摘要：對(duì)于膜翅目毒素過(guò)敏人群，膜翅目昆蟲(chóng)蜇刺是其不可忽視的危險(xiǎn)因素。我國(guó)現(xiàn)有的診斷工具無(wú)法提供準(zhǔn)確的信息來(lái)明確致敏昆蟲(chóng)，從而影響臨床的診斷和治療。蜜蜂為常見(jiàn)的膜翅目昆蟲(chóng)，分布地域廣、數(shù)量多，且其毒素成分復(fù)雜，因此國(guó)內(nèi)外研究者已針對(duì)蜜蜂毒素主要變應(yīng)原開(kāi)展了相關(guān)重組變應(yīng)原方案工作，這為變應(yīng)原檢測(cè)提供了一定的理論基礎(chǔ)。變應(yīng)原組分診斷技術(shù)的發(fā)展可實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確檢測(cè)蜂毒變應(yīng)原，這將為蜜蜂蜂毒過(guò)敏患者提供一套全新的臨床診斷和治療方案。

關(guān)鍵詞：膜翅目昆蟲(chóng)蜇刺；蜜蜂毒素；重組變應(yīng)原；變應(yīng)原檢測(cè)；變應(yīng)原組分診斷技術(shù)

中圖分類(lèi)號(hào)： R593.1；Q819" 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A" 文章編號(hào)：1000-503X（2024）04-0565-10

DOI：10.3881/j.issn.1000-503X.15770

Research Progress in Detection of Bee Venom Allergens

ZHAO Huimin，LI Junda，CUI Le，GUAN Kai

Department of Allergy，PUMC Hospital，CAMS and PUMC，Beijing 100730，China

Corresponding author：GUAN Kai Tel：13611113032，E-mail：dr_guankai@126.com

ABSTRACT：Hymenopteran insect stings are a risk factor that cannot be ignored for the people allergic to hymenopteran venoms.In China，the current diagnostic tools cannot provide accurate information to identify sensitized insects，thus affecting clinical diagnosis and treatment.Honeybee is a common hymenopteran insect.Due to its wide distribution，large number，and complex venom composition，researchers have carried out recombination schemes for the main allergens of honeybee venom，laying a theoretical foundation for the detection of allergens.The development of diagnostic technologies for allergen components can accurately detect bee venom allergens，providing a new set of clinical diagnosis and treatment schemes for the population allergic to bee venom.

Key words：hymenopteran insect sting；honeybee venom；allergen recombination；allergen detection；diagnosis technology of allergen components

Acta Acad Med Sin，2024，46（4）：565-574

每年全球約1億人被膜翅目昆蟲(chóng)蜇傷，其中約7.5%的患者會(huì)發(fā)生嚴(yán)重過(guò)敏反應(yīng)，蜇刺的膜翅目昆蟲(chóng)已成為膜翅目毒素過(guò)敏人群不可忽視的危險(xiǎn)因素［1-2］。據(jù)媒體報(bào)道，我國(guó)擁有多達(dá)2000余家蜜蜂養(yǎng)殖相關(guān)企業(yè)，養(yǎng)殖蜂群數(shù)量更超過(guò)820萬(wàn)群，為世界第一大蜜蜂養(yǎng)殖蜂群擁有國(guó)，由此推測(cè)國(guó)內(nèi)養(yǎng)蜂從業(yè)人員多達(dá)萬(wàn)計(jì)。另外，隨著人們生活水平的提高，戶外旅游者不計(jì)其數(shù)，這部分人群與專業(yè)養(yǎng)蜂人群同為蜜蜂蜂毒暴露高危人群。

膜翅目毒素過(guò)敏的臨床診斷是基于被昆蟲(chóng)蜇刺的病史、皮試陽(yáng)性反應(yīng)和/或血清蜂毒特異性免疫球蛋白（specific immunoglobulin E，sIgE）的檢測(cè)［3］。目前蜂毒過(guò)敏診斷方法有很大的局限性，由于部分患者無(wú)法準(zhǔn)確識(shí)別蜇刺的膜翅目昆蟲(chóng)，這時(shí)無(wú)法結(jié)合臨床病史時(shí)，臨床檢測(cè)診斷只能給出一個(gè)相對(duì)客觀的結(jié)果。在臨床檢測(cè)診斷中，天然蜂毒毒素提取物的sIgE檢測(cè)也很難給出正確的診斷結(jié)果，這是因?yàn)槟こ崮慷舅剡^(guò)敏的交叉反應(yīng)性和同源反應(yīng)性，可能會(huì)使檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生假陽(yáng)性，而且部分致敏變應(yīng)原在蜂毒毒素中的低豐度也會(huì)產(chǎn)生一些假陰性結(jié)果。隨著變應(yīng)原組分診斷技術(shù)（component-resolved diagnosis，CRD）的發(fā)展，對(duì)某一或某些致敏蛋白的變態(tài)反應(yīng)進(jìn)行準(zhǔn)確定位成為可能，因此有必要獲得具有中國(guó)典型蜂毒變應(yīng)原的相關(guān)資料和總結(jié)國(guó)內(nèi)外現(xiàn)有蜂毒檢測(cè)方案，以期為臨床診斷和治療提供理論依據(jù)。

1 蜇刺的膜翅目昆蟲(chóng)及蜜蜂簡(jiǎn)介

1.1 膜翅目簡(jiǎn)介

膜翅目是昆蟲(chóng)綱中第三大的目，僅次于鞘翅目和鱗翅目，全世界已知約有15萬(wàn)種膜翅目昆蟲(chóng)，中國(guó)已知有2300余種［4］。膜翅目昆蟲(chóng)廣泛分布于世界各地，以熱帶和亞熱帶地區(qū)種類(lèi)最多，因其雌蟲(chóng)產(chǎn)卵器發(fā)達(dá)，一般呈鋸狀、刺狀或針狀，在高等類(lèi)群中特化為螫針，可作為攻擊的武器。膜翅目按照經(jīng)典分類(lèi)方法分為細(xì)腰亞目和廣腰亞目，蜜蜂科、胡蜂科和蟻科是細(xì)腰亞目中常見(jiàn)的蜇刺昆蟲(chóng)，蜇刺的膜翅目昆蟲(chóng)使用螯針主要有以下3個(gè)目的：（1）對(duì)巢資源的種內(nèi)競(jìng)爭(zhēng)；（2）對(duì)捕食者的防御；（3）獵物捕獲。

大多數(shù)昆蟲(chóng)如蜜蜂和胡蜂都是獨(dú)居的，在一般情況下，這些昆蟲(chóng)不會(huì)為了保護(hù)他們的巢穴而進(jìn)行蜇刺，同樣也不會(huì)對(duì)人類(lèi)構(gòu)成威脅，但有一部分蜜蜂和胡蜂物種是群居的，與獨(dú)居蜜蜂和胡蜂不同，群居蜜蜂和胡蜂在他們的巢穴遭遇危險(xiǎn)時(shí)會(huì)因?yàn)樽孕l(wèi)而發(fā)生蜇刺，所以人類(lèi)所面臨的主要蜇刺昆蟲(chóng)是群居蜜蜂和胡蜂［5-6］。

膜翅目毒素過(guò)敏是所有蜇刺昆蟲(chóng)過(guò)敏的患者產(chǎn)生嚴(yán)重過(guò)敏反應(yīng)的直接原因，大多數(shù)人只會(huì)在被昆蟲(chóng)蜇刺后出現(xiàn)常見(jiàn)的局部反應(yīng)（如疼痛和瘙癢），但膜翅目毒素過(guò)敏的患者則會(huì)產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)，有可能危及生命。有研究估計(jì)，由膜翅目昆蟲(chóng)蜇刺引起的局部過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生率為2.4%～26.4%，全身過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生率為0.6%～8.9%［7-12］。有研究顯示在高頻暴露的人群中如養(yǎng)蜂人和林業(yè)工人，分別有10%和21%的人報(bào)告曾經(jīng)歷過(guò)蜜蜂和胡蜂蜇刺后引起的全身過(guò)敏反應(yīng)［13-14］。另有研究顯示在土耳其養(yǎng)蜂人被蜇刺后引起的全身過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生率為6.5%，在中國(guó)養(yǎng)蜂人被蜇刺后引起的全身過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生率為28%［15-16］。

1.2 蜜蜂簡(jiǎn)介

蜜蜂屬膜翅目、蜜蜂科，體長(zhǎng)為8～20 mm，黃褐色或黑褐色，生有密毛；頭與胸幾乎同樣寬，觸角膝狀，復(fù)眼為橢圓形，有毛，口器嚼吸式，后足為攜粉足；兩對(duì)膜質(zhì)翅：前翅大，后翅小，前后翅以翅鉤列連鎖；腹部近橢圓形，體毛較胸部為少，腹末有螯針；一生要經(jīng)過(guò)卵、幼蟲(chóng)、蛹和成蟲(chóng)4個(gè)蟲(chóng)態(tài)。中華蜜蜂是東亞的本土蜜蜂之一，在日本、中國(guó)、印度、菲律賓群島和馬來(lái)地區(qū)都有發(fā)現(xiàn)。直到近代大量引入了意大利蜜蜂，因其產(chǎn)蜜量高，繁殖快，很快在數(shù)量上超過(guò)了中華蜜蜂［17］。不同地理位置的中華蜜蜂之間存在著相當(dāng)明顯的遺傳差異，根據(jù)mtDNA編碼序列分析，可將中華蜜蜂分為日韓型、中國(guó)大陸型、中國(guó)臺(tái)灣型、馬來(lái)西亞沙巴-印度黑型、中國(guó)海南型、印度黃型、泰國(guó)南部型和印度黑型8種類(lèi)型［18］。在中國(guó)，自1896年從意大利等國(guó)傳入大量的意大利蜜蜂，中華蜜蜂的數(shù)量占比逐漸下降。在意大利蜜蜂的競(jìng)爭(zhēng)下，中國(guó)蜜蜂的分布面積減少了75%以上，種群數(shù)量減少了80%以上。東亞其他國(guó)家的中華蜜蜂數(shù)量也有所下降［19］。

蜜蜂毒腺產(chǎn)生的蜜蜂毒素（honeybee venom，HBV）是一種復(fù)雜的混合物，包括蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、磷脂、糖、生物胺、揮發(fā)性化合物等多種物質(zhì)和接近80%的水分［20-22］。HBV中的蛋白質(zhì)組成也非常復(fù)雜，目前HBV中已鑒定的蛋白質(zhì)和多肽就有113種，而且N-糖基化位點(diǎn)和蛋白質(zhì)的異質(zhì)性又進(jìn)一步增加了蛋白質(zhì)和多肽的種類(lèi)和數(shù)量［23］。HBV的致敏成分主要是酶和糖蛋白，相對(duì)分子量為（3～200）×103之間。根據(jù)生物學(xué)作用，HBV中確定的變應(yīng)原分為主要變應(yīng)原和次要變應(yīng)原，主要變應(yīng)原指超過(guò)50%的過(guò)敏者都具有sIgE的HBV特定成分，次要變應(yīng)原為低于50%的過(guò)敏者都具有sIgE的HBV特定成分［24］。

2 蜂蜇傷后的生理反應(yīng)和過(guò)敏反應(yīng)

蜂蜇傷后會(huì)引起臨床生理反應(yīng)和過(guò)敏反應(yīng)，這些反應(yīng)均可引起患者的死亡，對(duì)于蜂毒過(guò)敏人群，蜂蜇傷后的生理反應(yīng)和過(guò)敏反應(yīng)的雙重作用可能使病情更為嚴(yán)重，且不容忽視。

2.1 蜂蜇傷后的生理反應(yīng)

生理反應(yīng)一方面表現(xiàn)為局部炎性反應(yīng)，以局部紅腫、疼痛和瘙癢等為主，隨著時(shí)間的推移癥狀會(huì)逐漸消失；另一方面為毒性反應(yīng)，有肝毒性、腎毒性、溶血、肌肉毒性及神經(jīng)毒性等［25-27］。蜂蜇傷后導(dǎo)致患者的生理反應(yīng)常表現(xiàn)為器官功能不全，尤其以腎臟最為常見(jiàn)，其次為心血管系統(tǒng)及血液系統(tǒng)，嚴(yán)重者會(huì)有多器官功能障礙綜合征［27］。有研究數(shù)據(jù)顯示1091例蜂蜇傷患者病死率為5.1%，其中50% 死于多器官功能障礙綜合征，多器官功能障礙綜合征是蜂蜇傷致死的首要原因［10］。

2.2 蜂蜇傷后的過(guò)敏反應(yīng)

蜂蜇傷后的過(guò)敏反應(yīng)是僅次于食物抗原導(dǎo)致的過(guò)敏反應(yīng)（33%～34%），占所有過(guò)敏反應(yīng)的比例為14%［28-29］。雖然蜂毒過(guò)敏有多種機(jī)制，但常見(jiàn)的機(jī)制是由蜂毒激活的變應(yīng)原sIgE 與肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞上的高親和力Fc受體結(jié)合介導(dǎo)的Ⅰ型超敏反應(yīng)，這些高親和力Fc受體與變應(yīng)原sIgE交聯(lián)可活化肥大細(xì)胞，釋放介質(zhì)（如組胺），使血管滲透性增加及血管擴(kuò)張，引起相應(yīng)部位的過(guò)敏癥狀，常見(jiàn)的有蕁麻疹、血管性水腫、呼吸道癥狀（呼吸困難或哮喘）和心血管癥狀（低血壓和過(guò)敏性休克） 等［30-31］。有研究表明，sIgE不僅會(huì)使機(jī)體產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)，還會(huì)使機(jī)體產(chǎn)生獲得性免疫力，其原理為sIgE相關(guān)免疫反應(yīng)可導(dǎo)致肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞激活，肥大細(xì)胞產(chǎn)生肥大細(xì)胞蛋白酶，可降解毒素中所存在的部分毒素，從而增強(qiáng)機(jī)體對(duì)毒素的先天和后天抵抗力［32-33］。肥大細(xì)胞除了釋放蛋白酶外，還可通過(guò)其他機(jī)制在先天或后天免疫反應(yīng)中幫助增強(qiáng)對(duì)毒素的抵抗力［34］。體外研究證明肥大細(xì)胞生成高價(jià)陰離子的肝素可與羅素蛇毒中陽(yáng)離子毒素所結(jié)合，從而使蛇毒毒性降低［35］。在理想狀況下，研究者應(yīng)將考慮如何能使sIgE介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)維持在一個(gè)幫助機(jī)體增強(qiáng)對(duì)毒素的先天和后天抵抗力水平，且并不會(huì)引起嚴(yán)重的過(guò)敏反應(yīng)。

除常見(jiàn)的Ig E介導(dǎo)的Ⅰ型超敏反應(yīng)，蜂毒過(guò)敏還有其他可能的相關(guān)機(jī)制，如免疫復(fù)合物反應(yīng)和延遲型反應(yīng)等超敏反應(yīng)［36］。免疫復(fù)合物型反應(yīng)可導(dǎo)致各種綜合征，這具體取決于相關(guān)機(jī)制所產(chǎn)生的抗體，會(huì)引起不同類(lèi)型的病癥，如蜂毒抗原產(chǎn)生的sIgG抗體與毒素抗原結(jié)合形成免疫復(fù)合物，這些免疫復(fù)合物沉積可能會(huì)導(dǎo)致血清病樣綜合征和腎小球腎炎［37］。

蜂毒過(guò)敏反應(yīng)分為以下3個(gè)類(lèi)別：（1）局部反應(yīng)：風(fēng)團(tuán)和紅暈等。（2）大局部反應(yīng)指蜂蜇局部腫脹直徑超過(guò)10 cm，且持續(xù)時(shí)間大于 1 d［38-39］。（3）全身性嚴(yán)重過(guò)敏反應(yīng)指蜂蜇部位以外的組織和/或器官出現(xiàn)臨床癥狀和體征。根據(jù)世界過(guò)敏組織2020年過(guò)敏反應(yīng)指南全身過(guò)敏反應(yīng)嚴(yán)重程度分級(jí)，其中第5級(jí)最為嚴(yán)重［40］（表1）。

3 蜂毒檢測(cè)時(shí)的影響因素

面對(duì)蜂蜇傷后的患者，準(zhǔn)確診斷其過(guò)敏因素，有利于臨床醫(yī)師制訂合適恰當(dāng)?shù)脑\療方案。皮試和sIgE檢測(cè)是蜂毒過(guò)敏的主要檢測(cè)手段，但以下因素會(huì)影響目前對(duì)膜翅目毒素檢測(cè)。

3.1 蜂毒過(guò)敏原的交叉反應(yīng)性和同源反應(yīng)性

多糖結(jié)構(gòu)對(duì)蜂毒蛋白的特性有重要影響，并構(gòu)成了交叉反應(yīng)性碳水化合物決定因子（cross-reactive carbohydrate determinants，CCD），這是膜翅目和植物變應(yīng)原的特性，會(huì)干擾治療策略的診斷和設(shè)計(jì)［41-43］。

Müller等［44］發(fā)現(xiàn)，使用slgE對(duì)HBV活性蛋白組分Api m 1和胡蜂蜂毒（yellow jacket venom，YJV）活性蛋白組分Ves v 5進(jìn)行檢測(cè)，有59%的過(guò)敏患者雙陽(yáng)性。97%的HBV過(guò)敏患者和17%的YJV過(guò)敏患者檢測(cè)到Api m 1的slgE，87%的YJV過(guò)敏患者和17%的HBV過(guò)敏患者檢測(cè)到Ves v 5的slgE。在雙陽(yáng)性患者中，有37%的YJV過(guò)敏患者和56%的HBV過(guò)敏患者是由于CCD引起的假陽(yáng)性，這在HBV患者中更常見(jiàn)。同時(shí)關(guān)凱等［45］報(bào)道8例HBV和YJV雙陽(yáng)性患者中，7例對(duì)Ves v 5 sIgE陰性，僅有1例對(duì)HBV和YJV雙過(guò)敏患者對(duì)Ves v 5 sIgE為8.03 kUA/L。以上表明，常規(guī)蜂毒提取物在皮膚和血清學(xué)測(cè)試中的陽(yáng)性結(jié)果并不總是反映真正的致敏作用，而是由抗體與CCD或者與蛋白質(zhì)變應(yīng)原中的同源肽序列交叉反應(yīng)產(chǎn)生的陽(yáng)性結(jié)果（如透明質(zhì)酸酶和二肽基肽酶IV）［46-50］。

蜂毒提取物雙陽(yáng)性可能與sIgE對(duì)CCD的交叉反應(yīng)有關(guān)［34，51-52］。Koroec等［53］報(bào)道了91%的HBV過(guò)敏患者對(duì)具有CCD的天然Api m 1的sIgE反應(yīng)陽(yáng)性（≥0.35 kUA/L），而對(duì)缺乏CCD的重組Api m 1的sIgE反應(yīng)僅為57%。在缺乏CCD反應(yīng)組中，天然Api m 1和重組Api m 1有相同的sIgE水平，這表明在缺乏CCD的HBV過(guò)敏患者中，天然Api m 1和重組Api m 1與sIgE的結(jié)合情況相似［54］。在經(jīng)歷嚴(yán)重過(guò)敏反應(yīng)的受試者中，天然Api m 1中sIgE陽(yáng)性多于重組Api m 1陽(yáng)性的情況更為明顯［38］。同樣，另一項(xiàng)研究顯示，約80.5%的雙陽(yáng)性患者存在對(duì)CCD有反應(yīng)的sIgE，這可能是雙陽(yáng)性的潛在原因［34］。使用能區(qū)分種屬的重組主要變應(yīng)原重組Api m 1和重組Ves v 5使診斷得到了改善，他們沒(méi)有CCD的反應(yīng)，這有助于區(qū)分真正的雙重致敏性和交叉反應(yīng)性。少數(shù)（8/33，24%）對(duì)蜂毒提取液雙陽(yáng)性的缺乏CCD反應(yīng)的患者對(duì)重組Api m 1和重組Ves v 5均有真正的致敏作用，而大多數(shù)（22/33，66%）僅對(duì)這兩種中的任何一種有致敏作用［55］。在單致敏組，用一種主要致敏昆蟲(chóng)毒素進(jìn)行免疫治療足以達(dá)到良好效果，反之，使用多種類(lèi)蜂毒的免疫治療可能會(huì)適得其反。

天然變應(yīng)原的碳水化合物表位不能完全解釋雙陽(yáng)性。Ellis等［38］發(fā)現(xiàn)只有9%（16/174）的受試者對(duì)CCD表現(xiàn)出sIgE反應(yīng)性。迄今為止，除CCD外，蜂毒過(guò)敏患者的雙陽(yáng)性主要?dú)w因于sIgE靶向的透明質(zhì)酸酶（Api m 2和Ves v 2）或二肽基肽酶（Api m 5和Ves v 3）等具有同源肽序列［31-33，56］。Api m 12和Ves v 6在蛋白水平上具有大約40%的序列同源性，可能存在共同反應(yīng)的表位，從而在蛋白水平上具有交叉反應(yīng)性。Blank等［46］從對(duì)HBV或YJV皮內(nèi)皮膚試驗(yàn)陰性的患者血清中檢測(cè)了sIgE對(duì)Api m 12和Ves v 6的反應(yīng)性，三種血清對(duì)Api m 12和Ves v 6均顯示sIgE陽(yáng)性，這表明在蛋白質(zhì)水平上存在分子交叉反應(yīng)，或至少證明在CCD之外還存在共敏作用［57］。

3.2 全毒素提取物的局限性

蜂毒過(guò)敏患者使用全毒素提取物制劑進(jìn)行檢測(cè)，其結(jié)果有很大的局限性。蜂毒全毒素中包含許多致敏成分，大量試驗(yàn)表明，全蜂毒制劑中特定變應(yīng)原的低豐度可能會(huì)使檢測(cè)人員錯(cuò)過(guò)真正的致敏因素，檢測(cè)結(jié)果呈現(xiàn)假陰性，使用主要變應(yīng)原成分對(duì)患者進(jìn)行檢測(cè)，就會(huì)得到真實(shí)的結(jié)果［58-60］。因此，使用全毒素制劑對(duì)毒素免疫治療方案的制訂可能會(huì)形成阻礙，而且在制作全毒素蜂毒制劑時(shí)，由于處理方式的差異，部分不穩(wěn)定變應(yīng)原可能會(huì)降解，這也會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成影響。

4 現(xiàn)有蜂毒過(guò)敏的臨床診斷方法及原理

4.1 現(xiàn)有蜂毒過(guò)敏的臨床診斷方法

蜂毒過(guò)敏的常規(guī)診斷是基于過(guò)敏性蜇刺反應(yīng)（由患者確定），陽(yáng)性的皮膚試驗(yàn)和/或sIgE的檢測(cè)。由于國(guó)內(nèi)尚無(wú)蜂毒相關(guān)體內(nèi)診斷試劑，故相關(guān)研究多采用sIgE檢測(cè)的方法評(píng)估蜜蜂蜂毒致敏狀況。隨著分子生物學(xué)和重組變應(yīng)原技術(shù)的發(fā)展，CRD有助于蜂毒過(guò)敏的診斷，提高了真正區(qū)分多重致敏性和交叉反應(yīng)性的能力。針對(duì)蜂毒的sIgE檢測(cè)常用試劑為重組的主要致敏蛋白，且這些致敏蛋白大多由桿狀病毒-昆蟲(chóng)細(xì)胞系統(tǒng)表達(dá)生成的，相較于原來(lái)的全毒素提取物制劑，重組試劑大大提高了診斷的準(zhǔn)確性和直觀性。

當(dāng)常規(guī)診斷方法都不能檢測(cè)出對(duì)蜂毒的過(guò)敏時(shí)，且患者有確切過(guò)敏反應(yīng)史，臨床醫(yī)師可建議進(jìn)行嗜堿性粒細(xì)胞激活試驗(yàn)［61］。Peternelj等［62］發(fā)現(xiàn)，在蜂毒過(guò)敏的診斷中，嗜堿性粒細(xì)胞激活試驗(yàn)的臨床敏感性高于皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)和sIgE的檢測(cè)。有報(bào)道稱，在某些患者中，嗜堿性粒細(xì)胞激活試驗(yàn)也可出現(xiàn)由CCD引起的假陽(yáng)性結(jié)果，且嗜堿性粒細(xì)胞激活試驗(yàn)是昂貴的、耗時(shí)的，因此很少用于臨床常規(guī)檢測(cè)［63］。

4.2 重組方法制備檢測(cè)試劑的必要性

重組主要變應(yīng)原方法可用于評(píng)估蜂毒化合物的致敏性和臨床相關(guān)性，且由于重組蛋白適當(dāng)折疊和正確翻譯后修飾是建立構(gòu)象表位的基礎(chǔ)，因此，重組致敏蛋白不僅可用來(lái)建立安全、有效的診斷方式，而且可制備準(zhǔn)確安全的脫敏原（治療方案所需的）［64］。昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的產(chǎn)物因沒(méi)有CCD的存在，可提供更為準(zhǔn)確的診斷依據(jù)，因此也常用來(lái)檢測(cè)變應(yīng)原的sIgE反應(yīng)性。

相較于傳統(tǒng)的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，昆蟲(chóng)表達(dá)系統(tǒng)用于制備重組蜜蜂蜂毒的主要變應(yīng)原更具優(yōu)勢(shì)，表現(xiàn)為以下兩方面：（1）表達(dá)量高，昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的晚期基因表達(dá)是在病毒粒子形成之后，有利于細(xì)胞毒性蛋白的表達(dá)。（2）大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的產(chǎn)物表達(dá)形式為包涵體，需復(fù)性處理才能有活性，且表達(dá)產(chǎn)物活性較低，因此用大腸桿菌有很大的局限性；而昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)具有識(shí)別信號(hào)肽，可對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行正確切割，而桿狀病毒在真核細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制，保證產(chǎn)物具有后加工作用，有利于蛋白具有活性，避免形成包涵體。

重組不同蜂毒制劑大大提高了診斷的可用性，如Api m 3和Api m 10雖然存在于天然HBV中，但因其低豐度，在用于HBV免疫治療的制劑中缺失或代表性不足。使用重組蜂毒組分試劑對(duì)蜂毒過(guò)敏的診斷和治療都會(huì)提供更準(zhǔn)確的方向。

隨著CRD的發(fā)展，重組蜂毒變應(yīng)原后所獲得的主要致敏蛋白組分，將會(huì)為臨床準(zhǔn)確的sIgE免疫測(cè)定和安全有效的免疫治療提供物質(zhì)基礎(chǔ)［66］。但值得注意的是，目前只有有限數(shù)量的蜂毒變應(yīng)原可作為重組致敏蛋白［66-67］。

HBV過(guò)敏是膜翅目毒素過(guò)敏的第二種最常見(jiàn)形式，特別是在兒童、養(yǎng)蜂人及其親屬以及其他被蜇傷風(fēng)險(xiǎn)較高的個(gè)體中觀察到［68］。HBV過(guò)敏是由毒素中存在的蛋白質(zhì)變應(yīng)原成分sIgE抗體介導(dǎo)的。HBV的蛋白質(zhì)組成非常復(fù)雜，至少有113種鑒定的蛋白質(zhì)和肽［69］。目前，12種不同的HBV蛋白已被確認(rèn)為變應(yīng)原，但我國(guó)這方面研究還很少，因此針對(duì)我國(guó)HBV過(guò)敏人群應(yīng)確立符合我國(guó)人群的HBV主要致敏蛋白，并制備出重組致敏蛋白和研發(fā)出相應(yīng)的診斷工具，以便后續(xù)輔助臨床診斷和HBV免疫治療。

4.3 國(guó)內(nèi)外現(xiàn)有針對(duì)蜜蜂蜂毒過(guò)敏主要致敏蛋白的重組方案

桿狀病毒-昆蟲(chóng)表達(dá)系統(tǒng)是目前蜜蜂蜂毒主要致敏蛋白制備應(yīng)用最為廣泛的重組系統(tǒng)。其制備方案流程普遍為重組桿狀病毒質(zhì)粒的構(gòu)建、重組桿狀病毒的獲得、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞及鑒定和蛋白的純化與收集。對(duì)所獲病毒鑒定常用PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢查，對(duì)所獲目的蛋白常用SDS-PAGE和Western blot對(duì)其進(jìn)行鑒定。重組系統(tǒng)獲得蜂毒蛋白流程相對(duì)于蜂毒中天然提取變應(yīng)原更為簡(jiǎn)單，且更具經(jīng)濟(jì)效益。以下介紹國(guó)內(nèi)外幾種蜂毒致敏蛋白的重組方案：

磷脂酶A 2（含Api m 1）：Api m 1是HBV中的主要變應(yīng)原成分，占HBV干重的12%～15%［70］。沈立榮［71］分別用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)和桿狀病毒-昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)制備Api m 1，結(jié)果顯示桿狀病毒-昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)出的Api m 1具有更高的表達(dá)量和活性，該研究所選用的昆蟲(chóng)細(xì)胞系為T(mén)n-5B1-4（即High Five細(xì)胞），與草地貪夜蛾細(xì)胞Sf21等相比，具有細(xì)胞體積大、感染能力高、表達(dá)量高等優(yōu)點(diǎn)，更具生產(chǎn)意義和研究?jī)r(jià)值。

酸性磷酸酶（含Api m 3）：Api m 3也是HBV過(guò)敏的標(biāo)志變應(yīng)原，Grunwald等［72］報(bào)道了意蜂毒腺Api m3蛋白cDNA的克隆構(gòu)建及其在真核昆蟲(chóng)細(xì)胞中的全長(zhǎng)表達(dá)。為了構(gòu)建具有更高表達(dá)率的昆蟲(chóng)表達(dá)載體，在載體加入分泌重組蛋白的蜂毒蛋白信號(hào)序列，并優(yōu)化Kozak序列，所用的細(xì)胞系同為High Five細(xì)胞。有研究采用酶聯(lián)免疫分析法測(cè)定蜜蜂蜂毒致敏患者血清sIgE抗體與重組Api m3的免疫反應(yīng)性，并用天然的Api m 1 作為對(duì)照，研究者發(fā)現(xiàn)有1例患者在蜂毒血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示陰性，但在用重組Api m 3酶聯(lián)免疫分析法測(cè)定結(jié)果明顯陽(yáng)性，這也證實(shí)了Api m 3在蜂毒中的低豐度可能是造成漏診真正的原因［72］。

二肽基肽酶（含HBV中的Api m 5和YJV中的Ves v 3）：Api m 5是HBV的主要過(guò)敏原成分，Ves v 3是YJV的變應(yīng)原成分。Blank等［46］研究顯示Api m 5和Ves v 3為同源物，是蜂毒過(guò)敏的主要變應(yīng)原。Spodoptera frugiperda（以下簡(jiǎn)稱Sf9）昆蟲(chóng)細(xì)胞與High Five細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)相比，表現(xiàn)出顯著降低的a-1，3核心巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性，Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞產(chǎn)物沒(méi)有被免疫檢測(cè)出CCD［73-75］。

Icarapin variant 2（含Api m 10）：Api m 10也是HBV過(guò)敏的主要變應(yīng)原，在大約50%的HBV過(guò)敏患者中可以表現(xiàn)出sIgE反應(yīng)性，且不存在CCD，因此Api m 10可能成為膜翅目蜂毒過(guò)敏的CRD和改進(jìn)免疫治療方法的關(guān)鍵元素［76-77］。HBV過(guò)敏的成分解析致敏特征表明，在HBV免疫治療中，Api m 10對(duì)sIgE致敏是治療失敗的危險(xiǎn)因素。在對(duì)Api m 1、Api m 2、Api m 3和Api m 5的過(guò)敏有應(yīng)答者和無(wú)應(yīng)答者之間，sIgE水平?jīng)]有觀察到差異。相反，在無(wú)反應(yīng)者中，Api m 10的sIgE中度但顯著升高。Api m 10是HBV致敏的最佳鑒別變應(yīng)原（特異性95%，敏感性25%），并且脫敏治療失敗的優(yōu)勢(shì)比為8.444（P=0.0013）。一些（但不是所有）脫敏治療HBV制劑顯示有Api m 10缺失［78］。VIT誘導(dǎo)結(jié)果顯示，只有在接受HBV治療和可檢測(cè)到Api m 10的過(guò)敏有應(yīng)答的患者中，才觀察到顯著的sIgG4［78］。

Blank等［79］比較分析了不同糖基化Api m 10蛋白的sIgE反應(yīng)性和嗜堿性粒細(xì)胞活化數(shù)據(jù)，確定了糖基化Api m 10蛋白在HBV中主要變應(yīng)原的地位。Seismann等［80］設(shè)計(jì)了3種重組體系（大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)和High Five昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)）制備Api m 10，研究者檢測(cè)3種Api m 10產(chǎn)物的反應(yīng)性，結(jié)果表明，僅有High Five細(xì)胞的Api m 10產(chǎn)物在自體真核表達(dá)下產(chǎn)生明顯CCD的交叉反應(yīng)性，這些數(shù)據(jù)表明，重組的宿主決定了糖基化狀態(tài)，從而影響了變應(yīng)原的特征。與之前采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)制備重組蛋白報(bào)道不同的是，有研究對(duì)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行了優(yōu)化，利用真核桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)或幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合的策略，在大腸桿菌中進(jìn)行自催化蛋白介導(dǎo)的裂解，獲得了可溶性重組Api m10［77］。同時(shí)，也有研究使用Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞系構(gòu)建重組系統(tǒng)，以避免在自體真核表達(dá)下產(chǎn)生CCD從而影響結(jié)果［60］。

5 蜂毒過(guò)敏臨床診斷

毒素過(guò)敏診斷是臨床醫(yī)師通過(guò)檢測(cè)sIgE抗體發(fā)現(xiàn)單個(gè)或多種致敏毒素成分后做出綜合分析結(jié)論?，F(xiàn)已鑒定的蜂類(lèi)變應(yīng)原也可作為重組抗原用于CRD，識(shí)別CRD對(duì)特定分子靶點(diǎn)的sIgE反應(yīng)有助于通過(guò)區(qū)分物種、鑒定多重陽(yáng)性或同源交叉反應(yīng)來(lái)微調(diào)診斷，最終進(jìn)行準(zhǔn)確的診斷，這樣有利于臨床醫(yī)師制訂包括毒素免疫療法在內(nèi)的有效治療方案［81］。

對(duì)蜂毒過(guò)敏患者進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，sIgE檢測(cè)有助于醫(yī)生準(zhǔn)確地對(duì)引起過(guò)敏的毒素成分進(jìn)行診斷，并提高治療決策。CRD一方面提高了sIgE檢測(cè)的敏感性，增強(qiáng)了其區(qū)分致敏和交叉反應(yīng)的能力，準(zhǔn)確識(shí)別患者的致敏變應(yīng)原，有助于避免不必要或無(wú)效的治療，還可以避免新的致敏變應(yīng)原，最大限度地減少不良反應(yīng)，并降低治療成本［82］。

6 HBV變應(yīng)原

最常見(jiàn)的HBV變應(yīng)原是Api m 1，Api m 2和Api m 4，在蜜蜂全毒素中的含量高。不常見(jiàn)的變應(yīng)原有Api m 3、Api m 5、Api m 10和Api m 11［83］。蜂毒制劑如花粉或螨蟲(chóng)提取物等變應(yīng)原提取物一樣，由于處理方式的差異，部分不穩(wěn)定變應(yīng)原會(huì)降解，且某些具有代表性的特定變應(yīng)原含量較低，影響了診斷準(zhǔn)確性和一致性。

除去傳統(tǒng)常見(jiàn)的HBV變應(yīng)原，目前國(guó)外常用主要變應(yīng)原組分還有很多，但由于地域不同和樣本的差異，在國(guó)內(nèi)可能會(huì)得到不同的數(shù)據(jù)。針對(duì)中國(guó)蜂毒過(guò)敏人群典型的變應(yīng)原，進(jìn)行變態(tài)反應(yīng)成分分辨診斷技術(shù)方面的研究，設(shè)計(jì)出一款全新準(zhǔn)確且便捷的診斷工具，將可能成為針對(duì)中國(guó)蜂毒過(guò)敏人群診斷領(lǐng)域的一個(gè)全新突破。

7 總結(jié)和展望

由于我國(guó)是世界第一蜜蜂養(yǎng)殖群擁有國(guó)，國(guó)內(nèi)養(yǎng)蜂從業(yè)人員基數(shù)巨大，因此，蜜蜂蜂毒過(guò)敏不容忽視，但是我國(guó)現(xiàn)有的HBV診斷方式單一，僅使用血清體外診斷技術(shù)。由于天然蜂毒試劑中蜂毒組分的缺失或者低豐度的影響，可能會(huì)造成檢測(cè)結(jié)果的假陰性；天然蜂毒試劑中蜂毒組分之間的同源性和CCD的存在，亦可以造成檢測(cè)結(jié)果的假陽(yáng)性，但蜂毒重組試劑規(guī)避了天然蜂毒的局限性，往往能為醫(yī)師提供更為準(zhǔn)確的診斷結(jié)果。因此，本文總結(jié)了目前國(guó)內(nèi)外現(xiàn)有的幾種典型蜜蜂蜂毒重組變應(yīng)原的制備方案，可為重組試劑制備提供理論基礎(chǔ)，有利于研究者開(kāi)發(fā)全新準(zhǔn)確便捷的檢測(cè)手段和安全可靠的診斷方案。隨著CRD的發(fā)展，sIgE檢測(cè)有助于醫(yī)生準(zhǔn)確地對(duì)引起過(guò)敏的毒素成分進(jìn)行診斷，并提高治療決策，還可以使患者避免新的致敏，最大限度地減少不良反應(yīng)，并降低治療成本。因此，可通過(guò)大規(guī)模收集臨床病例，確定中國(guó)人群中意大利HBV中常見(jiàn)的過(guò)敏原組分，構(gòu)建并制備HBV變應(yīng)原組分重組蛋白，為將來(lái)的HBV過(guò)敏患者提供全新的檢測(cè)方案，也將為未來(lái)我國(guó)蜂毒毒素免疫療法奠定基礎(chǔ)。在將來(lái)，我們預(yù)期將防治關(guān)口提前，由治已病到治未病，盡可能避免HBV過(guò)敏人群的嚴(yán)重過(guò)敏反應(yīng)的發(fā)生，保障廣大人民群眾生命安全。

利益沖突 所有作者聲明無(wú)利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明 趙慧敏：研究思路的提出，文獻(xiàn)檢索和文章撰寫(xiě)；李俊達(dá)、崔樂(lè)：文獻(xiàn)篩選，資料的提取和整理；關(guān)凱：論文的修訂、質(zhì)量控制和審查，并同意対研究工作誠(chéng)信負(fù)責(zé)

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2023-07-20）