薛永常 吳欣園 朱晨陽

摘要：差向異構(gòu)結(jié)構(gòu)域作為非核糖體肽合成酶體系中重要組分，將L型氨基酸異構(gòu)化為D型氨基酸，賦予了非核糖體肽獨(dú)特的生物活性和對蛋白酶的抵抗力。本文結(jié)合近期研究闡述了差向異構(gòu)結(jié)構(gòu)域的蛋白結(jié)構(gòu)特征和異構(gòu)化過程中的去質(zhì)子化/再質(zhì)子化機(jī)制，此外還對差向異構(gòu)結(jié)構(gòu)域在非核糖肽合成中的調(diào)控作用進(jìn)行了總結(jié)，展望了非核糖體肽合成酶的未來發(fā)展趨勢，希望為非核糖體肽合成酶的工程改造和新藥的研發(fā)提供理論基礎(chǔ)和依據(jù)。

關(guān)鍵詞：非核糖體肽合成酶；差向異構(gòu)結(jié)構(gòu)域；非核糖體肽；立體化學(xué)轉(zhuǎn)化；構(gòu)象

中圖分類號：Q71文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

The role of epimerization domain in the synthesis of nonribosomal peptides

Xue Yongchang， Wu Xinyuan， and Zhu Chenyang

（School of Biological Engineering， Dalian Polytechnic University， Dalian 116034）

Abstract As an important component in the system of nonribosomal peptide synthetase， the epimerization domain isomerizes L-amino acids into D-amino acids， giving nonribosomal peptides unique biological activity and resistance to protease. Combined with recent research， this paper describes the protein structural characteristics of the epimerization domain and the mechanism of deprotonation/re-protonation during isomerization. In addition， the regulatory role of epimerization domains in nonribosomal peptide synthesis is summarized， and the future development trend of nonribosomal peptide synthase is prospected， in order to provide a theoretical basis for the engineering modification of nonribosomal peptide synthase and development of new medicines.

Key words Nonribosomal peptide synthetases; Epimerization domain; Nonribosomal peptide; Stereochemical transformation; Conformation

自然界中微生物產(chǎn)生大量小分子生物活性肽和次級代謝物，其中大部分屬于非核糖體肽（nonribosomal peptide， NRP）類化合物。NRPs是由非核糖體肽合成酶（nonribosomal peptide synthetase， NRPS）催化合成的，含有蛋白源性氨基酸、脂肪酸和羥基酸以及D型氨基酸（D-amino acid， D-AA）等[1]，具有抗真菌、抗病毒、抗癌等重要的藥理活性[2-4]。NRPS是一種大型多模塊酶，由功能不同的結(jié)構(gòu)域組成相應(yīng)的模塊，并按特定順序排列而成[5-8]。作為NRPS的修飾性結(jié)構(gòu)域，差向異構(gòu)（epimerization， E）結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)把連接在肽基載體蛋白（peptidyl carrier protein domain， PCP）上的L型氨基酸（L-amino acid， L-AA）立體異構(gòu)化為D-AA，在非核糖體多肽上摻入非蛋白源性氨基酸，如短桿菌肽（gramicidin）A[9]。D-AA的摻入使NRPs蛋白水解敏感性降低，增強(qiáng)了NRPs的生物學(xué)活性[10]，提高了NRPs的結(jié)構(gòu)多樣性，因此對NRPs合成中E結(jié)構(gòu)域的研究具有重要的實(shí)用價(jià)值。本文對近年來在E結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)及其作用機(jī)制的研究進(jìn)行綜述，希望為尋找新非核糖體肽類化合物合成方式及其新藥研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 E結(jié)構(gòu)域的發(fā)現(xiàn)

1968年首次在短桿菌肽S的產(chǎn)生菌短芽胞桿菌（Bacillus brevis）中發(fā)現(xiàn)了E結(jié)構(gòu)域的存在[11]，隨后Stachelhaus等[12]發(fā)現(xiàn)它在NRPs合成中獨(dú)特的立體異構(gòu)活性，才將其正式命名為差向異構(gòu)結(jié)構(gòu)域。E結(jié)構(gòu)域和縮合（condensation， C）結(jié)構(gòu)域、環(huán)化結(jié)構(gòu)域、Dual E/C結(jié)構(gòu)域均是C結(jié)構(gòu)域超家族成員，E結(jié)構(gòu)域和C結(jié)構(gòu)域有一定的同源性，存在一段相同的保守基序HHxxxDG，但催化殘基有細(xì)微差別[13]，E結(jié)構(gòu)域一般作為一個(gè)完整模塊中的第四個(gè)結(jié)構(gòu)域，與同模塊的PCP結(jié)構(gòu)域相連，進(jìn)行氨基酸或多肽的異構(gòu)化，其下游通常緊隨一個(gè)DCL結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)肽鏈的合成。E結(jié)構(gòu)域根據(jù)不同模塊對結(jié)合底物的傾向性，分別在起始模塊和延伸模塊對氨?；螂幕孜锂悩?gòu)化[14]，豐富了NRPs結(jié)構(gòu)的多樣性。

2 E結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)

E結(jié)構(gòu)域相對分子質(zhì)量大約為50 ku[10]，第一個(gè)E結(jié)構(gòu)域晶體結(jié)構(gòu)來自于短桿菌酪肽合成酶A（tyrocidine synthetase A， TycA），由結(jié)構(gòu)相似、分別稱為N末端亞域和C末端亞域的兩部分組成（圖1），這兩個(gè)亞域都具有與氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（chloramphenicol acetyltransferase， CAT）類似的折疊結(jié)構(gòu)。在每個(gè)亞域的中心都由一個(gè)大的β-折疊片層組成，兩側(cè)主要是兩側(cè)以α-螺旋序列為主，C末端亞域的中心由6個(gè)β-折疊組成，外側(cè)由9個(gè)α-螺旋依靠兩個(gè)延伸鏈覆蓋；N末端子域由5個(gè)β-折疊組成中心結(jié)構(gòu)，并由5個(gè)α-螺旋和一個(gè)小β-折疊覆蓋，兩個(gè)亞域在連接處形成與PCP結(jié)合的口袋，整體結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為呈“V”形的偽二聚體，活性位點(diǎn)位于整個(gè)區(qū)域的中心，即兩個(gè)亞域的交界處[15]。比對GrsA的E結(jié)構(gòu)域和弧菌素合成酶（vibriobactin synthetase）VibH的序列及其二級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)二者存在極高的結(jié)構(gòu)相似性，它們的活性位點(diǎn)表面都有一個(gè)相似的通道[16]。但E結(jié)構(gòu)域和C結(jié)構(gòu)域在底環(huán)區(qū)（floor loop）與橋區(qū)（bridge region）存在明顯差異 [15]。E結(jié)構(gòu)域的底環(huán)區(qū)比C結(jié)構(gòu)域多5個(gè)氨基酸殘基，在供體側(cè)呈一個(gè)鎖扣狀結(jié)構(gòu)，與相鄰的PCP結(jié)構(gòu)域相互作用。而E結(jié)構(gòu)域橋區(qū)的這部分多肽鏈則對應(yīng)于C結(jié)構(gòu)域的受體位點(diǎn)，橋區(qū)在兩個(gè)類似CAT結(jié)構(gòu)域形成的裂縫中扭曲構(gòu)象，覆蓋了E結(jié)構(gòu)域頂部的活性位點(diǎn)，阻斷其受體側(cè)，導(dǎo)致活性位點(diǎn)只能從對應(yīng)于C結(jié)構(gòu)域的供體側(cè)進(jìn)入。因此，PCP結(jié)構(gòu)域可與E結(jié)構(gòu)域之間以一種類似于它與其下游C結(jié)構(gòu)域供體側(cè)之間相互作用的方式互相影響，這反映了PCP結(jié)構(gòu)域的多功能性，它不僅能與上游腺苷化（adenylation， A）結(jié)構(gòu)域和下游C結(jié)構(gòu)域相互作用，還能與E結(jié)構(gòu)域相互作用，從而證實(shí)了PCP結(jié)構(gòu)域在NRP合成過程中作為中間體穿梭的核心作用。

3 E結(jié)構(gòu)域活性位點(diǎn)及作用機(jī)制

自E結(jié)構(gòu)域被發(fā)現(xiàn)以來，對其生物化學(xué)研究較少，主要研究集中在探索其作用機(jī)制方面。Stachelhaus等[17]通過對短桿菌肽S合成酶（gramicidin S synthetase 1， GrsA）起始模塊中E結(jié)構(gòu)域的保守氨基酸殘基誘變，發(fā)現(xiàn)其活性中心基序的H753A、D757S、D767S、E892A和Y976A對異構(gòu)化的活性至關(guān)重要，其中H753A和D757S的突變致使E結(jié)構(gòu)域失活，其余突變僅減緩了氨基酸異構(gòu)化的速率。此外還在E結(jié)構(gòu)域突變體上添加了放射性標(biāo)記探索其質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)了異構(gòu)化過程中的去質(zhì)子化/再質(zhì)子化機(jī)制。E結(jié)構(gòu)域活性表面存在一個(gè)與C結(jié)構(gòu)域類似的通道，PCP的磷酸泛酰巰基乙胺（4-phos-phopantetheine， Ppant）臂能從E結(jié)構(gòu)域的N端結(jié)合在此通道內(nèi)，并在活性位點(diǎn)與L-氨酰基底物共價(jià)連接，催化氨基酸的Cα異構(gòu)（圖2）。在GrsA的E結(jié)構(gòu)域中，His753的咪唑側(cè)鏈與Ppant臂的硫原子相連，Tyr976、His894和Lys945為Ppant臂提供氫鍵型相互作用，殘基R896、D757和S760通過氫鍵相互作用，將Eα4固定在催化輔助位置，其結(jié)構(gòu)指向Ppant臂的末端，通過α-螺旋的偶極矩為烯醇鹽中間體提供正靜電穩(wěn)定性[18]。只有當(dāng)E結(jié)構(gòu)域與PCP的Ppant結(jié)合時(shí)，它才能夠催化氨基酸Cα消旋[19]。E結(jié)構(gòu)域催化底物立體化學(xué)轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生L型和D型異構(gòu)體的平衡混合物，下游的DCL結(jié)構(gòu)域特異性地識別D型異構(gòu)體，促進(jìn)其和下游受體氨酰基之間形成肽鏈[20-21]。

Samel等[15]和Chen等[18]均對異構(gòu)化機(jī)理進(jìn)行了討論，認(rèn)為在異構(gòu)化反應(yīng)過程中L-AA的Cα質(zhì)子與充當(dāng)堿的殘基反應(yīng)，產(chǎn)生一種烯醇中間體，充當(dāng)酸的殘基為其提供質(zhì)子形成D-AA。然而他們對組氨酸和谷氨酸的酸堿分類意見不一，因?yàn)檫@兩個(gè)殘基中的任何一個(gè)突變對異構(gòu)化都有影響。Samel等[15]在研究TycA的PCP-E雙結(jié)構(gòu)域時(shí)認(rèn)為在沒有結(jié)合底物的生理?xiàng)l件下，His743殘基質(zhì)子化，它的催化活性取決于與中間體的靜電相互作用，而不是酸堿催化。組氨酸不作為酸或堿，而是用來穩(wěn)定瞬時(shí)出現(xiàn)的中間體，Glu882則更有可能是酸堿催化劑。但在突變實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)谷氨酸突變能使Cα質(zhì)子提取減少6倍，而組氨酸的突變卻能消除E結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的Cα質(zhì)子提取[17]，所以Chen等[18]更傾向于認(rèn)為組氨酸作為堿存在。

隨著探針技術(shù)日益成熟，其在研究NRPS各結(jié)構(gòu)域間的相互作用方面發(fā)揮了巨大作用[22-23]，Kim等[24]設(shè)計(jì)交聯(lián)探針探究GrsA中E結(jié)構(gòu)域催化機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)了氯乙烯甘氨酸可作為PCP和E結(jié)構(gòu)域交聯(lián)劑，但其易水解，僅具有適度的交聯(lián)性。隨后Kim等[25]又設(shè)計(jì)了磺酸鹽交聯(lián)探針，它可與谷氨酸、組氨酸、天冬氨酸等幾種氨基酸發(fā)生獨(dú)特的反應(yīng)，可以輕松對其捕獲和檢測。研究發(fā)現(xiàn)，與組氨酸相比，谷氨酸更適合作為磺酰探針的主要親核試劑，即谷氨酸作為堿基催化異構(gòu)化過程。

4 E結(jié)構(gòu)域在NRPs生物合成中的作用

4.1 改變氨基酸構(gòu)象

自然界中氨基酸存在L-AA和D-AA兩種不同的立體異構(gòu)形式，L-AAs通常作為核糖體多肽合成的基本單元，D-AAs則多用于細(xì)胞壁肽聚糖的合成。與核糖體多肽不同，非核糖體多肽通常含有D-AAs， NRPS E結(jié)構(gòu)域通過催化酶結(jié)合的氨?；螂幕?S-Ppant的碳原子去質(zhì)子化和再質(zhì)子化，將L-AA轉(zhuǎn)化為D-異構(gòu)體，參與非核糖體多肽生物合成，使得NRPS能合成含有D-AAs的新型抗癌抗菌類藥物，如來自海洋耐鹽發(fā)光細(xì)菌Staphylococcus aureus S2753生成的含D-Ala的新型NRP環(huán)縮肽Solonamide A和B對金黃色葡萄球菌毒力基因表達(dá)具較強(qiáng)抑制作用[26]。從海綿相關(guān)真菌Aspergillus similanensis KUFA 0013中分離出一種新的NRP環(huán)六肽similanamide （鄰氨基苯甲酸-L-Val-D-Leu-L-Ala-N-methyl-L-Leu-D-哌可酸）具有一定的抗癌活性[27]。Zheng等[28]在曲霉Aspergillus ustus 3.3904基因組中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)oxepinamide類似物的生物合成基因簇，該基因簇合成的一種含有D-Phe、L-Ile、鄰氨基苯甲?；男滦彤a(chǎn)物oxepinamide F可用于治療動脈粥樣硬化、糖尿病等疾病。E結(jié)構(gòu)域的存在極大豐富了非核糖體多肽的種類，使其成為挖掘新抗生素類藥物的重要目標(biāo)。

4.2 調(diào)節(jié)正確中間體的轉(zhuǎn)移

在細(xì)菌NRPS裝配系中，E結(jié)構(gòu)域通常位于含有“通信”結(jié)構(gòu)域（communication-mediating domain， COM）的C末端，它促進(jìn)了酶分子間的有序相互作用和中間體的定向轉(zhuǎn)移。整合在延伸模塊中的E結(jié)構(gòu)域僅在上游縮合作用完成后才異構(gòu)肽基-S-Ppant底物的硫酯化殘基[29]。由于兩種異構(gòu)體之間平衡的調(diào)節(jié)，在與下游結(jié)構(gòu)域縮合之前，D-氨?；螂幕?S-Ppant的排他性易位由下游C結(jié)構(gòu)域的立體選擇性供體位點(diǎn)控制[30]，因此差向異構(gòu)化的時(shí)間是非常重要的。

在標(biāo)準(zhǔn)的NRPS延伸模塊中，氨?；孜锵扰c上游的C結(jié)構(gòu)域縮合，然后才進(jìn)行異構(gòu)化。而起始模塊中由于缺乏上游的C結(jié)構(gòu)域，氨酰基底物直接異構(gòu)化，然后再進(jìn)行縮合。延伸模塊中的E結(jié)構(gòu)域具有一定的底物特異性，它優(yōu)先作用于多肽[31]，下游的C結(jié)構(gòu)域會選擇含有D-AA的肽基作為其縮合反應(yīng)的供體，這使得異構(gòu)化反應(yīng)的時(shí)間受到限制，從而確保了在延伸模塊中其過程不會發(fā)生異常[32]。

Stein等[14]在短桿菌酪肽合成酶B（tyrocidine synthetase B， TycB）重組雙模蛋白TycB2–3-AT·CATE/COMtycA的產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)E結(jié)構(gòu)域更傾向于合成三肽L-Phe-D-Phe-L-Pro，TycB2–3-AT·CAT/EtycA與TycB1-CAT/TEsrf的相互作用，導(dǎo)致過量非必需二肽產(chǎn)物D-Phe-L-Pro-DKP的產(chǎn)生，說明了TycA的E結(jié)構(gòu)域位于多模N-轉(zhuǎn)移酶的C-末端時(shí)會影響S-Ppant中間產(chǎn)物的有序轉(zhuǎn)移，且C-末端氨?；碗幕?E結(jié)構(gòu)域在相互作用和錯(cuò)誤啟動上存在著顯著的功能差異。延伸模塊的E結(jié)構(gòu)域（肽基-E結(jié)構(gòu)域）在一定程度上優(yōu)化肽鍵的形成、異構(gòu)化以及調(diào)控中間轉(zhuǎn)移到下游模塊的進(jìn)程，而起始模塊的E結(jié)構(gòu)域（氨基酰-E結(jié)構(gòu)域）則影響上游縮合并抑制多肽鏈的錯(cuò)誤起始。因此E結(jié)構(gòu)域的選擇對非核糖體肽生物組合工程的成功應(yīng)用具有決定性意義。

4.3 調(diào)控PCP-E結(jié)構(gòu)域連接子

在NRPS組裝的化學(xué)和動力學(xué)研究中，不同結(jié)構(gòu)域間連接子在調(diào)控結(jié)構(gòu)域間的相互作用上起著關(guān)鍵作用，PCP-E連接子區(qū)域便是如此。在Tyc6PCP-C雙結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)中，C結(jié)構(gòu)域與PCP結(jié)構(gòu)域之間的一個(gè)18個(gè)氨基酸組成的肽鏈顯示出相當(dāng)大的構(gòu)象靈活性，最后7個(gè)氨基酸從C結(jié)構(gòu)域解離，并不與這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域相互作用[33]。而PCP-E結(jié)構(gòu)域之間的連接子沿著E結(jié)構(gòu)域的表面形成有序相互作用，其中兩個(gè)殘基對Arg613/Asp788和Arg614/Glu785對于連接子在E結(jié)構(gòu)域上的定位以及PCP結(jié)構(gòu)域在E結(jié)構(gòu)域活性位點(diǎn)隧道的正確定位十分重要。E785R/D788R雙突變可以干擾連接子與E結(jié)構(gòu)域表面的相互作用，證明了連接子區(qū)域在PCP-E雙結(jié)構(gòu)域相互作用中的重要性[23]。關(guān)于PCP結(jié)構(gòu)域與E/C結(jié)構(gòu)域的供體位置相互作用以及E結(jié)構(gòu)域的底物識別和催化等方面的研究尚不透徹，E結(jié)構(gòu)域與連接區(qū)的具體作用還需進(jìn)一步剖析。

5 展望

NRPs的發(fā)現(xiàn)和開發(fā)對制藥、食品、農(nóng)業(yè)和環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域產(chǎn)生了巨大影響。但NRPs不能完全滿足藥代動力學(xué)的需要，且隨著抗生素耐藥性的增強(qiáng)，NRPS的工程化改造，生產(chǎn)改性或新型化合物迫在眉睫。為滿足工業(yè)化需要，人們對NRPS進(jìn)行了一系列改造。Zhang等[34]在利用定向進(jìn)化策略改變A結(jié)構(gòu)域的底物特異性的實(shí)驗(yàn)中成功得到了比野生型催化效率高的突變體。Zobel等[35]重組白僵菌素合成酶、恩鐮孢菌素合成酶和環(huán)縮肽PF1022合成酶的激活模塊獲得了一個(gè)新型環(huán)六肽。Hacker等[36]重新調(diào)節(jié)NRPS通信結(jié)構(gòu)域的相互作用豐富了其產(chǎn)物的長度多樣性。這些操作雖能生成一些預(yù)期的新產(chǎn)物，但由于酶的結(jié)構(gòu)組織中的變化導(dǎo)致了其表達(dá)出現(xiàn)問題。即使成功表達(dá)，與野生型對應(yīng)物相比，新型NRPs的產(chǎn)量也明顯降低或不具備可檢測的活性。因此提高重組NRPS生物合成效率成為NRPS改造工作首要問題。目前C結(jié)構(gòu)域底物特異性和NRPS裝配線高級結(jié)構(gòu)的研究受到廣泛關(guān)注，如何巧妙利用模塊特異性及模塊間相互作用來改造NRPS也是未來研究的重點(diǎn)。而鑒于NRPS系統(tǒng)和產(chǎn)品的多樣性，研究完整NRPS裝配線結(jié)構(gòu)和功能表征亦是重中之重。在NRPs生物合成過程中，E結(jié)構(gòu)域?qū)-AA異構(gòu)化為D-AA，豐富了NRPs的功能和結(jié)構(gòu)多樣性。近年來，對E結(jié)構(gòu)域的催化機(jī)制和結(jié)構(gòu)學(xué)方面的研究已有較好的進(jìn)展，隨著晶體學(xué)的發(fā)展，利用化學(xué)探針和低溫電鏡等手段解析PCP結(jié)構(gòu)域與E結(jié)構(gòu)域供體位點(diǎn)相互作用及其催化狀態(tài)之間的動態(tài)轉(zhuǎn)變將是未來研究的熱點(diǎn)。通過對NRPs延伸過程的操控和對NRPS裝配線精細(xì)加工及模塊間相互作用的研究有助于揭示NRPs結(jié)構(gòu)域間的作用機(jī)理，也對NRPs模塊操作和新型NRPs類藥物的研發(fā)有重要意義。

參 考 文 獻(xiàn)

Wheadon M J， Townsend C A. Evolutionary and functional analysis of an NRPS condensation domain integrates β-lactam， D-amino acid， and dehydroamino acid synthesis[J]. Proc Natl Acad Sci U S A， 2021， 118（17）： e2026017118.

Zipperer A， Konnerth M C， Laux C， et al. Human commensals producing a novel antibiotic impair pathogen colonization[J]. Nature， 2016， 535（7613）： 511-516.

Nikolouli K， Mossialos D. Bioactive compounds synthesized by nonribosomal peptide synthetases and type-I polyketide synthases discovered through genome-mining and metagenomics[J]. Biotechnol Lett， 2012， 34（8）： 1393-1403.

Tavano R， Malachin G， De Zotti M， et al. The peculiar N- and C-termini of trichogin GA IV are needed for membrane interaction and human cell death induction at doses lacking antibiotic activity[J]. Biochim Biophys Acta， 2015， 1848（1）： 134-144.

Jaremko M J， Davis T D， Corpuz J C， et al. Type II nonribosomal peptide synthetase proteins： Structure， mechanism， and protein-protein interactions[J]. Nat Prod Rep， 2020， 37（3）： 355-379.

Bloudoff K， Fage C D， Marahiel M A， et al. Structural and mutational analysis of the nonribosomal peptide synthetase heterocyclization domain provides insight into catalysis[J]. Proc Natl Acad Sci U S A， 2017， 114（1）： 95-100.

Duban M， Cociancich S， Leclère V. Nonribosomal peptide synthesis definitely working out of the rules[J]. Microorganisms， 2022， 10（3）： 577.

Reimer J M， Haque A S， Tarry M J， et al. Piecing together nonribosomal peptide synthesis[J]. Curr Opin Struct Biol， 2018， 49： 104-113.

Allen T W， Andersen O S， Roux B. Structure of gramicidin A in a lipid bilayer environment determined using molecular dynamics simulations and solid-state NMR data[J]. J Am Chem Soc， 2003， 125（32）： 9868-9877.

Süssmuth R D， Mainz A. Nonribosomal peptide synthesis-principles and prospects[J]. Angew Chem Int Ed Engl， 2017， 56（14）： 3770-3821.

Yamada M， Kurahashi K. Adenosine triphosphate and pyrophosphate dependent phenylalanine racemase of Bacillus brevis Nagano[J]. J Biochem， 1968， 63（1）： 59-69.

Stachelhaus T， Marahiel M A. Modular structure of peptide synthetases revealed by dissection of the multifunctional enzyme GrsA[J]. J Biol Chem， 1995， 270（11）： 6163-6169.

Bloudoff K， Schmeing T M. Structural and functional aspects of the nonribosomal peptide synthetase condensation domain superfamily： Discovery， dissection and diversity[J]. Biochim Biophys Acta Proteins Proteom， 2017， 1865（11）： 1587-1604.

Stein D B， Linne U， Hahn M， et al. Impact of epimerization domains on the intermodular transfer of enzyme-bound intermediates in nonribosomal peptide synthesis[J]. Chembiochem， 2006， 7（11）： 1807-1814.

Samel S A， Czodrowski P， Essen L. Structure of the epimerization domain of tyrocidine synthetase A[J]. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr， 2014， 70（5）： 1442-1452.

Keating T A， Marshall C G， Walsh C T， et al. The structure of VibH represents nonribosomal peptide synthetase condensation， cyclization and epimerization domains[J]. Nat Struct Biol， 2002， 9（7）： 522-526.

Stachelhaus T， Walsh C T. Mutational analysis of the epimerization domain in the initiation module PheATE of gramicidin S synthetase[J]. Biochemistry， 2000， 39（19）： 5775-5787.

Chen W H， Li K， Guntaka N S， et al. Interdomain and intermodule organization in epimerization domain containing nonribosomal peptide synthetases[J]. ACS Chem Biol， 2016， 11（8）： 2293-2303.

Stein T， Kluge B， Vater J， et al. Gramicidin S synthetase 1（phenylalanine racemase）， a prototype of amino acid racemases containing the cofactor 4-phosphopantetheine[J]. Biochemistry， 1995， 34（14）： 4633-4642.

Clugston S L， Sieber S A， Marahiel M A， et al. Chirality of peptide bond-forming condensation domains in nonribosomal peptide synthetases： The C5 domain of tyrocidine synthetase is a DCL catalyst[J]. Biochemistry， 2003， 42（41）： 12095-12104.

Luo L， Burkart M D， Stachelhaus T， et al. Substrate recognition and selection by the initiation module PheATE of gramicidin S synthetase[J]. J Am Chem Soc， 2001， 123（45）： 11208-11218.

Shi C， Miller B R， Alexander E M， et al. Design， synthesis， and biophysical evaluation of mechanism-based probes for condensation domains of nonribosomal peptide synthetases[J]. ACS Chem Biol， 2020， 15（7）： 1813-1819.

Miyanaga A， Kurihara S， Chisuga T， et al. Structural characterization of complex of adenylation domain and carrier protein by using pantetheine cross-linking probe[J]. ACS Chem Biol， 2020， 15（7）： 1808-1812.

Kim W E， Patel A， Hur G H， et al. Mechanistic probes for the epimerization domain of nonribosomal peptide synthetases[J]. Chembiochem， 2019， 20（2）： 147-152.

Kim W E， Ishikawa F， Re R N， et al. Developing crosslinkers specific for epimerization domain in NRPS initiation modules to evaluate mechanism[J]. RSC Chem Biol， 2022， 3（3）： 312-319.

Mansson M， Nielsen A， Kj?rulff L， et al. Inhibition of virulence gene expression in Staphylococcus aureus by novel depsipeptides from a marine Photobacterium[J]. Mar Drugs， 2011， 9（12）： 2537-2552.

Prompanya C， Fernandes C， Cravo S， et al. A new cyclic hexapeptide and a new isocoumarin derivative from the marine sponge-associated fungus Aspergillus similanensis KUFA 0013[J]. Mar Drugs， 2015， 13（3）： 1432-1450.

Zheng L， Wang H， Fan A， et al. Oxepinamide F biosynthesis involves enzymatic d-aminoacyl epimerization， 3H-oxepin formation， and hydroxylation induced double bond migration[J]. Nat Commun， 2020， 11（1）： 4914.

Linne U， Marahiel M A. Control of directionality in nonribosomal peptide synthesis： Role of the condensation domain in preventing misinitiation and timing of epimerization[J]. Biochemistry， 2000， 39（34）： 10439-10447.

Belshaw P J， Walsh C T， Stachelhaus T. Aminoacyl-CoAs as probes of condensation domain selectivity in nonribosomal peptide synthesis[J]. Science， 1999， 284（5413）： 486-489.

Stein D B， Linne U， Marehiel M A. Utility of epimerization domains for the redesign of nonribosomal peptide synthetases[J]. FEBS J， 2005， 272（17）： 4506-4520.

Luo L， Kohli R M， Onishi M， et al. Timing of epimerization and condensation reactions in nonribosomal peptide assembly lines： Kinetic analysis of phenylalanine activating elongation modules of tyrocidine synthetase B[J]. Biochemistry， 2002， 41（29）： 9184-9196.

Samel S A， Schoenafinger G， Knappe T A， et al. Structural and functional insights into a peptide bond-forming bidomain from a nonribosomal peptide synthetase[J]. Structure， 2007， 15（7）： 781-792.

Zhang K， Nelson K M， Bhuripanyo K， et al. Engineering the substrate specificity of the DhbE adenylation domain by yeast cell surface display[J]. Chem Biol， 2013， 20（1）： 92-101.

Zobel S， Boecker S， Kulke D， et al. Reprogramming the biosynthesis of cyclodepsipeptide synthetases to obtain new enniatins and beauvericins[J]. Chembiochem， 2016， 17（4）： 283-287.

Hacker C， Cai X， Kegler C， et al. Structure-based redesign of docking domain interactions modulates the product spectrum of a rhabdopeptide-synthesizing NRPS[J]. Nat Commun， 2018， 9（1）： 4366.