【摘 要】目的：觀察姜黃素對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-116細(xì)胞增殖和凋亡的影響以及對(duì)細(xì)胞線粒體形態(tài)和功能的改變，并探討其可能的機(jī)制。方法：體外培養(yǎng)結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-116，給與不同濃度的姜黃素（5、10、20、30 μmol/L）處理，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒CCK-8觀察細(xì)胞增殖的變化并篩選出最佳作用濃度。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡的改變。線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒JC-1檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位的變化。電鏡和Mito Tracker Deep Red染色觀察細(xì)胞內(nèi)線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。三磷酸腺苷（adenosinetriphosphate，ATP）和活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞ATP和ROS的變化。分光光度計(jì)檢測(cè)與凋亡密切相關(guān)的casppase-3和caspase-9活性變化。最后，Western blot檢測(cè)結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)caspase-3和caspase-9蛋白水平的變化。結(jié)果：姜黃素處理細(xì)胞株HCT-116細(xì)胞后，細(xì)胞的增殖水平受到抑制，且呈濃度-時(shí)間依賴性，其半數(shù)最大抑制濃度（half maxi?mal inhibitory concentration，IC50）為13 μmol/L。姜黃素不僅增加早期凋亡的結(jié)腸癌細(xì)胞的比例，還使細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位水平下降，且呈濃度依賴性。電鏡結(jié)果顯示姜黃素處理后，細(xì)胞內(nèi)線粒體出現(xiàn)明顯的線粒體腫脹，線粒體嵴腫脹、消失、膜破裂和空泡等。Mito Tracker Deep Red染色后顯示線粒體數(shù)量減少且呈碎片狀。細(xì)胞內(nèi)的ATP生產(chǎn)明顯下降。另外，姜黃素還增加細(xì)胞內(nèi)caspase-3和caspase-9酶活性和蛋白水平的表達(dá)。結(jié)論：姜黃素抑制結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，其機(jī)制與姜黃素加重線粒體形態(tài)和功能的損傷有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】HCT-116細(xì)胞株；姜黃素；凋亡；線粒體

【中圖分類號(hào)】R363.2 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A 【收稿日期】2023-11-27

結(jié)直腸癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其侵襲、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是導(dǎo)致患者死亡的主要原因。盡管隨著醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，結(jié)直腸癌的診療方式有很大的改進(jìn)，預(yù)后也有明顯提高，但遠(yuǎn)未達(dá)到令人滿意的地步。因此，探索結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制以及尋找并開發(fā)新的藥物或治療方案對(duì)提高結(jié)直腸癌的治愈率有重要意義[1]。

線粒體是一種擁有雙層膜、動(dòng)態(tài)的、半自主性細(xì)胞器，由外膜、膜間隙和內(nèi)膜組成，通過融合和分裂2種方式來維持其結(jié)構(gòu)完整性，以發(fā)揮其生物學(xué)功能。線粒體不僅是體內(nèi)的“能量工廠”，可通過氧化磷酸化產(chǎn)生ATP，提供生命活動(dòng)所需要的能量。還參與體內(nèi)的細(xì)胞增殖、凋亡、自噬、氧化應(yīng)激等多種生理活動(dòng)。因此，線粒體正常的結(jié)構(gòu)和功能對(duì)維持機(jī)體的多種生命活動(dòng)至關(guān)重要[2]。大量研究表明，線粒體參與調(diào)控多種病理生理過程，如：細(xì)胞的存活、增殖、遷移與侵襲，而這些恰恰是腫瘤細(xì)胞所表現(xiàn)出來的惡性特征：無限增殖、代謝異常、易轉(zhuǎn)移和侵襲等。因此，腫瘤的發(fā)生發(fā)展與線粒體的功能異常密切相關(guān)[3-4]，改善線粒體的功能對(duì)腫瘤的治療有重要的意義。

姜黃素是從姜黃等姜科、天南星科類植物的根莖中提取的一種脂溶性多酚類化合物，具有抗炎[5]、抗氧化[6]、抑制神經(jīng)元退行性變性[7]等多種特性。大量研究已經(jīng)證實(shí)姜黃素具有抗腫瘤特性，不僅對(duì)包括結(jié)直腸癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤有明顯的抑制作用[8-9]，還表現(xiàn)出很好的安全性，本身無明顯毒副作用，還能減輕一些常規(guī)的化療藥物的毒副作用[10-11]。姜黃素抑制腫瘤的機(jī)制不清，多涉及作用于不同的靶點(diǎn)，如黏附分子、轉(zhuǎn)錄因子、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子、細(xì)胞信號(hào)分子和血管生成調(diào)節(jié)因子等[12-13]。本研究以結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-116 為研究對(duì)象，給與姜黃素處理，觀察姜黃素對(duì)該細(xì)胞增殖、凋亡以及腫瘤細(xì)胞內(nèi)線粒體的形態(tài)和功能的影響，并探討其發(fā)揮作用的機(jī)制，為治療結(jié)腸癌提供新的思路和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-116細(xì)胞購(gòu)自尚恩生物公司，高糖培養(yǎng)基（dulbecco’s modified eagle medium，DMEM）、胎牛血清、青霉素/鏈霉素、二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）、SDS-PAGE試劑盒、線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒JC-1等購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。姜黃素來自Sigma 公司。BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒、ATP檢測(cè)試劑盒等購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；CCK-8、caspase-3 和caspase-9 酶活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自凱基公司?？贵wcaspase-3、caspase-9和內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydroge?nase，GAPDH）購(gòu)自博士德生物公司；電化學(xué)發(fā)光（electrochemi-luminescence，ECL）試劑盒購(gòu)自美國(guó)Bio-rad 公司。Mito Tracker Deep Red購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 研究方法

1.2.1 姜黃素溶液配置和處理 稱取100 mg 姜黃素，以DMSO 溶解，并加入三蒸水使其濃度為1.0 mmol/L，過濾后-20 ℃保存。藥物處理時(shí)，將姜黃素母液（1.0 mmol/L）分別加入4 mL培養(yǎng)液中，使得白藜蘆醇的工作液濃度分別為5、10、20、30 μmol/L。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將凍存的HCT116細(xì)胞放置于37 ℃水浴鍋中，待完全溶解后移至10 mL離心管中，離心1 000 r/min×5 min，棄上清，加入DMEM培養(yǎng)液（含血清、青鏈霉素），充分混勻后，移至25 cm2的培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，待完全貼壁生長(zhǎng)后，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 CCK-8 將HCT-116 細(xì)胞按每孔5 000 個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，置37 ℃、5% CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用不同濃度（5、10、20、30 μmol/L）姜黃素處理，作用1、2和3 d，并設(shè)空白對(duì)照組和溶劑對(duì)照組即DMSO組（濃度為0.1%），每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。每孔加入20 μL的CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)1 h，用酶標(biāo)儀上檢測(cè)其450 nm處的吸光度（absorbance，A）值，并按下列公式計(jì)算白藜蘆醇對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖率的影響：結(jié)腸癌細(xì)胞增殖率（％）=試驗(yàn)組A450 nm/空白對(duì)照組A450 nm×100％。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù) 將結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞按每孔4×105個(gè)接種于24孔板中。姜黃素處理后，收集每組細(xì)胞懸液至無菌EP管中；離心800 r/min×5 min，去上清，加入磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）重懸細(xì)胞，再次離心棄上清；加入5 mL的70%乙醇，固定，4 ℃過夜；次日，將固定好的細(xì)胞離心1 000 r/min×5 min，棄上清后加入PBS重懸細(xì)胞；加入5 μL RNaseA 37 ℃消化1 h，加入終濃度為50 mg/mL碘化丙啶4 ℃避光染色過夜，在流式細(xì)胞儀上分析。

1.2.5 JC-1法 采用流式細(xì)胞法。將結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞接種于24孔板中，密度為5×105個(gè)/孔。姜黃素處理后，收集每組細(xì)胞懸液至無菌EP管中；離心400 g×5 min，洗掉上清；用0.5 mL JC-1工作液懸浮細(xì)胞，于37 ℃、5%CO2 培養(yǎng)箱孵育15～30 min；離心400 g×5 min，洗掉上清；用2 mL細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，離心400 g×5 min，吸掉上清；再次用2 mL細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，離心400 g×5 min，吸掉上清；用0.5 mL新鮮培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，即可進(jìn)行后續(xù)的流式分析。

1.2.6 Mito Tracker Deep Red 染色 配置Mito-Tracker Red工作液，并避光保存。將貼壁的HCT-116細(xì)胞接種于培養(yǎng)板中，姜黃素處理后加入Mito-Tracker Red工作液，37 ℃孵育15～30 min；去除Mito-Tracker Red工作液，加入37 ℃預(yù)溫育的新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液；然后用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.2.7 電鏡檢測(cè) 待姜黃素處理HCT116細(xì)胞后，收集各組細(xì)胞，離心1 000 r/min×5 min，棄上清，加入PBS重懸細(xì)胞，吹打混勻后再次離心，如此反復(fù)3次。最后一次離心完畢，棄上清，加入戊二醛1 mL，于4 ℃冰箱中固定30 min，送電鏡室進(jìn)行固定、脫水、包埋、切片以及染色。

1.2.8 ATP 含量檢測(cè) 采用ATP 檢測(cè)試劑盒，簡(jiǎn)單步驟如下：準(zhǔn)備，試劑、樣品和標(biāo)準(zhǔn)品制備。加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上加樣標(biāo)準(zhǔn)品50 mL，待測(cè)樣品孔中加樣品稀釋液40 mL和待測(cè)樣品10 mL（樣品最終稀釋度為5倍）輕輕晃動(dòng)混勻。溫育：用封板膜封板后置37 ℃溫育30 min。洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50 mL，空白孔除外；再次孵育和洗滌后顯色。顯色：每孔先加入顯色劑A50 mL，再加入顯色劑B50 mL，輕輕震蕩混勻，37 ℃避光顯色15 min。終止：每孔加終止液50 mL，終止反應(yīng)并進(jìn)行測(cè)定：450 nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的A值。

1.2.9 Caspase3和 caspase9的活性檢測(cè) 收集姜黃素處理后的各組HCT-116 細(xì)胞后，用PBS 洗滌細(xì)胞2 次（離心2 000 r/min×5 min），收集（3～5）×106個(gè)細(xì)胞；在沉淀的細(xì)胞中加入200 μL冰冷Lysis Buffer吹打均勻；置冰上裂解20 min，渦旋振蕩4次，每次10 s；4 ℃離心10 000 r/min×1 min；小心吸取上清，轉(zhuǎn)移至新的管中，并放置冰上待用；測(cè)定其中的蛋白濃度；吸取 50 μL 含100～200 μg 蛋白的細(xì)胞樣品加入50 μL的2×Reaction Buffer，再加入5 μL Caspase-3 Substrate，充分混勻后于37 ℃避光孵育4 h；酶標(biāo)儀在λ=405 nm測(cè)定其A值。通過計(jì)算ARes/A對(duì)照的倍數(shù)來確定其活性的大小變化。Caspase-9方法同caspase-3。

1.2.10 Western blot 收集各組細(xì)胞，加入1 mL 蛋白裂解液，充分裂解后于4 ℃，13 000 r/min×15 min 離心后，用Bradford法測(cè)定每組蛋白樣品濃度并分裝保存。配置8%～10%的Page膠，上樣40 μg經(jīng)SDS-PAGE電泳，將蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，然后置入TBST稀釋的抗體caspase-3、caspase-9和GAPDH，4 ℃孵育過夜；充分洗滌后加入1∶5 000的HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗，室溫孵育2 h，最后用ECL 發(fā)光試劑盒行曝光顯影，經(jīng)Bio-radChemical Dox XRS凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行條帶的分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有計(jì)量資料均采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。多組間均數(shù)比較采用單因素或重復(fù)測(cè)量方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 姜黃素抑制HCT-116細(xì)胞的增殖

溶劑DMSO 組和5、10、20、30 μmol/L 的姜黃素處理HCT-116 細(xì)胞1 d 后的增殖率分別為：（100.00±14.22）%、（99.92±5.00）%、（72.44±3.42）%、（55.28±6.23）%和（39.14±8.53）%；作用2 d 后的增殖率分別為：（100.00±6.93）%、（103.02±5.51）%、（62.14±5.54）%、（6.60±1.56）%和（6.77±1.07）%；3 d后的增殖率分別為：（100.00±16.54）%、（99.16±8.82）%、（53.52±7.36）%、（3.45±1.44）%和（1.30±1.01）%。經(jīng)多因素重復(fù)測(cè)量方差分析結(jié)果顯示增殖率與時(shí)間相關(guān)（F=414.884，Plt;0.001），而時(shí)間與濃度存在交互作用（F=16.545，Plt;0.001），表明增殖率呈明顯的時(shí)間-濃度依賴性。進(jìn)一步兩兩比較，與DMSO處理組比較，5 μmol/L姜黃素處理后，HCT-116細(xì)胞的增殖率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.133），當(dāng)濃度增加至10 μmol/L和20 μmol/L時(shí)，細(xì)胞的增殖率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.001 和Plt;0.001）；與濃度10 μmol/L 比較，20 μmol/L的姜黃素處理后，細(xì)胞的增殖率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.001）（圖1）。

2.2 姜黃素促進(jìn)了HCT-116細(xì)胞的凋亡

由圖2結(jié)果顯示，溶劑DMSO組和5、10、20 μmol/L的姜黃素處理后凋亡早期細(xì)胞比例分別為：（5.75±0.26）%、（6.68±0.47）%、（49.40±1.63）%和（79.08±0.54）%，4 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=6 286.761，Plt;0.001）。進(jìn)一步兩兩比較：與DMSO處理組比較，當(dāng)姜黃素濃度為5 μmol/L時(shí)，細(xì)胞的凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.170）；當(dāng)濃度增加至10 μmol/L和20 μmol/L時(shí)，細(xì)胞凋亡率明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.001、Plt;0.001）；與10 μmol/L比較，20 μmol/L的結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡率明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.001）。

2.3 姜黃素加重了HCT-116細(xì)胞線粒體形態(tài)

為了更好地觀察線粒體形態(tài)的改變，本研究采用了Mito Tracker Deep Red 染色和電鏡分析法。如圖3所示，在DMSO處理HCT-116細(xì)胞后，細(xì)胞的線粒體的數(shù)量較多，呈現(xiàn)管狀或長(zhǎng)條狀；當(dāng)濃度為5 μmol/L時(shí)，線粒體的形態(tài)無明顯改變；當(dāng)濃度為10 μmol/L和20 μmol/L時(shí)，線粒體的數(shù)量減少，質(zhì)量明顯減輕，呈小碎片狀。

電鏡結(jié)果顯示，在DMSO處理組和5 μmol/L姜黃素處理HCT-116細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)量多，形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，無腫脹等現(xiàn)象。當(dāng)姜黃素濃度增加至10 μmol/L后，細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)量有減少，且出現(xiàn)明顯的線粒體腫脹，線粒體嵴腫脹、消失、膜破裂和空泡等，這些現(xiàn)象隨著濃度的增加更加明顯（圖4）。

2.4 姜黃素降低HCT-116細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位

JC-1是一種陽(yáng)離子脂質(zhì)熒光染料，有單體和多聚體2種形式。單體可通過流式細(xì)胞儀的FL-1通道檢測(cè)呈綠色熒光；而多體則通過FL-2通道檢測(cè)呈紅色熒光。當(dāng)線粒體膜電位降低時(shí)，線粒體膜電位被去極化，JC-1從線粒體內(nèi)釋放，紅光強(qiáng)度減弱，主要以單體的形式存在于胞質(zhì)內(nèi)發(fā)綠色熒光。因此，根據(jù)這一特征檢測(cè)線粒體膜電位的變化，以顯示細(xì)胞的凋亡水平變化。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，溶劑DMSO組和5、10、20 μmol/L 的姜黃素處理后膜電位分別為：（67.12±1.86）%、（64.91±2.23）%、（24.62±2.02）%和（20.11±1.98）%，4組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=622.850，Plt;0.001）。進(jìn)一步兩兩比較：與DMSO處理組比較，當(dāng)姜黃素濃度為5 μmol/L時(shí)，細(xì)胞的膜電位差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.149）；當(dāng)濃度增加至10 μmol/L 和20 μmol/L 時(shí)，細(xì)胞凋亡率明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.001和Plt;0.001）；與10 μmol/L比較，20 μmol/L的結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡率顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.008）（圖5）。

2.5 姜黃素減少了HCT-116細(xì)胞內(nèi)ATP的生成

溶劑DMSO 組和5、10、20 μmol/L 的ATP 含量分別為：（4.02±0.21） IU/mL、（3.66±0.37） IU/mL、（2.53±0.26） IU/mL和（1.63±0.06） IU/mL，4 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=74.469，Plt;0.001）。進(jìn)一步兩兩比較：與DMSO處理組比較，當(dāng)姜黃素濃度為5 μmol/L時(shí)，結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的ATP含量無明顯增加，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.062）；當(dāng)濃度增加至10 μmol/L 和20 μmol/L 時(shí)，結(jié)腸癌細(xì)胞產(chǎn)生的ATP 明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.001 和Plt;0.001）；與10 μmol/L比較，20 μmol/L的結(jié)腸癌細(xì)胞產(chǎn)生的ATP明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.001）（圖6）。

2.6 姜黃素增加了HCT-116細(xì)胞內(nèi)caspase-3和caspase-9的酶活性和蛋白的表達(dá)

如圖7，溶劑DMSO組和5、10、20 μmol/L 的caspase-3酶活性和caspase-9酶活性的相對(duì)值分別為：2.75±0.23、2.55±0.19、5.05±0.15 和5.33±0.99 以及2.30±0.15、2.12±0.16、4.85±0.16 和5.21±0.12，4 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F1=503.553，P1lt;0.001；F2=1 389.342，P2lt;0.001）。進(jìn)一步兩兩比較：與DMSO處理組比較，當(dāng)姜黃素濃度為5 μmol/L時(shí)，結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)caspase-3 酶活性和caspase-9 酶活性沒有明顯改變，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P1=0.135、P2=0.102）；當(dāng)濃度增加至10 μmol/L 時(shí)，caspase-3 酶活性和caspase-9 酶活性明顯增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P1lt;0.001、P2lt;0.001）；與10 μmol/L比較，20 μmol/L 的caspase-3 酶活性和caspase-9 酶活性明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P1=0.044、P2=0.004）。

如圖8，溶劑DMSO組和5、20、40 μmol/L的caspase-3和caspase-9 蛋白表達(dá)的相對(duì)值分別為：（39.07±1.16）%、（41.10±1.56）%、（88.71±1.83）%、（91.78±1.60）%和（44.26±2.44）%、（45.70±2.19）%、（71.26±2.33）%、（81.52±3.11）%，4 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F1=1 389.342，P1lt;0.001；F2=257.085，P2lt;0.001）。進(jìn)一步兩兩比較：與DMSO 處理組比較，當(dāng)姜黃素濃度為5 μmol/L時(shí)，結(jié)腸癌細(xì)胞的caspase-3和caspase-9蛋白表達(dá)沒有明顯改變，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P1=0.089、P2=0.056）；當(dāng)濃度增加至10 μmol/L時(shí)，結(jié)腸癌細(xì)胞的蛋白表達(dá)明顯抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P1lt;0.001 和P2lt;0.001）；與10 μmol/L 比較，20 μmol/L 的結(jié)腸癌細(xì)胞蛋白明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P1=0.016、P2lt;0.001）。

3 討論

腫瘤是機(jī)體在各種致瘤因子的作用下，局部組織異常增生所形成的一種新生物，腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多基因、多環(huán)節(jié)、多信號(hào)通路共同參與的、復(fù)雜的生物學(xué)過程。相較于正常的細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞具有無限增殖、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)特征[14]，這就勢(shì)必需要大量的能量、糖類、脂類、蛋白質(zhì)等生物大分子。而線粒體是體內(nèi)重要的細(xì)胞器之一，存在于除紅細(xì)胞以外的所有的真核細(xì)胞中，是細(xì)胞進(jìn)行生物氧化、物質(zhì)代謝和能量代謝的主要場(chǎng)所，在氧自由基的生成、鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)、基因組調(diào)控等過程中也發(fā)揮著重要作用。腫瘤細(xì)胞的線粒體肯定異于正常細(xì)胞的線粒體。本研究結(jié)果表明，在結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞中，線粒體數(shù)量多，體積大（代謝性增大）、呈管狀或長(zhǎng)條狀，細(xì)胞內(nèi)生成的ATP也較多。抵抗細(xì)胞凋亡也是惡性腫瘤細(xì)胞的又一重要的特性。線粒體是細(xì)胞的“自殺性武器存儲(chǔ)庫(kù)”，是凋亡活動(dòng)的調(diào)控中心。在細(xì)胞凋亡的過程中，大部分的凋亡信號(hào)通路都涉及到線粒體形態(tài)和功能的改變。線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑是最為重要的凋亡途徑。研究結(jié)果表明，在HCT-116細(xì)胞中，線粒體膜電位處于較高水平，且與凋亡呈正相關(guān)的酶caspase 3 和caspase 9的活性較低，蛋白表達(dá)也低，這些都符合惡性瘤細(xì)胞因自身增殖、抵抗細(xì)胞凋亡等特性對(duì)細(xì)胞線粒體的需求。因此，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，線粒體形態(tài)和功能異常發(fā)揮重要作用，以線粒體為靶標(biāo)的腫瘤治療的新策略逐漸成為研究的重點(diǎn)、熱點(diǎn)。

姜黃素是一種從姜黃的根莖中提取出來的酚類化合物，在我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中，廣泛被用于驅(qū)蚊、祛風(fēng)活血、痛經(jīng)止痛等，具有良好的醫(yī)療保健效果。而在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中，姜黃素具有多種生物學(xué)活性，如抗炎[5]、改善阿爾茨海默病的認(rèn)知障礙[7]等，且價(jià)格低廉，容易獲取，在臨床上有極佳的應(yīng)用前景。隨著姜黃素的研究不斷的深入，其相關(guān)的毒性報(bào)道也逐漸增多。姜黃素?cái)z入增多不僅對(duì)正常組織細(xì)胞的毒性作用外，甚至還可能引起繼發(fā)腫瘤、肝腎毒性以及骨髓抑制等不良反應(yīng)，這也限制其在臨床上的應(yīng)用[15]。近年來，眾多體外研究發(fā)現(xiàn)姜黃素對(duì)多種惡性腫瘤細(xì)胞有明顯的抑制作用，但也有很多毒性作用，其作用濃度一般都控制在10～100 μmol/L。本研究選定濃度為5、10、20和30 μmol/L的姜黃素作用于結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，當(dāng)姜黃素濃度約13 μmol/L時(shí)，瘤細(xì)胞的增殖抑制率就達(dá)到了50%，且隨著濃度的增加和時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞的增殖都受到明顯的抑制，呈濃度-時(shí)間依賴性，這與以往研究結(jié)果相似[16-17]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素對(duì)HCT-116細(xì)胞的線粒體的形態(tài)呈現(xiàn)明顯的損傷作用：電鏡結(jié)果顯示線粒體的數(shù)量明顯減少，且出現(xiàn)腫脹，線粒體嵴也有腫脹，甚至消失、膜破裂和空泡等；Mito Tracker Deep Red 染色顯示線粒體的數(shù)量變少，質(zhì)量減小，形態(tài)也從條狀或管狀變成碎片狀。隨著線粒體形態(tài)的發(fā)生損傷，其功能也出現(xiàn)異常：細(xì)胞內(nèi)ATP 的生成減少，線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑開始啟動(dòng)，表現(xiàn)為細(xì)胞凋亡明顯增加，線粒體去極化現(xiàn)象加重，膜電位水平顯著降低；caspase-3 和caspase-9的酶活性和蛋白表達(dá)水平都明顯增強(qiáng)。

綜上所述，姜黃素可通過加重結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞中線粒體的形態(tài)和功能的損傷，促進(jìn)線粒體損傷所誘導(dǎo)的凋亡，進(jìn)而抑制癌細(xì)胞的增殖，起到抗瘤作用，這對(duì)深入探討以線粒體為靶標(biāo)的腫瘤治療新策略具有重要的意義。

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（責(zé)任編輯：周一青）