陶靜 李黎 廖蓉惠 涂娜 沈雪

摘要：目的 制備以人血清白蛋白（human serum albumin， HSA）和透明質(zhì)酸（hyaluronic acid， HA）為載體，負載抗腫瘤藥物阿霉素（doxorubicin， DOX）的納米粒子，對納米粒制備處方進行優(yōu)化，并對制劑進行質(zhì)量評價，初步考察納米粒的體外抗腫瘤效果。方法 采用去溶劑-交聯(lián)法制備得到負載阿霉素的白蛋白透明質(zhì)酸納米粒子（DOX-HSA-HA NPs），并利用Box-Behnken Design響應(yīng)面優(yōu)化篩選最優(yōu)處方，采用透射電鏡、激光粒度儀對納米粒的形貌和粒徑進行考察，并考察納米粒的體外釋放效果及體外溶血情況，最后通過細胞毒性實驗初步考察納米粒的體外抗腫瘤效果。結(jié)果 按優(yōu)化條件制得的DOX-HSA-HA NPs透射電鏡下呈球形，分布均一，粒徑為（213.39±0.79） nm， PDI值為0.062±0.012，Zeta電位為-25.53 mV，包封率達88.85%，載藥量達2.06%；體外釋放結(jié)果表明，在pH 6.8和pH 7.4條件下DOX-HSA-HA NPs具有緩釋效果，加入透明質(zhì)酸酶之后，DOX的釋放量增加；溶血性實驗表明，納米載體材料HSA-HA NPs無溶血風(fēng)險，可用于靜脈注射給藥；體外細胞實驗表明，空白載體對細胞基本無毒性，相比于DOX-HSA NPs， DOX-HSA-HA NPs對小鼠乳腺癌4T1細胞的細胞毒性增強。結(jié)論 采用去溶劑-交聯(lián)法制得的DOX-HSA-HA NPs分布均勻，包封率高，具有明顯的緩釋作用和增強的細胞毒性。

關(guān)鍵詞：人血清白蛋白；透明質(zhì)酸；阿霉素；納米粒；體外抗腫瘤

中圖分類號：R978.1 ?文獻標(biāo)志碼：A

Preparation and evaluation of albumin and hyaluronic acid nanoparticles loaded with doxorubicin

Tao Jing， Li Li， Liao Ronghui， Tu Na， and Shen Xue

（Antibiotics Research and Re-evaluation Key Laboratory of Sichuan Province， Sichuan Industrial Institute of Antibiotics， School of Pharmacy， Chengdu University， Chengdu 610106）

Abstract ? ?Objective In order to improve the efficiency of cancer treatment， doxorubicin（DOX）-loaded Human Serum Albumin（HSA） and Hyaluronic acid（HA） nanoparticles（abbreviated as DOX-HSA-HA NPs） were prepared and optimized. Then， the drug properties and antitumor activity were evaluated. Methods The DOX-HSA-HA NPs was prepared by the solvent removal and crosslinking method. Then， the Box-Behnken design response surface methodology was used to optimize the initial prescription. In addition， the morphology of the nanoparticles was investigated by transmission electron microscope（TEM）， and the size distribution of the nanoparticles was determined by ZetaPlus particle size and zeta potential analyzer. Moreover， the release behavior of the nanoparticles in vitro was investigated by dialysis， and the hemolysis in vitro was investigated using healthy rats. Finally， the anti-tumor effect of the nanoparticles in vitro was preliminarily investigated by cytotoxicity assays. Results The DOX-HSA-HA NPs prepared under the optimized conditions were spherical and uniformly distributed， with a particle size of （213.39 ± 0.79） nm， a PDI of 0.062 ± 0.012， and a Zeta potential of -25.53 mV. The encapsulation rate and drug loading capacity of DOX were 88.85% and 2.06%. In vitro release results showed that DOX-HSA-HA NPs had a sustained release effect at pH 6.8 and pH 7.4， and the DOX release rate increased when treated with hyaluronidase. The hemolytic test showed that the nanocarrier materials HSA-HA NPs were safe and non-toxic， and were suitable for intravenous administration. Cytotoxicity assay showed that HSA-HA NPs were nontoxic to 4T1 cells（mouse breast cancer cells）， and DOX-HSA-HA NPs were more cytotoxic to 4T1 cells than DOX-HSA NPs. ?Conclusion The DOX-HSA-HA NPs prepared by the solvent removal and crosslinking method exhibited uniform particle size and size distribution， high encapsulation efficiency， a sustained drug release behavior， and showed enhanced cytotoxicity.

Key words ?Human serum albumin（HSA）; Hyaluronic acid（HA）; Doxorubicin（DOX）; Nanoparticles（NPs）; Anti-tumor in vitro

阿霉素（doxorubicin， DOX）是一種抗腫瘤類抗生素，抗瘤譜廣，可用于乳腺癌、肝癌、膀胱癌等多種癌癥的治療[1]。然而，由于DOX對腫瘤細胞缺乏靶向性，其進入血液循環(huán)后非特異性分布的特點造成了許多不良反應(yīng)，如心臟毒性、骨髓抑制、粘膜炎和脫發(fā)等限制了阿霉素的臨床應(yīng)用[2-3]。

納米載藥系統(tǒng)是一種新型的載藥體系，是一種具有特定功能的新物質(zhì)[4]，在包載化療藥物、多肽和蛋白藥物、基因藥物等方面具有很大的潛力。采用納米粒包載藥物，能提高藥物靶向性，減少毒副作用[5-6]。

白蛋白（albumin）是一種天然蛋白，來源廣泛，種類繁多，其中人血清白蛋白（human serum albumin， HSA）是一種廣泛應(yīng)用的載體[7]，研究發(fā)現(xiàn)，將藥物包載于HSA納米粒中，能降低巨噬細胞對納米粒的親和力，避免藥物被清除，延長藥物體內(nèi)循環(huán)[8]。HSA相對分子質(zhì)量約為665000，HSA三級結(jié)構(gòu)存在兩個藥物高親和力結(jié)合位點，位點I和II分別位于白蛋白的疏水空腔，藥物在該位點的結(jié)合主要通過疏水相互作用、靜電相互作用和氫鍵作用實現(xiàn)[9-10]。因此，HSA作為一種天然載體可與多種藥物結(jié)合，實現(xiàn)藥物的高效負載。研究證實，多種腫瘤細胞過表達分泌蛋白SPARC，白蛋白首先通過腫瘤血管內(nèi)皮細胞表達的gp60受體（一種分子量為60 kDa的糖蛋白）介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進入腫瘤間質(zhì)，隨后與腫瘤細胞過表達的分泌蛋白SPARC結(jié)合，促使包載藥物的白蛋白納米粒富集在腫瘤細胞中，提高藥物對腫瘤組織的靶向性[11-12]。因此可以利用細胞膜上白蛋白受體跨膜轉(zhuǎn)運機制，將藥物靶向運輸?shù)侥[瘤組織部位。

為了進一步提高納米制劑的靶向腫瘤能力和腫瘤內(nèi)部穿透能力，可將白蛋白與一些具有靶向能力以及能被特異性酶觸發(fā)降解的物質(zhì)結(jié)合來制備納米制劑。透明質(zhì)酸（hyaluronic acid， HA）作為一種內(nèi)源性大分子，具有相容性好、無免疫原性、生物可降解性等優(yōu)點。HA可被腫瘤區(qū)域豐富的透明質(zhì)酸酶（hyaluronidase， HAase） 降解，特別是在高轉(zhuǎn)移性腫瘤內(nèi)[13-14]。因此，利用透明質(zhì)酸構(gòu)建納米顆粒，能夠獲得腫瘤特異性透明質(zhì)酸酶敏感的納米粒，當(dāng)納米粒到達腫瘤部位，被透明質(zhì)酸酶降解，使部分藥物釋放，同時大粒徑的納米粒結(jié)構(gòu)改變，轉(zhuǎn)變?yōu)樾×降募{米粒，進一步深入滲透到腫瘤內(nèi)部，使藥物達到腫瘤深部穿透的效果。由于HA具有親水性，因此在納米粒子表面可以形成一親水性層，從而保護納米粒免受調(diào)理素的破壞，延長納米粒的血液循環(huán)時間[15]。細胞表面受體CD44在腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移過程具有調(diào)節(jié)作用，其在多種腫瘤細胞上高表達，研究證明，HA可與CD44受體特異性結(jié)合，使基于透明質(zhì)酸的納米粒具有對腫瘤細胞主動靶向的能力[16-17]。因此，將透明質(zhì)酸制備成納米粒，可賦予納米載體具有CD44介導(dǎo)的主動靶向能力、透明質(zhì)酸酶觸發(fā)的藥物釋放增多、藥物進一步滲透到腫瘤深處部位等優(yōu)點，達到延長藥物作用時間、提高治療效果的目的。

因此，本實驗將HSA和HA聯(lián)合構(gòu)建納米載體并負載抗腫瘤藥物DOX，得到負載阿霉素的白蛋白透明質(zhì)酸納米粒子（DOX-HSA-HA NPs），以期增加DOX的靶向性，減少毒副作用，并增強抗腫瘤效果。

1 儀器及試藥

1.1 藥品與試劑

阿霉素（批號MB1087-1，純度＞98%）、透明質(zhì)酸（批號MB3113-1，含量＞95%） 購自大連美侖生物技術(shù)；人血清白蛋白（批號S20113010、濃度為25%） 購自成都蓉生藥業(yè)；戊二醛（純度25%）、透明質(zhì)酸酶購自上海泰坦科技；氫氧化鈉購自成都科龍化工試劑；丙酮購自成都市科隆化學(xué)品；細胞培養(yǎng)基、胰酶購自Gibco公司；CCK-8試劑盒、MTT試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)。

1.2 儀器

CPA225D型十萬分之一電子天平（德國 Sartorius公司）；DF-101S型磁力攪拌器（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；UV-2450紫外分光光度計（Kyoto Japan）；ZEN3600納米激光粒度儀（英國Malvern公司）；TGL-22S型高速冷凍離心機（四川蜀科儀器有限公司）；HT7700低壓透射電鏡（日本Hitachi公司）；THZ-92A恒溫振蕩器（上海博訊實業(yè)有限公司）；BPN-150CN（UV）二氧化碳培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；ELx800酶標(biāo)儀（BioTek公司）；SW-CJ-2D超凈工作臺（濟南森亞實驗儀器有限公司）；Axioscope 5熒光顯微鏡（上海卡爾蔡司）。

1.3 細胞

小鼠乳腺癌細胞4T1細胞：來源于四川抗菌素工業(yè)研究所。

2 方法與結(jié)果

2.1 DOX-HSA-HA NPs的制備

本試驗采用去溶劑化-交聯(lián)法[18]制備DOX-HSA-HA NPs。精密量取20%的HSA（10 mg/50 mL） 適量，取超純水稀釋，得到濃度為2%的HSA溶液，用0.1 mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH到8，另精密稱取6 mg的DOX和25 mg的HA，溶于10 mL的HSA溶液中，充分攪拌0.5 h，使藥物充分溶解混合，快速攪拌狀態(tài)下以1 mL/min的速度滴加丙酮，至HSA溶液出現(xiàn)渾濁，停止滴加丙酮，繼續(xù)攪拌0.5 h，加入5%的戊二醛250 μL交聯(lián)2 h，最后真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶劑，離心純化除去多余的戊二醛等，得到DOX-HSA-HA NPs。

2.2 DOX分析方法的建立

2.2.1 紫外檢測方法

精密稱取一定量的DOX樣品，超純水溶解后定容，得到1 mg/mL的DOX儲備液，4 ℃避光保存。儲備液用超純水稀釋，得到一定濃度的DOX溶液，紫外全波長掃描，記錄其吸收圖譜，在480 nm處出現(xiàn)吸收峰，作為DOX的測定波長。

2.2.2 DOX標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密量取DOX儲備液，用超純水稀釋，分別得到濃度為10、20、30、40、50和60 μg/mL的一系列溶液，于波長480 nm處測定其吸光值A(chǔ)，以吸光值A(chǔ)和濃度C作圖，進行線性回歸分析，得到回歸方程為Y=0.0156X+0.0139（R2=0.9992、n=6），結(jié)果表明DOX在濃度10～60 μg/mL范圍之間線性關(guān)系良好。

2.2.3 專屬性試驗

分別取對照儲備液（1 mg/mL DOX）、供試品溶液（DOX-HSA-HA NPs）、空白納米溶液（HSA-HA NPs），稀釋到一定濃度，進行全波長掃描，記錄其特征吸收峰。結(jié)果見圖1，HSA和HA對DOX的測定無干擾，表明在波長480 nm下測定DOX專屬性良好。

2.2.4 精密度試驗

取10 mL容量瓶，加入一定量的DOX儲備液，超純水稀釋定容，得到濃度為30 μg/mL的DOX溶液，于波長480 nm處連續(xù)測定吸收值，重復(fù)6次，計算RSD值，結(jié)果為0.95%，表明精密度良好。

2.2.5 重復(fù)性試驗

精密吸取一定量的DOX-HSA-HA NPs于10 mL容量瓶中，加甲醇超聲破乳，定容，得到濃度約為30 μg/mL的DOX溶液，過0.22 μm微孔濾膜，續(xù)濾液在紫外480 nm下測定吸收值，重復(fù)6次，計算RSD值，結(jié)果為0.37%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.6 DOX-HSA-HA NPs包封率和載藥量的測定

采用低溫高速離心法測定包封率和載藥量。精密吸取1 mL的DOX-HSA-HA NPs，在轉(zhuǎn)速15000 r/min、溫度4 ℃條件下離心15 min，取上清液過0.22 μm濾膜，續(xù)濾液于紫外480 nm下測定吸收值，計算游離藥物的量。采用超聲破乳法測定樣品中總藥物量，吸取1 mL的DOX-HSA-HA NPs，加入適量甲醇，420 W的功率下超聲30 min，紫外480 nm下測定吸收值，計算DOX-HSA-HA NPs中DOX藥物的總量，包封率及載藥量計算公式如下：

包封率=（W總藥-W游離）/W總藥×100% ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? （1）

載藥量=（W總藥-W游離）/（W總藥-W游離+W載體）×100% ? ? ? ? ? ? （2）

其中W游離為游離藥物的質(zhì)量，W總藥為總藥物質(zhì)量，W載體為空白載體的質(zhì)量

通過最優(yōu)處方條件下制得納米粒樣品，根據(jù)低溫高速離心法測得包封率為88.85%，載藥量為2.06%。

2.2.7 冷凍高速離心回收率實驗

取9個10 mL容量瓶，分別加入適量空白納米載體，再分別吸取0.24、0.30和0.36 mL的DOX儲備液，超純水定容，分別得到低、中、高（80%、100%、120%）3種濃度的DOX溶液，每個濃度平行3組。4 ℃、15000 r/min條件下離心15 min，取上層清液，紫外480 nm下測定吸收值，計算回收率及RSD值，結(jié)果表明，3種濃度的DOX的回收率均在98%～102%之間，并且RSD值均小于2%，表明冷凍高速離心方法的回收率良好，該方法可用于包封率和載藥量的測定。

2.3 納米粒處方的優(yōu)化

2.3.1 BOX-Behnken Design 優(yōu)化處方

通過前期單因素實驗，優(yōu)化納米粒的處方工藝，選擇HA濃度（A）、HSA濃度（B）、HSA的pH值（C）3個因素，設(shè)計3個水平，以包封率作為響應(yīng)值，使用Box-Behnken Design對納米粒制備處方進行響應(yīng)面優(yōu)化分析，篩選最優(yōu)處方，設(shè)計因素水平見表1。通過表1進行試驗設(shè)計，結(jié)果見表2。

2.3.2 響應(yīng)面優(yōu)化分析

利用Design-expert軟件對表2數(shù)據(jù)進行擬合，得到最優(yōu)擬合方程，該方程式為：包封率=85.68+2.21A-0.66B+9.35C+1.36AB+3.53AC-0.76BC-12.95A2-17.00B2-19.67C2，模型：P＜0.05，具有顯著性差異（P＜0.05），失擬項：P=0.0589，無顯著性差異（P＞0.05），表明該方程擬合充分，該模型可用于篩選確定DOX-HSA-HA NPs的最優(yōu)處方制備條件[19]。

通過Design-expert軟件得到3個影響因素之間的交互3D作用曲面圖，分析不同影響因素對納米粒包封率的影響，結(jié)果如圖2所示，隨著HSA的濃度、pH值和HA濃度的增加，包封率呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，對各因素進行預(yù)測，得到最優(yōu)處方值為HA濃度2.56 mg/mL、HSA濃度1.99%、HSA的pH值為8.26，預(yù)測包封率為86.97%。

2.3.3 處方驗證

根據(jù)“2.3.2”下得到的響應(yīng)面優(yōu)化最佳處方條件，平行制備3批DOX-HSA-HA NPs樣品，通過高速離心法測定包封率，其平均包封率為88.85%，與軟件預(yù)測值相近，證明模型擬合成功，可用于DOX-HSA-HA NPs的處方優(yōu)化分析，結(jié)果可靠。

2.4 納米粒質(zhì)量評價

2.4.1 表面形態(tài)觀察

采用透射電子顯微鏡（TEM） 觀察DOX-HSA-HA NPs的形貌及分布。采用磷鎢酸負染法制備樣品，取適量DOX-HSA-HA NPs溶液，滴加至銅網(wǎng)上，放置15 min，再次滴加適量磷鎢酸鈉負染液，放置5 min，TEM下觀察納米粒子的形貌，結(jié)果見圖3。結(jié)果表明，DOX-HSA-HA NPs外觀光滑且均勻分布，呈球形粒子，粒徑與激光粒度儀測得值相近。

2.4.2 粒徑及電位

取優(yōu)化處方后的DOX-HSA-HA NPs，超純水稀釋，于激光粒度儀下測量粒徑、Zeta電位、PDI，記錄數(shù)據(jù)，結(jié)果見圖4～5，DOX-HSA-HA NPs的粒徑為（213.39±0.79） nm，PDI為0.062±0.012，Zeta電位為-23.53 mV。

2.4.3 體外釋放

采用透析法考察不同pH條件下DOX-HSA-HA NPs的釋放行為。分別選用pH 7.4和pH 6.8的磷酸鹽緩沖液作為釋放介質(zhì)，分別模擬正常組織以及腫瘤弱酸性微環(huán)境條件[20]。分別吸取DOX儲備液和DOX-HSA-HA NPs溶液2 mL于3000 K透析袋中，將兩端扎緊，避免溶液滲漏，置于40 mL的pH 7.4的磷酸鹽緩沖液中，平行3組，100 r/min、37 ℃條件下震蕩，于不同時間點取樣，并補充同體積的介質(zhì)。在波長480 nm處測定取樣介質(zhì)中DOX濃度，計算釋放藥物量。同上考察游離DOX和納米粒在pH 6.8介質(zhì)中的釋放。為了考察透明質(zhì)酸酶對納米粒中透明質(zhì)酸的降解作用，在pH 6.8條件下，將透明質(zhì)酸酶（150 U/mL）與納米粒子共同孵育，考察其體外釋放能力，以累積釋放率（Q/%） 為縱坐標(biāo)，取樣時間點（t/h） 為橫坐標(biāo)，分別繪制游離DOX和納米粒中DOX的釋放曲線，見圖6，在2種釋放介質(zhì)中，游離DOX在8 h后可基本釋放完全，DOX-HSA-HA NPs無明顯突釋現(xiàn)象，72 h后釋放率可達到50%，具有明顯的緩釋效果，在HAase的作用下，DOX釋放增加，可能是由于納米粒中的HA被HAase降解成低聚糖，并進一步降解為單糖及其衍生物，導(dǎo)致納米粒結(jié)構(gòu)部分崩解，使得DOX的累積釋放增加，72 h后釋放可達到80%[21]。

2.4.4 體外溶血性實驗

為考察納米粒的靜脈注射安全及可行性，對納米粒進行體外溶血性試驗考察。取健康 SD大鼠血0.5 mL，加入生理鹽水稀釋，置于離心管中，1500 r/min條件下離心3 min，多次清洗，得到紅細胞沉淀，加入生理鹽水混勻，4 ℃冰箱放置備用。

將不同濃度的DOX-HSA-HA NPs按照一定的體積比和紅細胞在37 ℃條件下孵育2 h，同時設(shè)置生理鹽水作陰性對照組（無裂解組），超純水作陽性對照組（100%裂解組），取出，3000 r/min條件下，離心4 min，540 nm處測定上清液的吸光值A(chǔ)，計算溶血率：

溶血率%=（A樣-A陰） /（A陽-A陰） ×100% ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?（3）

A樣 表示DOX-HSA-HA NPs樣品的吸光度值、A陽表示超純水組的吸光度值、A陰表示生理鹽水組的吸光度值。

體外溶血性實驗結(jié)果如圖7所示，離心之后，陽性對照組的紅細胞完全破裂，出現(xiàn)全溶血現(xiàn)象，陰性對照組和各樣品組紅細胞完整并沉積在底部，未出現(xiàn)溶血現(xiàn)象和凝集現(xiàn)象。已有文獻報道，當(dāng)溶血率≤5%時，表明無溶血作用，可以用于靜脈注射[22]，根據(jù)公式計算，DOX-HSA-HA NPs在各濃度下的溶血率均小于5%，與肉眼觀察結(jié)果一致，表明DOX-HSA-HA NPs無明顯溶血，可適用于靜脈注射給藥。

2.5 體外抗瘤效果實驗

已有文獻報道小鼠乳腺癌4T1細胞高表達CD44受體[23-24]，因此選取4T1細胞進行體外毒性試驗。細胞經(jīng)胰酶消化后離心，加入細胞培養(yǎng)基稀釋混勻，再以8000個/孔的密度接種于96孔板上，于CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h。

取離心純化后的HSA-HA NPs，DOX-HSA-HA NPs，DOX-HSA NPs分散于一定量的生理鹽水中，另精密稱取一定量的DOX原料藥，生理鹽水溶解。

用細胞培養(yǎng)液將上述樣品稀釋至不同濃度，每個濃度平行3次，每孔200 μL，加入到96孔板中，同時設(shè)置空白組（只加培養(yǎng)液）、對照組（只加細胞）、樣品組包括游離DOX組、DOX-HSA NPs組、DOX-HSA-HA NPs組、DOX-HSA-HA NPs+HA組（預(yù)先將2 mg/mL的HA與4T1細胞孵育2 h，競爭結(jié)合CD44受體）。加入樣品后繼續(xù)孵育24 h，再棄去舊培養(yǎng)基，并用PBS清洗一次，加入CCK-8稀釋液，在450 nm下測定樣品A值，計算細胞存活率，其體外抗腫瘤活性結(jié)果如圖8所示。

細胞存活率% =（A樣品-A空白） /（A對照-A空白）×100%（4）

如圖8A所示，濃度為0～400 μg/mL的空白納米載體HSA-HA NPs與4T1細胞作用24 h后，細胞存活率均高于90%，表明HSA-HA NPs生物相容性良好，可以作為一種安全的載體用于遞送藥物。

如圖8B所示，在1～20 μg/mL的DOX濃度范圍內(nèi)，隨著DOX濃度的增加，游離DOX和負載DOX的納米粒子與4T1細胞孵育24 h后，細胞的存活率逐漸降低，表明游離DOX和負載DOX的納米粒子的抗腫瘤活性逐漸增強，且具有DOX濃度依賴性，當(dāng)DOX濃度為20 μg/mL時，DOX-HSA-HA NPs的細胞存活率為32.34%，而預(yù)先加HA競爭CD44受體后DOX-HSA-HA NPs組的細胞存活率為42.35%，沒有HA靶向載體的DOX-HSA NPs組的細胞存活率為40.97%，游離DOX組的細胞存活率為36.35%；關(guān)于預(yù)先加HA競爭CD44受體后處理組（DOX-HSA-HA NPs+HA），在各個治療濃度，其抗腫瘤效果與DOX-HSA NPs治療組無明顯差異，原因是加HA競爭結(jié)合CD44受體后，DOX-HSA-HA NPs的主動靶向能力減弱，而DOX-HSA NPs中無HA載體，也就沒有增強的主動靶向能力，因此，這兩組的治療效果沒有明顯的差異；一般地，在同一濃度下，游離DOX的抗腫瘤活性相較于納米處理組（DOX-HSA NPs組、DOX-HSA-HA NPs組、DOX-HSA-HA NPs+HA組）更強，可能是由于納米粒呈現(xiàn)出緩釋的效果，在經(jīng)過內(nèi)吞作用進入腫瘤細胞后，藥物緩慢持續(xù)釋放，經(jīng)過一定的釋放時間后才會到達最高濃度，而游離藥物進入細胞后無緩釋現(xiàn)象，則是直接到達最高濃度，從而使得游離藥物抗腫瘤活性更高[25-26]；此外，預(yù)先加入HA競爭結(jié)合CD44受體處理組（DOX-HSA-HA NPs+ HA）的細胞存活率高于DOX-HSA-HA NPs處理組，并且，與DOX-HSA NPs相比，DOX-HSA-HA NPs處理的細胞存活率更低，表明DOX-HSA-HA NPs的抗腫瘤活性更強，這些結(jié)果證明HA的加入可以增強納米粒子的主動靶向能力，使載藥納米粒子更多地聚集到腫瘤部位，減少毒副作用，達到更好的治療效果。

2.6 細胞內(nèi)吞考察

由于HA能與腫瘤細胞受體CD44特異性結(jié)合，因此進一步增加了納米粒的主動靶向性。為了考察并驗證加入HA后的主動靶向性，選用4T1細胞進行細胞內(nèi)吞試驗，并且由于阿霉素具有自發(fā)熒光，因此通過細胞內(nèi)吞熒光圖來進一步考察DOX-HSA-HA NPs的主動靶向腫瘤性。細胞經(jīng)胰酶消化后離心，加入細胞培養(yǎng)基稀釋混勻，再以8000個/孔的密度接種于96孔板上，于CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h。

取離心純化后的DOX-HSA-HA NPs，DOX-HSA NPs分散于一定量的生理鹽水中，另精密稱取一定量的DOX原料藥，生理鹽水溶解。

用細胞培養(yǎng)液將上述樣品稀釋至DOX濃度為 ? 5 μg/mL，平行3組，每孔200 μL，加入到96孔板中，樣品組包括游離DOX組、DOX-HSA NPs組、DOX-HSA-HA NPs組、DOX-HSA-HA NPs+HA組（預(yù)先將2 mg/mL的HA與4T1細胞孵育2 h，競爭結(jié)合CD44受體）。細胞孵育12 h后棄去舊培養(yǎng)基，PBS清洗后用DAPI復(fù)染核15 min，PBS清洗，在熒光顯微鏡下拍攝并記錄內(nèi)吞情況，結(jié)果如圖9所示。結(jié)果表明，在相同DOX濃度下，與不加HA載體材料的DOX-HSA NPs組相比，在納米粒中加入HA載體材料后，DOX-HSA-HA NPs在腫瘤細胞的內(nèi)吞攝取進一步增加，細胞內(nèi)熒光強度明顯增強，并且，在預(yù)先加HA競爭性結(jié)合腫瘤細胞上CD44受體組，其熒光強度相較于DOX-HSA-HA NPs組降低，證明了HA在增強納米粒主動靶向性方面的能力。此外，在游離DOX組，熒光分布與細胞核熒光重合，是因為DOX內(nèi)吞進入細胞后，摻入到細胞核中DNA堿基對中，因此其熒光分布與細胞核重合，而DOX-HSA-HA NPs由于藥物具有緩釋效果，因此，在相同時間內(nèi)，納米粒中的DOX比游離DOX進入細胞核的速度更慢，而在細胞質(zhì)中也有部分存在，因此，從熒光顯微圖中觀察到納米粒的熒光同時存在細胞質(zhì)和細胞核中。這些結(jié)果證明了隨著HA的加入，賦予了納米粒主動靶向腫瘤的能力，有望進一步增加治療效果。

3 結(jié)論

本文以DOX為模型藥物，以HSA和HA為載體，通過去溶劑-交聯(lián)法成功制備得到HSA和HA負載DOX的DOX-HSA-HA NPs。前期通過單因素實驗，初步優(yōu)化處方，發(fā)現(xiàn)HA的濃度、HSA的濃度、HSA的pH值對載藥納米粒中DOX的包封率影響較大，采用Box-Behnken Design法優(yōu)化處方條件，確定最佳制備處方。透析法考察藥物的體外釋放行為，相比于游離DOX，納米粒具有明顯緩釋效果，再加入HAase孵育組，納米粒中藥物釋放更快，證明了HAase可降解納米粒中的HA，使納米粒結(jié)構(gòu)部分崩解，藥物釋放更多。體外溶血實驗表明，納米粒子無明顯溶血性，可以用于靜脈注射給藥。體外細胞毒性實驗結(jié)果表明，空白納米載體HSA-HA NPs對4T1細胞無明顯毒性，表明HSA-HA NPs的生物相容性較好，可作為一種安全無毒的納米載體用以負載藥物。同一藥物濃度下，與DOX-HSA NPs相比，DOX-HSA-HA NPs的抗腫瘤活性更強，細胞內(nèi)吞能力更強，揭示HA賦予了納米粒的主動靶向性。

根據(jù)資料研究，普通阿霉素注射劑的用量為一次50～60 mg，但在使用過程中，會發(fā)生諸如心臟毒性，血小板和白細胞減少等毒副作用。目前經(jīng)FDA已批準(zhǔn)上市的阿霉素脂質(zhì)體（Doxil?），其包封率約為90%，一次性劑量為20 mg，相比于普通的阿霉素注射劑來說，臨床用量明顯減少。本試驗所制得的阿霉素白蛋白透明質(zhì)酸納米粒包封率為88.85%，符合中國藥典要求，且與市售阿霉素脂質(zhì)體的包封率接近，在臨床應(yīng)用上，可參考阿霉素脂質(zhì)體，其用量也會大幅少于普通的阿霉素注射劑，并且，本研究所制得的納米粒，在透明質(zhì)酸的主動靶向作用下，可以提高抗腫瘤效果，因此使用劑量也會進一步減少。本研究為制備一種低毒副作用、高效新型DOX納米制劑提供了一定的研究思路和實驗基礎(chǔ)。

參 考 文 獻

Karsten U， Martin M， Florian R， et al. Interaction of folate-conjugated human serum albumin（HSA） nanoparticles with tumour cells[J]. Int J Pharm， 2011， 406（1-2）： 128-134.

李昀松， 蘇婷婷， 蔣銀， 等. 阿霉素與姜黃素聯(lián)合給藥的制劑新策略及其給藥系統(tǒng)研究[J]. 中國抗生素雜志， 2014， 39（4）： 294-300.

Ma H S， Yang X Q， Ke J， et al. Smart assembled human serum albumin nanocarrier enhanced breast cancer treatment and antitumor immunity by chemo-photothermal therapy[J]. ACS Biomater Sci Eng， 2020， 6（5）： 3217-3229.

張金霞， 李楠， 李曉琴， 等. 以蛋白質(zhì)為載體的納米制劑質(zhì)量研究進展[J]. 中國新藥雜志， 2021， 30（4）： 333-338.

Lambert G， Fattal E， Couvreur P. Nanoparticulate systems for the delivery of antisense oligonucleotides[J]. Adv Drug Deliv Rev， 2001， 47（1）： 99-112.

Müller R H， Jacobs C， Kayser O. Nanosuspensions as particulate drug formulations in therapy. Rationale for development and what we can expect for the future[J]. Adv Drug Deliv Rev， 2001， 47（1）： 3-19.

付永莉， 謝向陽， 羅婷. 伊曲康唑白蛋白納米?；鞈乙旱闹苽渑c體外評價[J]. 中國抗生素雜志， 2018， 43（2）： 216-222.

陳行， 許幼發(fā)， 武鑫， 等. 白蛋白納米粒制備工藝及表面修飾研究進展[J]. 中國新藥雜志， 2021， 30（16）： 1477-1482.

Kragh-Hansen U， Chuang V， Otagiri M. Practical aspects of the ligand-binding and enzymatic properties of human serum albumin[J]. Biol Pharm Bull， 2002， 25（6）： 695.

Larsen M T， Kuhlmann M， Hvam M L， et al. Albumin-based drug delivery： Harnessing nature to cure disease[J]. Mol Cell Ther， 2016， 4（1）： 1-12.

潘英， 倪海華， 鄒愛峰， 等. 紫杉醇納米粒作為藥物遞送載體的研究[J]. 中國抗生素雜志， 2013， 38（11）： 853-858.

Chen B， He X Y， Yi X Q， et al. Dual-peptide-functionalized albumin-based nanoparticles with ph-dependent self-assembly behavior for drug delivery[J]. ACS Appl Mater Interfaces， 2015， 7（28）： 15148-15153.

Hu C， Cun X L， Ruan S B， et al. Enzyme-triggered size shrink and laser-enhanced NO release nanoparticles for deep tumor penetration and combination therapy[J]. Biomaterials， 2018， 168： 64-75.

馬哲， 吳超， 陳健. 透明質(zhì)酸功能化MCM-41型介孔二氧化硅包載紫杉醇納米粒對體外SMMC-7721肝癌細胞作用研究[J]. 中國藥學(xué)雜志， 2019， 54（2）： 110-116.

Bencherif S A， Srinivasan A， Horkay F， et al. Influence of the degree of methacrylation on hyaluronic acid hydrogels properties[J]. Biomaterials， 2008， 29（12）： 1739-1749.

Bartolazzi A， Peach R， Aruffo A， et al. Interaction between CD44 and hyaluronate is directly implicated in the regulation of tumor development[J]. J Exp Med， 1994， 180（1）： 53-66.

陶勝巖， 王梅， 翟光喜. 基于透明質(zhì)酸的刺激響應(yīng)納米給藥系統(tǒng)的研究進展[J]. 中國新藥與臨床雜志， 2021， 40（5）： 330-335.

方奕巍， 尹宗寧. 透明質(zhì)酸修飾的白蛋白納米粒的制備及抗腫瘤作用的初步評價[J]. 四川大學(xué)學(xué)報， 2011， 42（4）： 480-484，502.

劉喜陽， 羅玉瑩， 鄧盛齊， 等. 人血清白蛋白修飾的鹽酸伊立替康PLGA納米粒的制備與評價[J]. 中國藥學(xué)雜志， 2021， 56（21）： 1740-1748.

Liu J J， Luo Z， Zhang J X， et al. Hollow mesoporous silica nanoparticles facilitated drug delivery via cascade pH stimuli in tumor microenvironment for tumor therapy[J]. Biomaterials， 2016， 83： 51-65.

Ma J B， Shen J M， Yue T， et al. Size-shrinkable and protein kinase cα-recognizable nanoparticles for deep tumor penetration and cellular internalization[J]. Eur J Pharm Sci， 2020， 159： 105693.

Huang W Z， Cai Z F， Zhang Q M. Study on spectrophometry determination of Injection hemolysis[J]. Pharm Today， 2016， 26（10）： 713-716.

Song S S， Qi H， Xu J W， et al. Hyaluronan-based nanocarriers with CD44-overexpressed cancer cell targeting[J]. Pharm Res， 2014， 31（11）： 2988-3005.

Li J P， Li M， Tian L F， et al. Facile strategy by hyaluronic acid functional carbon dot-doxorubicin nanoparticles for CD44 targeted drug delivery and enhanced breast cancer therapy[J]. Int J Pharm， 2020， 578： 119122.

Shen X， Li T， Chen Z， et al. Luminescent/magnetic PLGA-based hybrid nanocomposites： A smart nanocarrier system for targeted codelivery and dual-modality imaging in cancer theranostics[J]. Int J Nanomed， 2017， 12： 4299.

Yu J， Ju Y， Zhao L， et al. Multistimuli-regulated photochemothermal cancer therapy remotely controlled via Fe5C2 nanoparticles[J]. ACS nano， 2016， 10（1）： 159-169.