藥性分析[J].世界最新醫(yī)學信息文摘， 2013， 13（11）： 277-277.

呂柏成， 黃嘉正， 馮文聰， 等. 呼吸機相關(guān)性肺炎的病原微生物與耐藥性分析[J]. 河北醫(yī)藥， 2021， 43（7）： 1100-1102.

張波， 單秋實， 劉佳妮， 等. 一元過氧乙酸清除消化內(nèi)鏡生物膜的效果[J]. 中華醫(yī)院感染學雜志， 2021， 31（4）： 607-610.

夏京津， 張海月， 許瑞， 等. 維氏氣單胞菌生物膜體外模型的建立及影響因素的研究[J]. 中國獸藥雜志， 2015， 49（10）： 10-14.

張國婧， 萬子琳， 王小燕， 等. 表皮葡萄球菌胞間黏附素基因操縱子對細菌與真菌混合生物膜相關(guān)炎癥作用影響的體內(nèi)研究[J]. 中國修復(fù)重建外科雜志， 2021， 35（10）： 1328-1335.

邵菊芳， 龔春生， 方婷婷， 等. 銀杏葉黃酮對大腸桿菌生物膜的抑制作用[J]. 北京化工大學學報（自然科學版）， 2021， 48（6）： 57-63.

任偉， 黃茜， 石彩曉， 等. 不同培養(yǎng)時間對大腸埃希菌生物膜形成影響[J]. 中國公共衛(wèi)生， 2013， 29（2）： 242-244.

倪朝榮， 朱子福， 吳躍進， 等. 不同清洗劑對消化內(nèi)鏡生物膜的清除效果研究[J]. 中國消毒學雜志， 2019， 36（2）： 84-86.

任偉， 黃茜， 周立平， 等. 不同清洗劑對內(nèi)鏡生物膜清除的效果評價[J]. 中華醫(yī)院感染學雜志， 2011， 21（7）： 1382-1384.

Ozer E， Yaniv K， Chetrit E， et al. An inside look at a biofilm： Pseudomonas aeruginosa flagella biotracking[J]. Sci Adv， 2021， 7（24）： e8581.

王玉沐， 王麗萍， 楊寶春. 2017—2020年某醫(yī)院感染銅綠假單胞菌對碳青霉烯類藥物耐藥情況及其危險因素分析[J]. 中國消毒學雜志， 2022， 39（4）： 294-297.

冉德琳， 張朝霞， 吳梅， 等. 2018—2020年皮膚科住院患者金黃色葡萄球菌感染狀況及MRSA與MSSA耐藥性分析[J]. 中國麻風皮膚病雜志， 2022， 38（7）： 430-433.

胡付品， 郭燕， 朱德妹， 等. 2017年CHINET中國細菌耐藥性監(jiān)測[J]. 中國感染與化療雜志， 2018， 18（3）： 241.

Cendra M D M， Blanco C N， Pedraz L， et al. Optimal environmental and culture conditions allow the in vitro coexistence of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus in stable biofilms[J]. Sci Rep， 2019， 9（1）： 16284.

Chew S C， Yam J K H， Matysik A， et al. Matrix polysaccharides and Sia D diguanylate cyclase alter community structure and competitiveness of Pseudomonas aeruginosa during dual-species biofilm development with Staphylococcus aureus[J]. Mbio， 2018， 9（6）： e00585-18.

李敏， 吳佳倩， 黃素群. “早期生物膜治療策略應(yīng)對難愈傷口： 傷口衛(wèi)生”國際專家共識解讀[J]. 護理研究， 2021， 35（08）： 1317-1321.

Magalh?es A P， Grainha T， Sousa A M， et al. Viable but non-cultivable state： a strategy for Staphylococcus aureus survivable in dual-species biofilms with Pseudomonas aeruginosa[J]？ Environ Microbiol， 2021， 23（9）： 5639-5649.

徐瑞瑞. 環(huán)境因素對群體微生物中銅綠假單胞菌與其他微生物相互作用的影響及機理探究[D]. 華南： 華南理工大學， 2020： 100-107.

景春娥， 李萍， 杜欣軍， 等. 硅膠表面阪崎克羅諾桿菌生物膜的形態(tài)觀察[J]. 食品研究與開發(fā)， 2016， 37（14）： 144-148.

李文濤， 孫志紅. 過氧乙酸類消毒劑對生物膜消毒清除效果[J]. 中華醫(yī)院感染學雜志， 2021， 31（4）： 602-606.

沈瑾， 段弘揚， 邱俠， 等. 堿性電解水與醫(yī)用清洗劑去除細菌生物膜的研究[J]. 中華醫(yī)院感染學雜志， 2018， 28（7）： 979-982.

王淑芳. Intercept生物膜特效清洗劑與普通酶洗液在內(nèi)鏡消毒中的應(yīng)用效果比較[J]. 當代醫(yī)學， 2015， 21（19）： 147-148.