郭主聲 呂飛 謝樹金 黃亞 林偲思 徐寶華 馮劍波 馮森 何芬 周謀清

摘要：目的 通過研究東莞地區(qū)的耐碳青霉烯類腸桿菌目細(xì)菌（carbapenem-resistant Enterobacteriaceae， CRE）的耐藥情況和基因分型，研究耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae， CRKP）的親緣性、耐藥機(jī)制和blaKPC-2基因環(huán)境，為臨床尋找控制和治療該致病菌的更優(yōu)方案提供參考。方法 回顧性收集2016年1月—2018年12月東莞市人民醫(yī)院、東莞東華醫(yī)院、康華醫(yī)院、東莞市中醫(yī)院和東莞市婦幼保健院等十三所醫(yī)院的住院患者的CRE菌株進(jìn)行常規(guī)微生物培養(yǎng)、鑒定和藥敏試驗(yàn)。以美羅培南或亞胺培南紙片法（K-B法）或最小抑菌濃度（MIC）測(cè)定法對(duì)腸桿菌目細(xì)菌進(jìn)行初篩；采用改良Hodge試驗(yàn)、亞胺培南-EDTA雙紙片協(xié)同試驗(yàn)和CIM試驗(yàn)檢測(cè)CRE產(chǎn)酶情況；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction， PCR）檢測(cè)并鑒定CRE的碳青霉烯類耐藥基因（blaKPC、blaNDM、blaIMP、blaDHA、blaCTX-M和blaCMY），以及CRKP的多位點(diǎn)序列分型（multilocus sequence typing， MLST）和孔蛋白（OmpK35、OmpK36和OmpK37）；通過Junction PCR、Mapping PCR和Crossing PCR檢測(cè)blaKPC-2基因環(huán)境；使用WHONET 5.6軟件統(tǒng)計(jì)分析CRE臨床分離株在標(biāo)本和科室中的分布與耐藥情況，以及碳青霉烯酶基因在科室中的分布情況。結(jié)果 從37217株腸桿菌目細(xì)菌中共檢出131株CRE（占0.35%），其中肺炎克雷伯菌79株（占60.31%）、大腸埃希菌21株（占16.03% ）和陰溝腸桿菌12株（占9.16%）；檢出CRE的臨床科室主要為ICU（66株，占50.38%）；在檢出CRE的標(biāo)本中，位于前3位分別是痰液標(biāo)本（56株，占42.75%）、尿液標(biāo)本（21株，占16.03%）、傷口分泌物標(biāo)本（12株，占9.16%）；CRE對(duì)目前臨床中常使用的抗菌藥物表現(xiàn)出高耐藥性，僅對(duì)阿米卡星耐藥率較低，為21.38%。檢測(cè)104株CRE（包括肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌和陰溝腸桿菌）發(fā)現(xiàn)的碳青霉烯酶有KPC-2型（57，54.81%）、NDM-1型（7株，6.73%）和NDM-5型（2株，1.92%）；其中，CRKP主要為ST11型（49株，占62.03%），其次為ST1型（25株，占31.65%）；ompK35（75株，占94.94%）、ompK36（77株，占97.47%）和ompK37（79株，占100%）發(fā)生突變的占比高；blaKPC-2的基因環(huán)境主要為B1型突變型（38株，占48.10%），其次為A型突變型（14株，占17.72%）。 結(jié)論 2016—2018年東莞地區(qū)臨床CRE檢出率為0.35%，耐藥性強(qiáng)，其中，CRKP主要為ST11型，主要流行的是KPC-2型，其基因環(huán)境為B1型突變型，而且孔蛋白突變占比極高，這提示東莞地區(qū)blaKPC-2基因主要通過質(zhì)粒進(jìn)行傳播，并且孔蛋白突變?cè)贑RE中發(fā)揮重要作用，院內(nèi)感染醫(yī)務(wù)工作者應(yīng)根據(jù)該菌科室分布、耐藥情況和耐藥機(jī)制等特點(diǎn)，采取合理有效的預(yù)防和治療方法。

關(guān)鍵詞：耐碳青霉烯類腸桿菌目細(xì)菌；耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌；多位點(diǎn)序列分型；孔蛋白；blaKPC-2；基因環(huán)境

中圖分類號(hào)：R978.1 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Analysis of drug resistance phenotype， drug resistance mechanism and molecular epidemiological of carbapenem-resistant Enterobacteriaceae in Dongguan from 2016 to 2018

Guo Zhusheng， Lü Fei， Xie Shujin， Huang Ya， Lin Sisi， Xue Baohua， Feng Jianbo，

Feng Sen， He Fen， and Zhou Mouqing

（Dongguan Tungwah Hospital， Dongguan 523110）

Abstract Objective ?To provides a reference for better clinical control and treatment of such pathogenic bacteria in Dongguan by studying the drug resistance and genotyping of carbapenem-resistant Enterobacteriaceae （CRE）， and the affinity， the drug resistance mechanism， and the blaKPC-2 gene environment of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae （CRKP）. Methods ? ?CRE from 13 hospitals including Dongguan People's Hospital， Dongguan Tungwah Hospital， Kanghua Hospital， Dongguan Traditional Chinese Medicine Hospital， and Dongguan Maternal and Child Health Hospital et al， were collected retrospectively for routine microbial culture， and identification and drug sensitivity tests from January 2016 to December 2018. Gram negative Enterobacteriaceae were screened by the meropenem or imipenem disk method （the K-B method） or the minimum inhibitory concentration （MIC） method. Enzyme production of carbapenem resistant Enterobacteriaceae was detected by the modified Hodge test， the imipenem EDTA double disk synergy test， and the CIM test. The detection and identification of carbapenem resistance genes （blaKPC， blaNDM， blaIMP， blaDHA， blaCTX-M， and blaCMY） of CRE， multi-locus sequence typing （MLST）， and the detection of porins （OmpK35， OmpK36 and OmpK37） of CRKP were performed to analyze the affinities and the drug resistance mechanism by polymerase chain reaction （PCR）; Simultaneously， the blaKPC-2 gene environment was detected by junction PCR， mapping PCR， and crossing PCR. The WHONET 5.6 software was used to analyze the distribution and drug resistance of CRE clinical isolates in specimens and departments， as well as the distribution of carbapenemase genes in departments. Results ? ?A total of 131 strains of CRE （0.35%） were detected from 37，217 strains of Enterobacteriaceae， including 79 Klebsiella pneumoniae （60.31%）， 21 Escherichia coli （16.03%）， and 12 Enterobacter cloacae （9.16%）. The main clinical departments detected CRE were ICU （66 strains， accounting for 50.38%）. The top three samples of CRE were sputum （56 strains， 42.75%）， urine （21 strains， 16.03%）， and wound secretion （12 strains， 9.16%）. Through drug resistance analysis， this study found that CRE showed high drug resistance to antibiotics commonly used in clinic， and only low drug resistance to amikacin （21.38%）. The carbapenemases found in 104 CRE strains （including Escherichia coli， Klebsiella pneumoniae， and Enterobacter cloacae） were KPC-2 （57 strains， accounting for 54.81%）， NDM-1 （7 strains， accounting for 6.73%）， and NDM-5 （2 strains， accounting for 1.92%）; CRKP was mainly the ST11 type （49 strains， accounting for 62.03%）， followed by the ST1 type （25 strains， accounting for 31.65%）; The porins （ompK35， ompK36， and ompK37） had a high proportion of mutations which accounted 94%， 97.47%， and 100%， respectively; the gene environment of blaKPC-2 was mainly B1 mutant （38 strains， accounting for 48.10%）， followed by a mutant （14 strains， accounting for 17.72%）. Conclusion ? ?From 2016 to 2018， the detection rate of clinical CRE in Dongguan was 0.35%， and the drug resistance was strong. Among them， CRKP was mainly the ST11 type， and the KPC-2 type was mainly prevalent. Its genetic environment was B1 type mutation， and the percentage of porin mutation was very high， which suggested that the blaKPC-2 gene in Dongguan was mainly transmitted through plasmids， and the porin mutation played an important role in CRE. Hospital infection medical workers should take reasonable and effective prevention and treatment methods according to the distribution of the bacteria departments， the characteristics of drug resistance， and the drug resistance mechanism.

Key words Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae; Carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae; Multi-locus sequence typing; Porins; blaKPC-2; Genetic environment

腸桿菌目細(xì)菌是自然界和人體中廣泛存在的一種機(jī)會(huì)致病菌，常引起尿路感染、腹腔感染、敗血癥、膽道感染、肺部感染等多種部位感染。目前，已經(jīng)證實(shí)腸桿菌目細(xì)菌可以長期存在于人體的呼吸道和腸道，其中最常見的是肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌[1]。耐碳青霉烯類腸桿菌目細(xì)菌（carbapenem-resistant Enterobacteriaceae， CRE）對(duì)于臨床中經(jīng)常使用的抗菌藥物表現(xiàn)出廣泛的耐藥性，感染者臨床表現(xiàn)嚴(yán)重，死亡率高。

近些年，在全球范圍內(nèi)由CRE引起的感染呈現(xiàn)逐年增高的趨勢(shì)；在國內(nèi)，感染CRE的患者數(shù)量也逐年增高[2]。起初，針對(duì)CRE的感染，臨床采取的有效治療手段是應(yīng)用碳青霉烯類抗菌藥物，但是隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，肺炎克雷伯菌等幾種常見的腸桿菌目細(xì)菌逐漸對(duì)臨床中頻繁使用的幾種抗菌藥物產(chǎn)生了耐藥性[3]，這給臨床治療CRE的感染帶來了巨大挑戰(zhàn)。

為了應(yīng)對(duì)這個(gè)挑戰(zhàn)，在東莞地區(qū)，2014年11月市衛(wèi)計(jì)委和市醫(yī)院感染管理質(zhì)量控制中心牽頭成立了東莞耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)，要求全市所有醫(yī)院分離到疑似CRE，應(yīng)按《東莞地區(qū)醫(yī)療機(jī)構(gòu)耐碳青霉烯類腸桿菌感染預(yù)防與控制指引（試行）》的要求將菌株送到質(zhì)控中心復(fù)核[4]。為了明確東莞地區(qū)2016年以來耐碳青霉烯類腸桿菌目細(xì)菌對(duì)臨床中常見抗菌藥物的耐藥變化情況，本研究收集了2016年1月—2018年12月東莞市人民醫(yī)院、東莞東華醫(yī)院、康華醫(yī)院、東莞市中醫(yī)藥和東莞市婦幼保健院等13所醫(yī)院從住院患者分離的CRE，對(duì)菌株類型、菌株來源、藥敏試驗(yàn)結(jié)果和臨床科室分布進(jìn)行分析，并且使用PCR擴(kuò)增和測(cè)序方法對(duì)CRE的常見的碳青霉烯類耐藥基因（blaKPC、blaNDM、blaIMP、blaDHA、blaCTX-M和blaCMY）進(jìn)行檢測(cè)，并檢測(cè)CRKP的MLST、ompK35、ompK36和ompK37，以及blaKPC-2基因環(huán)境，分析其親緣性、孔蛋白突變情況和blaKPC-2基因環(huán)境。從而更好地了解本地區(qū)CRE的菌株類型分布和耐藥情況，以及CRKP的碳青霉烯酶型、親緣性、耐藥機(jī)制和blaKPC-2基因環(huán)境，為臨床合理規(guī)范使用抗菌藥物提供準(zhǔn)確依據(jù)，指導(dǎo)我市各級(jí)醫(yī)院臨床醫(yī)師更加準(zhǔn)確的“經(jīng)驗(yàn)性”用藥，指導(dǎo)院感管理防控措施的制定，避免耐藥菌株的傳播流行。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

2016年1月—2018年12月，連續(xù)從東莞市人民醫(yī)院、東莞東華醫(yī)院、康華醫(yī)院、東莞市中醫(yī)藥和東莞市婦幼保健院等13所醫(yī)院的住院患者的37217株細(xì)菌中檢出非重復(fù)的131株CRE菌株。

1.2 儀器與試劑

VITEK 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定藥敏系統(tǒng)分析儀系統(tǒng)及配套GN鑒定卡（法國Bio Mérieux公司），AST-GN09和AST-GN355藥敏板卡（法國Bio Mérieux公司），3730XL測(cè)序儀（美國Applied Biosystems公司），Verity 96well PCR儀（美國Applied Biosystems公司），F(xiàn)R-980A凝膠成像儀（上海復(fù)日科技有限公司），M-H瓊脂平板和藥敏紙片（江門凱琳生物科技有限公司），亞胺培南-EDTA雙紙片（上海原科實(shí)業(yè)有限公司），PrimeSTAR? Max DNA Polymerase（寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司），SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒（生工生物工程（上海）股份有限公司），Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒（生工生物工程（上海）股份有限公司）。

1.3 菌株鑒定方法

細(xì)菌的分離培養(yǎng)按照《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程（第4版）》[5]操作進(jìn)行，首先分離并純化疑似細(xì)菌，使用VITEK 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定藥敏系統(tǒng)分析儀鑒定到種，可疑結(jié)果根據(jù)菌落生長形態(tài)、革蘭染色、鏡下形態(tài)和相應(yīng)的生化試驗(yàn)復(fù)核。以美羅培南或亞胺培南紙片法（K-B法）或最小抑菌濃度（MIC）測(cè)定法對(duì)菌株進(jìn)行初篩并記錄耐藥情況，對(duì)于碳青霉烯類藥物其中1種不敏感的腸桿菌目細(xì)菌鑒定為CRE。初篩耐藥的菌株采用改良Hodge試驗(yàn)、亞胺培南-EDTA雙紙片協(xié)同試驗(yàn)和CIM試驗(yàn)檢測(cè)耐碳青霉烯類腸桿菌目細(xì)菌的產(chǎn)酶情況[4]。藥敏試驗(yàn)按2021年CLSI版標(biāo)準(zhǔn)判斷結(jié)果[6]。

1.4 藥敏試驗(yàn)質(zhì)控菌株

實(shí)驗(yàn)所采用的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)菌株為大腸埃希菌ATCC 25922、肺炎克雷伯菌ATCC700603、肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705和肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1706，均購自國家衛(wèi)生健康臨床檢驗(yàn)中心。

1.5 碳青霉烯類耐藥基因的檢測(cè)

將篩選獲得的CRE采用PCR擴(kuò)增的方法，對(duì)blaKPC、blaNDM、blaIMP、blaDHA、blaCTX-M和blaCMY等常見的耐碳青霉烯類基因進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序（擴(kuò)增引物詳見表1）。反應(yīng)體系為25 μL：目的基因1 μL，上、下游引物各1 μL，PrimeSTAR? Max DNA Polymerase 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR擴(kuò)增條件為：預(yù)變性98 ℃ 30 s；變性98 ℃ 10 s，退火55 ℃ 5 s，延伸72℃ 5 s，30個(gè)循環(huán)；終延伸72 ℃ 5 min。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用WHONET 5.6軟件對(duì)細(xì)菌鑒定及藥敏試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理和分析。

1.7 CRKP的MLST和孔蛋白序列檢測(cè)

使用7對(duì)管家基因引物（rpoB、gapA、mdh、pgi、phoE、infB和tonB）[8]，和孔蛋白引物[9]對(duì)CRKP進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測(cè)序；基于單核苷酸多態(tài)性（single-nucleotide polymorphisms， SNPs），使用CGE在線網(wǎng)站的CSIPhylogeny在線工具（https：//cge.food.dtu.dk/services/CSIPhylogeny/）繪制CRKP的進(jìn)化樹，并使用iTOL在線工具（https：//itol.embl.de/）對(duì)進(jìn)化樹進(jìn)行修飾。

1.8 blaKPC-2基因環(huán)境檢測(cè)

使用junction PCR、mapping PCR和crossing PCR的引物[10]對(duì)CRKP的blaKPC-2基因環(huán)境進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并測(cè)序。

2 結(jié)果

2.1 不同腸桿菌目細(xì)菌中CRE檢出及產(chǎn)酶情況

從37217株細(xì)菌中檢出131株CRE（占比0.35%），其中肺炎克雷伯菌79株、大腸埃希菌21株和陰溝腸桿菌12株。不同腸桿菌目細(xì)菌中CRE檢出率、改良Hodge試驗(yàn)、CIM試驗(yàn)和亞胺培南-EDTA雙紙片協(xié)同試驗(yàn)陽性率見表2。

2.2 菌株的臨床分布情況分析

分離CRE前3位的標(biāo)本分別是痰液標(biāo)本、尿液標(biāo)本和傷口分泌物標(biāo)本，其次為血液標(biāo)本、各部位引流液標(biāo)本和咽拭子標(biāo)本。CRE感染科室前3位分別是重癥醫(yī)學(xué)科、神經(jīng)外科和神經(jīng)內(nèi)科，其次為呼吸內(nèi)科、血液內(nèi)科和肝膽外科等，感染類型判斷標(biāo)準(zhǔn)參照《醫(yī)院感染診斷標(biāo)準(zhǔn)》[11]進(jìn)行（表3）。

2.3 CRE對(duì)常用抗菌藥物的耐藥情況

從104株做耐藥基因檢測(cè)的CRE藥敏結(jié)果分析可知：亞胺培南耐藥率為100.00%，美羅培南耐藥率為91.12%；耐藥率低于30%的藥物僅有阿米卡星（21.38%）；耐藥率在50%～60%的只有妥布霉素（53.30%）和慶大霉素（59.04%）；而臨床廣泛使用的氟喹諾酮類、第三代頭孢菌素及其含酶抑制劑等藥物耐藥率超過80%（表4）。

2.4 CRE的碳青霉烯類耐藥基因分型

通過檢測(cè)104株屬于肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌和陰溝腸桿菌的CRE的碳青霉烯類耐藥基因，發(fā)現(xiàn)東莞地區(qū)的碳青霉烯酶基因主要為為KPC-2，其次為NDM-1和NDM-5型（表5）。

2.5 CRKP的同源性和孔蛋白突變分析

在79株CRKP中，最主要的MLST分型為ST11型（49株，占62.03%），其次為ST1型（25株，占31.65%），然后是ST15、ST307、ST2368、ST2536和ST5253各1株，共占6.32%（詳見圖1）；產(chǎn)KPC-2型碳青霉烯酶的有57株（占72.15%），產(chǎn)NDM-1型的有5株（占6.33%），不產(chǎn)碳青霉烯酶的有17株（占21.52%）；ompK35發(fā)生缺失突變的有64株（占81.01%），發(fā)生提前終止突變的有11株（占13.92%），未發(fā)生突變的有4株（占5.07%）；ompK36發(fā)生（第134和135位增加G和D）插入突變有41（占51.90%），發(fā)生缺失突變的有26株（占32.91%），發(fā)生319-325位插入突變的有8株（占10.13%），未發(fā)生突變的有2株（占2.53%），發(fā)生移碼突變的有2株（占2.53%）；ompK37發(fā)生I70M和I128M點(diǎn)突變的有77株（占97.47%），發(fā)生移碼突變的有2株（占2.53%）（詳見圖1）。

2.6 ?blaKPC-2基因環(huán)境分析

通過Junction PCR、Mapping PCR和Crossing PCR，本研究發(fā)現(xiàn)，東莞地區(qū)的blaKPC-2的基因環(huán)境主要為B1型突變型（38株，占66.67%），其次為A型突變型（14株，占24.56%），最后為B1型（5株，占8.77%），與A型（pKP048，GenBank號(hào)：FJ628167.2）和B1型（pKPHS2，GenBank號(hào)：CP003224.1）均不一致；其中，B1型突變型可以擴(kuò)增出M1-M5和J4部分，J1和J5部分?jǐn)U增失敗，這表明B1型的Tn1721的IRR和IS26發(fā)生缺失；A型突變型可以擴(kuò)增出M1-M5、J3和J4部分，J1和M6部分?jǐn)U增失敗，這表明A型Tn1721的IRR發(fā)生缺失，M6部分發(fā)生IS26插入突變（圖2）。

3 討論

腸桿菌目細(xì)菌在近3年已經(jīng)成為了各地區(qū)臨床科室中最常見的分離菌株，隨著多重耐藥甚至泛耐藥的CRE檢出數(shù)量增加，CRE感染的控制及治療對(duì)于臨床來說越來越棘手[12]。目前，世界范圍內(nèi)對(duì)于CRE的預(yù)防、臨床控制及治療方案并沒有達(dá)成共識(shí)，臨床往往根據(jù)藥敏試驗(yàn)，選擇合適的抗菌藥物及用藥途徑。目前治療輕、中度CRE的感染，多選擇單用敏感的藥物治療；對(duì)于重度細(xì)菌感染，采用兩種以上敏感藥物聯(lián)合治療[13]。

目前研究認(rèn)為腸桿菌目細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥機(jī)制主要有3種：①細(xì)菌自身分泌的碳青霉烯酶可水解碳青霉烯類抗菌藥物，國內(nèi)主要流行的是KPC和IMP酶；②高產(chǎn)AmpC頭孢菌素酶或超廣譜β-內(nèi)酰胺酶合并孔道蛋白缺失或表達(dá)降低導(dǎo)致的外膜通透性降低；③碳青霉烯類藥物作用位點(diǎn)PBP蛋白改變[14]。本研究發(fā)現(xiàn)：在104株CRE中，未檢測(cè)到碳青霉烯類耐藥基因（blaKPC、blaNDM、blaIMP、blaDHA、blaCTX-M和blaCMY等常見的耐藥基因）但表現(xiàn)出對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的有38株（占36.54%），這可能與第二或者第三種耐藥機(jī)制有關(guān)。

本次研究發(fā)現(xiàn)：CRE檢出率較高的主要分布在成年人、男性、重癥醫(yī)學(xué)科（ICU）、年齡為5M～86Y。15～64歲檢出80株，占61.07%；男性檢出86株，65.65%；66株分離于重癥醫(yī)學(xué)科（50.38%），與相關(guān)報(bào)道一致[15]；檢出CRE的標(biāo)本中以呼吸道標(biāo)本為主，其次是尿液和傷口分泌物，這與國內(nèi)報(bào)道一致[16-17]；來源于院內(nèi)感染的有118株（90.07%），源自社區(qū)感染的有13株（9.93%）。其中因?yàn)镃RE感染導(dǎo)致死亡的有6例（5.31%），這低于相關(guān)報(bào)道的10%～72%[18]，表明臨床的治療措施比較正確，但導(dǎo)致病情加重的有92例（70.23%），這給患者造成極大的傷害，也給臨床治療帶來很大的麻煩。同時(shí)也再次提醒我們超級(jí)耐藥細(xì)菌的預(yù)防與控制不僅僅是限于各級(jí)醫(yī)院，社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)站、藥店和畜牧業(yè)的抗菌藥物的監(jiān)管同樣責(zé)無旁貸[19]。

本研究發(fā)現(xiàn)，感染CRE的患者多數(shù)在ICU，認(rèn)為這與重癥監(jiān)護(hù)室的患者普遍年齡較高、病情復(fù)雜嚴(yán)重、住院時(shí)間久、抗生素應(yīng)用頻繁和免疫力低下等因素有關(guān)。同時(shí)，由于重癥監(jiān)護(hù)室的患者往往需要機(jī)器輔助通氣，會(huì)接受氣管插管甚至氣管切開等有創(chuàng)性操作，這也增加了ICU患者感染CRE的風(fēng)險(xiǎn)[20]。有研究表明，導(dǎo)致患者感染CRE的危險(xiǎn)因素較多，臨床中較常見的是外科手術(shù)等有創(chuàng)的侵襲性操作、插置尿管和患者頻繁更換病房床位以及頻繁使用廣譜抗菌藥物等[15]。有研究報(bào)道：對(duì)于既往合并多種基礎(chǔ)病的患者，預(yù)防院內(nèi)獲得性感染比感染后治療更重要[21]。因此，需要醫(yī)務(wù)人員注意的是，在給患者用藥時(shí)要詳細(xì)評(píng)估患者情況，根據(jù)藥敏結(jié)果選擇合適抗生素，盡量減少侵襲性操作，同時(shí)提高所有醫(yī)務(wù)人員對(duì)于預(yù)防感染防控的基本意識(shí)[15]。

在本文的相關(guān)研究可以發(fā)現(xiàn)，CRE檢出率較高的菌株主要為肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌和陰溝腸桿菌，這與相關(guān)報(bào)道較為一致[17]。目前已經(jīng)明確CRE對(duì)臨床中使用頻率較高的幾種抗菌藥物均表現(xiàn)為高水平耐藥，對(duì)亞胺培南耐藥率為100.00%，對(duì)美羅培南耐藥率為91.12%，耐藥率低于30%的藥物僅有阿米卡星，耐藥率在50%～60%只有妥布霉素和慶大霉素，而臨床廣泛使用的氟喹諾酮類、第三代頭孢菌素及其含酶抑制劑等藥物耐藥率均超過80%，這提示臨床針對(duì)疑似CRE感染的經(jīng)驗(yàn)性用藥可以選擇阿米卡星，其余抗菌藥物的效果微乎其微。第三代頭孢菌素及其含酶抑制劑等藥物耐藥率相對(duì)較高，可能與東莞地區(qū)各三級(jí)醫(yī)院應(yīng)用頭孢噻肟、哌拉西林/他唑巴坦較早，其他抗菌藥物應(yīng)用時(shí)間相對(duì)較短有關(guān)。在多重耐藥菌高檢出率時(shí)期，抗菌藥物選擇的多樣性是有必要的，繼續(xù)加強(qiáng)碳青霉烯類特殊級(jí)抗菌藥物的使用限制，尤其是重視第三代頭孢菌素和氟喹諾酮類藥物的管理與合理使用，對(duì)遏制CRE超級(jí)細(xì)菌的產(chǎn)生有著深遠(yuǎn)的意義[16]。

本研究發(fā)現(xiàn)，東莞地區(qū)主要流行的是ST11型CRKP，這與ST11型肺炎克雷伯菌缺少CRISPR-Cas系統(tǒng)和限制修飾系統(tǒng)，易于獲得外源性基因和質(zhì)粒有關(guān)[22]；東莞地區(qū)主要流行的為KPC-2型碳青霉烯酶，有研究表明，國外的blaKPC-2的基因環(huán)境主要為A型，國內(nèi)其他地區(qū)主要為B1型[10]，然而，本研究發(fā)現(xiàn)，東莞地區(qū)blaKPC-2的基因環(huán)境主要為B1型突變型（66.67%），Tn1721和IS26缺失，意味著除了質(zhì)粒以外，blaKPC-2不能通過轉(zhuǎn)座子和插入元件進(jìn)行轉(zhuǎn)移；除此之外，孔蛋白的突變也會(huì)引起細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類耐藥，在79株CRKP中，ompK36發(fā)生插入突變的區(qū)域?yàn)長3區(qū)，可改變OmpK36蛋白的孔徑，ompK37發(fā)生點(diǎn)突變，均可降低碳青霉烯類抗生素的滲透率[23]；ompK35、ompK36和ompK37同時(shí)突變可導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)厄他培南耐藥，而β-內(nèi)酰胺酶聯(lián)合孔蛋白突變，可導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)亞胺培南和美羅培南耐藥[24]。東莞地區(qū)的主要流行的blaKPC-2基因環(huán)境不同于其他地區(qū)，這可能與在東莞地區(qū)流行的攜帶blaKPC-2的質(zhì)粒類型有關(guān)；除了產(chǎn)碳青霉烯酶以外，孔蛋白突變結(jié)合β-內(nèi)酰胺酶導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類耐藥占比也較高，容易導(dǎo)致臨床使用碳青霉烯酶抑制劑治療此類CRE感染效果不佳。因此，臨床醫(yī)生在做好CRE感染的預(yù)防、控制和治療的同時(shí)，醫(yī)務(wù)相關(guān)部門還應(yīng)加強(qiáng)環(huán)境清潔及病房消毒工作，減少CRE的擴(kuò)散和blaKPC-2基因傳播，嚴(yán)格把控各種抗菌藥物的使用指征及流程，杜絕抗生素濫用，建立規(guī)范CRE感染的預(yù)警及管理制度[16]。

綜上所述，從菌株類型的分布來看，東莞地區(qū)的CRE主要以肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌為主，檢出率高的臨床科室是ICU，主要流行的是KPC-2型碳青霉烯酶，基因環(huán)境為B1突變型，主要通過質(zhì)粒進(jìn)行傳播。CRE對(duì)臨床的多種常用抗菌藥物的耐藥性高，因此，對(duì)于各臨床科室尤其是重癥監(jiān)護(hù)室，要加強(qiáng)對(duì)CRE的監(jiān)測(cè)，醫(yī)務(wù)工作者要熟悉患者臨床資料，準(zhǔn)確掌握感染細(xì)菌的種類及耐藥情況，合理選擇抗菌藥物。

參 考 文 獻(xiàn)

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